Name: 롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 배우세요 롤리팝 형태 초여과 프로브를 활용한 타액 펩티드 샘플링 방법으로, NanoLC-LTQ 질량분석을 통해 저함량 펩티드를 효과적으로 검출하고 임상 진단에 활용하는 기술입니다.

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이 작품은 건강 보조금의 국립 연구소 (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, 그리고 R21-I58002-01)에 의해 지원되었다. 우리는 원고의 비판적 읽기를 위해 C. Niemeyer 감사드립니다.

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<li>Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+proteins+in+human+salivary+proteome+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+and+two-dimensional+gel+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry.</a> Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).</li>
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<li>Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+monobuffer+multidimensional+chromatography+for+high-throughput+proteome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation.</a> J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).</li>
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<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+sampling+using+capillary+ultrafiltration+semi-permeable+hollow+fiber+and+protein+identification+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics.</a> J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+secreted+proteins+from+wounded+skin+using+capillary+ultrafiltration+probes+and+mass+spectrometric+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics.</a> Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+proteomics+profiles+of+in+vivo+tumor+secretomes%3A+capillary+ultrafiltration+sampling+of+regressive+tumor+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses.</a> Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).</li>
<li>Ahmed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+remove+albumin+for+the+proteomic+analysis+of+low+abundance+biomarkers+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum.</a> Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).</li>
<li>Michishige, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+saliva+collection+method+on+the+concentration+of+protein+components+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva.</a> J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).</li>
<li>Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+with+salivary+17-hydroxyprogesterone+determinations+using+the+Salivette+device%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device.</a> Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).</li>
<li>Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+serum%2Fplasma+profiling+and+biomarker+identification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).</li>
<li>Ramstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+high-abundant+proteins+in+body+fluids+prior+to+liquid+chromatography+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).</li>
<li>Messana, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+salivary+basic+proline-rich+protein+complex+by+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach.</a> J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).</li>
<li>Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+release+of+an+ArgGlyArgProGln+pentapeptide+with+innate+immunity+properties+from+acidic+proline-rich+proteins+by+proteolytic+activity+in+commensal+streptococcus+and+actinomyces+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species.</a> Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).</li>
<li>Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proline-rich+polypeptide+is+a+regulator+of+oxidative+burst+in+human+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimmunomodulation%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes.</a> Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).</li>
<li>Jonsson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gln-Gly+cleavage%3A+correlation+between+collision-induced+dissociation+and+biological+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).</li>
<li>Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+a+segment+of+adsorbed+salivary+acidic+proline-rich+proteins+which+promotes+adhesion+of+Streptococcus+gordonii+to+apatitic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces.</a> Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).</li>
<li>Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+of+Actinomyces+naeslundii+and+Actinomyces+viscosus+exhibit+structurally+variant+fimbrial+subunit+proteins+and+bind+to+different+peptide+motifs+in+salivary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins.</a> Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).</li>
<li>Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+defining+the+human+parotid+gland+salivary+proteome+and+peptidome%3A+identification+and+characterization+using+2D+SDS-PAGE%2C+ultrafiltration%2C+HPLC%2C+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).</li>
<li>Wilmarth, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+liquid+chromatography+study+of+the+human+whole+saliva+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome.</a> J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+amino+acid+sequence+of+a+basic+proline-rich+peptide%2C+P-D%2C+from+human+parotid+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva.</a> J. Biochem. 93, 495-502 (1983).</li>
<li>Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+salivary+mucin+bacterial+aggregating+activity+with+caries+status%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status.</a> Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).</li>
<li>Juarez, Z. E., Stinson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+protease+of+Streptococcus+gordonii+hydrolyzes+type+IV+collagen+and+collagen+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues.</a> Infect Immun. 67, 271-278 (1999).</li>
<li>Lo, C. S., Hughes, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+protease+from+Streptococcus+oralis+C104%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104.</a> Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).</li>
<li>Harrington, D. J., Russell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+two+extracellular+proteases+of+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+secretome+sampling+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">In vivo secretome sampling technology for proteomics.</a> Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).</li>
<li>Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+proline+rich+protein+1+%28PRP-1%29+in+bulk+solution+and+adsorbed+to+a+negatively+charged+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).</li>
<li>Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+of+diatom+frustules%3A+potential+nanostructured+membranes+for+molecular+and+particle+separations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).</li>
<li>Linhares, M. C., Kissinger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+monitoring+in+subcutaneous+tissue+using+in+vivo+capillary+ultrafiltration+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes.</a> Pharm Res. 10, 598-602 (1993).</li>
<li>Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intact+proteins+in+mixtures+by+alternated+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+and+LC+ESI+infrared+multiphoton+dissociation+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).</li>
<li>Whitelegge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Sequence+Polymorphisms+and+Post-translational+Modifications+in+Proteins+from+Human+Saliva+using+Top-Down+Fourier-transform+Ion+Cyclotron+Resonance+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).</li>
<li>Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Streptococcus+mutans+to+salivary+proteins+in+caries-free+and+caries-susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Odontol.+Latinoam%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals.</a> Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).</li>
<li>Challacombe, S. J., Sweet, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+immunity+and+HIV+infection%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal immunity and HIV infection: current status.</a> Oral Dis. 8, 55-62 (2002).</li>
<li>Jensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+acidic+proline-rich+proteins+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 많은 펩타이드 조각은 인간의 소화되지 않은 타액에 존재하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 펩타이드 조각은 프롤린 풍부한 단백질, actin, 알파 아밀라아제, 알파 1 globin, 베타 globin, histain 1, 케라틴 1, mucin 7, 고분자 면역 글로불린 수용체, satherin, S100A9 다양한 형태의 파생 상품입니다. 불확 실한 절단 사이트와 펩티드의 생산에 기여 여러 가지 요인이있을 수 있습니다. 예를 들어, 일부 펩타이드 조각은 인간의 전체 타액에서 자연스럽게 나타날 수 있습니다. C-테르-PQ있는 많은 펩티드는 (표 1과 보충 표 1과 2) 식별되었다. 프롤린 풍부한 단백질은 산성, 기본 또는 glycosylated 단백질로 분류 할 수 있으며, 단일 지역 17에 클러스터된 여섯 유전자에 의해 인코딩됩니다. allelic 편차, 차동 RNA의 접합, proteolytic 처리 및 사후 translational 개조 17 일부터</su...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> Polyethersulfone의 점막 </td><td> 막 공사 </td><td></td><td> 30 kDa MWCO </td></tr><tr><td> 테플론 플루오르 에틸렌 프로필렌 튜브 </td><td> Upchurch 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 블루 dextran </td><td> 시그마 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 나노 LC 시스템 </td><td> Eksigent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C18 트랩 칼럼 </td><td> 애질런트 </td><td> 5065-9913 </td><td></td></tr><tr><td> LTQ 선형 이온 트랩 질량 분석기 </td><td> 써모 피셔 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 마법사 2 </td><td> 현자-N Research </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile-0.1 % 개미의 산성 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9832-03 </td><td> LC / MS 학년 </td></tr><tr><td> 물 0.1 % 개미의 산성 </td><td> JT 베이커 </td><td> 9834-03 </td><td> LC / MS 학년 </td></tr></tbody></table>

롤리팝 - 같은 ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

인간의 타액 프로테옴 및 peptidome가 1-2 공개되어 있지만 그들은 majorly tryptic 타액 단백질의 소화에서 발견되었다. 인간의 타액에있는 원시 펩티드는 질병을 진단하는 질병의 진행을 예측하고, 치료 효능을 모니터링을위한 잠재적인 가치를 제공하기 때문에 외인성 효소와 사전 소화하지 않고 인간의 타액의 토착 peptidome의 확인은 필수적이된다. 적절한 샘플링은 인간 원주민 침이 peptidome의 식별 향상을위한 중요한 단계입니다. 3-4 파편을 제거하는 원심 분리를 포함한 인간의 타액을 샘플링의 전통적인 방법은 너무 시간이 많이 걸리는 임상 사용을위한 적용하는 것입니다. 또한, 원심 분리에 의한 잔해 제거는 감염된 병원균의 대부분을 청소하고 종종 낮은 풍요의 peptidome의 식별을 방해 높은 풍부한 단백질을 제거하지 못할 수 있습니다. 종래의 proteomic 접근법 해당 PRI인 겔 소화와 활용에 marily 활용 2 차원 겔 전기 영동 (2-DE)이 젤 많은 타액 단백질에게 5-6를 식별하는 능력이있다. 그러나,이 접근 방법은 일반적으로 낮은 풍요의 펩티드 / 단백질을 감지할 충분히 구분하지 않습니다. 액체 크로마 토그래피 - 질량 분석계 (LC-MS) 기반 proteomics은 사전 2-DE 분​​리하지 않고 단백질을 식별할 수있는 대안입니다. 이 방법은 높은 감도를 제공하지만, 그것은 일반적으로 사전에 샘플을 미리 분별화 7 어렵게 임상 사용하기 위해 만들어 트립신과 미리 소화 필요합니다. 샘플 준비로 인한 질량 분광법에 지장을 회피하기 위해, 우리는 모세관 ultrafiltration (CUF) 프로브 8-11이라는 기술을 개발했습니다. 저희 연구실에서 데이터 CUF 프로브는 역동적이고 최소한 침략적 태도 8의 동물의 다양한 microenvironments에서 생체내의 단백질을 캡처하는 능력이있다 는걸 증명 -11. 부정적인 압력이 샘플 수집하는 동안 철수 단순히 주사기에 의해 만들어진 이후로 원심 분리가 필요하지 않습니다. LC-MS와 결합 CUF 프로브를 성공적 tryptic - 소화 단백질에게 8-11을 확인했습니다. 본 연구에서는 우리가 쉽게 사람의 구강에 맞을 수있는 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브를 만들어 ultrafiltration 샘플링 기법을 업그레 이드. 트립신의 소화없이 LC-MS에 의한 직접적인 분석은 indigenously 인간 타액은 다양한 단백질에서 파생된 많은 펩타이드 조각을 포함했다. LLUF 프로브와 타액을 샘플링하면 원심 분리를 피할 수 있지만 효과적으로 많은 크고 높은 풍부한 단백질을 제거했습니다. 우리 대량 spectrometric 결과는 많은 낮은 풍요로움의 펩티드가 LLUF 프로브로 큰 단백질을 걸러 후 감지 된 그림. 낮은 풍요의 타액 펩티드가 탐지 크로마 토그래피로 여러 단계의 시료 분리 독립했습니다. 임상 응용의 경우 LLUF 프로브가 통합LC-MS와 D는 잠재적으로 타액에서 질병의 진행을 모니터링하는 미래에 사용될 수 있습니다.

향후 임상 응용을위한 타액 표본 추출을 고려 롤리팝 같은 ultrafiltration (LLUF) 프로브는 인간의 구강에 맞게 가공되었다. NanoLC-LTQ 질량 분석법에 의한 소화되지 않은 타액의 직접적인 분석은 큰 단백질과 높은 풍부한 단백질을 제거하고 낮은 풍부한 펩티드 더 감지하게 LLUF 프로브의 능력을 보여주었다.

롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

인간 타액의 단백질체(proteome)와 펩티드체(peptidome)가 밝혀졌으나,1-2 이는 주로 타액 단백질의 트립신 소화물(tryptic digests)로부터 확인된 것이었습니다. 확인...

이 타액 펩티드 연구에서는 롤리팝 형태의 초여과 프로브를 사용한 후 직접 나노 lc LT Q 질량 분석법으로 분석을 수행합니다. 먼저, 폴리에테르 설폰 막과 에틸렌 프로필렌 튜브를 사용하여 LLUF 프로브를 조립합니다. 다음으로, 자원봉사자로부터 타액 시료를 채취하고 LLUF 프로브를 통해 처리하여 타액을 샘플링합니다.그다음 즉시 nano L-C-L-T-Q 질량 분석법을 진행하여 LLUF 프로브 처리 여부에 따른 타액 샘플의 데이터를 분석합니다. 최종적으로, L-C-M-S-S 데이터를 분석하고 두 샘플 간에 식별된 펩타이드를 비교함으로써 타액 펩타이드를 얻을 수 있습니다. 롤리팝 형태의 초여과 프로브를 직접 nano lc LTQ 질량 분석법에 결합하여 사용하는 이러한 접근 방식은 타액 단백질을 펩타이드로 소화시키는 것과 같은 다른 방법들에 비해 핵심적인 이점을 제공합니다.질량 분석 분석에 앞서, LUF PRO는 타액을 단순화 및 세척하며 임상 적용을 위해 전타액 내 펩타이드의 MS 검출 능력을 향상시킵니다. 에폭시 접착제를 사용하여 폴리에테르 세포막을 삼각형 폴리프로필렌 패들의 가장자리에 밀봉합니다. 그 다음, 테플론 불소화 에틸렌 프로필렌 튜브를 삼각형의 실린더 출구에 부착합니다.폴리프로필렌 패들을 사용하여 프로브를 70% alcohol로 하룻밤 동안 멸균하고, 적절한 밀폐 여부를 평가하기 위해 LLUF 프로브를 50 mg/mL Blue dextran 용액에 2시간 동안 담급니다. 수집된 샘플에 blue dextran이 없는지 확인합니다.20세에서 40세 사이의 건강한 자원자를 모집합니다. 물로 입안을 헹군 후, 피험자에게 전saliva(whole saliva) 시료를 얼음으로 냉각된 용기에 뱉어내도록 요청하십시오. 모든 시료를 모아 얼음 위에 보관하십시오.수집 직후, LLUF 프로브 샘플링을 위해 200 µL의 타액과 함께 4 °C 룸으로 이동합니다. 이제 배양 접시에 담긴 사람의 타액에 폴리에테르 세포막을 담급니다. 타액에서 샘플링을 위한 초여과 과정을 모사하기 위해 시린지를 당겨 음압을 형성합니다.다음으로, 단백질 농도를 측정합니다. 나노 LC 질량 분석법 분석을 위해 타액 단백질 시료를 1 µg/µL 농도로 준비합니다. 시료 분석을 위해 Finnegan LTQ 질량 분석기와 온라인으로 연결된 Exigent nano LC를 사용합니다. 먼저 오토샘플러를 이용하여 소화되지 않은 타액 시료 5 µL를 나노 LC 시스템의 트랩 컬럼에 로딩합니다.세척 단계 후 밸브를 전환하여 버퍼 B를 트랩과 C 18 분리 컬럼에 0에서 50%까지 선형 기울기로 공급합니다. Excalibur의 데이터 의존적 모드를 사용하여 강도가 1 × 10⁴ 이상인 가장 강한 4개 MS 이온의 ms ms 스펙트럼을 수집합니다. 각 시료에 대해 서로 다른 세 가지의 독립적인 전처리를 수행하여 2회 반복 분석합니다.그 다음, 데이터 파일을 Sequester Sorcerer 2 시스템으로 가져와 비효소 특이성(non enzyme specificity)을 사용하여 적절한 인간 NCBI 단백질 데이터베이스를 대상으로 검색하도록 선택합니다. Sequester 검색이 완료되면 결과는 Sequester 결과를 기반으로 Peptide Prophet 및 Protein Prophet에서 자동으로 필터링, 검증 및 표시됩니다. Peptide Prophet은 펩타이드 할당이 틀린 경우와 비교하여 맞을 확률에 대한 종합적인 P-score를 추정하며, 각 펩타이드 서열에 대한 추가 정보도 식별합니다.Protein profit은 Ms.Ms 스펙트럼에 할당된 펩타이드를 기반으로 각 단백질에 대해 0에서 1 사이의 확률 점수를 계산합니다. 본 섹션에서는 세균 검출 배양을 위해 LLUF 프로브가 구강 세균을 제거하는 능력을 결정하며, 호기성 세균 테스트를 위해 LLUF 프로브 수집 전후의 타액 샘플을 agar 플레이트에 도말합니다. 37°C에서 하루 동안 항생제가 없는 LB agar 플레이트를 사용하고, 혐기성 세균의 경우 가스 팩을 사용하여 배양합니다.시료를 bru broth에 넣고, 37°C의 혐기성 조건에서 하루 동안 auger 플레이트에서 배양합니다. 롤리팝 형태의 초미세 여과 장치의 제작은 모사 구강 환경에서의 타액 샘플링을 용이하게 합니다. 이 시스템에서는 분자량 컷오프가 30 kilodaltons인 음전하 폴리에테르설폰 막을 폴리프로필렌 패들에 접착하여 LLUF 프로브 앞에 배치함으로써 타액 내의 더 큰 단백질들을 걸러냅니다.인체 구강 환경을 모사하기 위해, 주사기를 사용하여 스펀지에 타액을 적십니다. 타액은 연결된 튜브를 통해 여과 및 수집됩니다. LLUF 샘플링 전후의 타액 lc 크로마토그램을 비교함으로써 nano L-C-L-T-Q 질량 분석법을 통해 내인성 타액 펩타이드를 식별하였습니다.이러한 차이 크로마토그램은 화학적 또는 효소적 소화 과정 없이 도출되므로, 임상 목적의 시료 준비 과정을 단순화합니다. 본 시료의 경우, 서로 다른 단백질 조성에 대한 LLUF 분석을 통해 소화되지 않은 타액에서 131개의 펩타이드를 확인하였습니다.이 펩타이드들은 다양한 프롤린 풍부 단백질(proline-rich proteins)에서 유래한 단편들입니다. Actin, alpha amylase, alpha one globin, beta globin, his sustain one, keratin, one mucin, seven polymeric immunoglobin receptor serin 및 S 100. LLUF 프로브로 필터링한 후 타액에서 확인된 26개의 고유 펩타이드들은 주로 다양한 프롤린 풍부 단백질에서 유래한 단편들입니다.alpha amylase에서 유래한 이 펩타이드는 LLUF 프로브를 사용하지 않고 수집한 타액 샘플에서만 검출되었으며, 이는 거대 단백질을 제거하는 LLUF 프로브의 능력을 보여줍니다. 더욱 흥미로운 점은 거대 단백질을 제거한 후, LLUF 프로브로 샘플링한 타액에서 여러 서열 펩타이드가 검출되었다는 것이며, 특히 초여과 LLUF 프로브를 사용한 샘플에서 C-말단에 프롤린이 풍부한 펩타이드들이 확인되었습니다. 이제 질량 분석을 위해 단순 타액에 A-L-L-L-L-U-F PRO를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.일관된 조건 하에서 타액을 수집하고 단순화하는 것은 정밀한 분석을 위해 매우 중요합니다. 숙련된다면, 이 기술은 3시간 이내에 적절히 수행될 수 있을 것으로 생각됩니다. 롤리팝 형태의 초여과 프로브와 직접 나노 LC-LT-QMS 질량 분석기를 결합한 이 접근 방식은 인간 질병 진단을 위한 바이오마커의 임상 적용을 용이하게 합니다.

sampling-human-indigenous-saliva-peptidome-using-lollipop-like

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.

인간의 중추 신 경계에서 Endopeptidomic 분석을 위한 시료 준비

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 문서에서는 주변 질량 분석법을 기반으로 하는 고유한 실시간 분석 방법에 대한 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 방법을 사용하면 특별한 전처리 없이 생체 내 생물학적 분자를 실시간으로 분석할 수 있습니다.

프로브 전기 분무 이온화 질량 분광법을 위한 샘플 준비

이 프로토콜은 고급 특징 추출 및 생물정보학 분석 소프트웨어와 결합된 액체 크로마토그래피 질량분석법을 사용하여 펩티도글리칸 조성에 대한 자세한 분석을 다룹니다.

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

여기서, 우리는 단백질 소화, 펩타이드 정제 및 데이터 독립적 인 수집 분석과 같은 상세한 정보와 함께 최적화 된 필터 소화 프로토콜을 제시합니다. 이 전략은 발현 된 전립선 분비 소변 샘플의 분석에 적용되며 높은 프로테아메 커버리지와 오줌 프로테오메의 낮은 누락 된 값 라벨 프리 프로파일링을 허용합니다.

FASP 소화 및 데이터 독립적 분석을 통한 EPS-소변의 프로테오믹 프로파일

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

바이오마커 프로가스트린 방출 펩타이드(ProGRP)로 예시된 건조 혈청 샘플에서 저농도 바이오마커를 측정하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 항체 코팅된 마그네틱 비드는 프로테오타입 ProGRP 펩타이드의 선택적 클린업 및 농축에 사용됩니다. 포획된 펩타이드는 이후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법으로 분석됩니다.

표적 질량분석법 기반 단백질 분석의 마이크로샘플링 저농도 단백질

단백질체학 실험에 적합한 세포외 소포체 분리를 수행하기 위해 폴리카보네이트 초원심분리기 튜브를 세척하고 재사용하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다.

폴리카보네이트 초원심분리기 튜브는 세포외 소포체의 단백질체 분석에 재사용됩니다.

본 논문은, 만성 건강 상태와 생활 환자 임상 치료 공정 과정을 달성 임상 지식 격차를 밝게, 더 나은 치료 관계를 만들어, 그리고 치유를위한 환자 중심의 목표와 가능성을 식별하는 혁신적인 시각적 접근 (photovoice 또는 사진 이끌어 냄)을 보여줍니다 .

임상 간호 공정한 프로세스를 달성하기 위해 비주얼과 이야기 방식을 사용

배우세요 롤리팝 형태 초여과 프로브를 활용한 타액 펩티드 샘플링 방법으로, NanoLC-LTQ 질량분석을 통해 저함량 펩티드를 효과적으로 검출하고 임상 진단에 활용하는 기술입니다.

롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

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