롤리팝 - 같은 Ultrafiltration 프로브를 사용하여 인간의 원주민 타액 Peptidome를 샘플링 : 임상 질량 분광법을위한 펩타이드 감지를 단순화하고 향상

본 타액 펩티드 연구에서는 롤리팝 형태의 초여과 프로브를 사용한 후 직접 나노 lc LT Q 질량 분석법을 통해 분석을 수행합니다. 먼저, 폴리에테르설폰 막과 에틸렌프로필렌 튜브를 사용하여 LLUF 프로브를 조립합니다. 그다음, 자원봉사자로부터 타액 시료를 채취하고 LLUF 프로브로 처리하여 타액을 샘플링합니다.

그 다음, 즉시 nano L-C-L-T-Q 질량 분석법을 진행하여 LLUF 프로브 처리 여부에 따른 타액 샘플의 데이터를 분석합니다. 최종적으로, L-C-M-S-S 데이터를 분석하고 두 샘플 간에 식별된 펩타이드를 비교함으로써 타액 펩티드를 얻을 수 있습니다. 롤리팝 형태의 초여과 프로브를 직접 nano lc LTQ 질량 분석법과 결합하여 사용하는 이 접근 방식은 타액 단백질을 펩타이드로 소화시키는 것과 같은 다른 방법들에 비해 핵심적인 이점을 제공합니다.

질량 분석법 분석에 앞서, LUF PRO는 임상 적용을 위해 전타액 내 펩타이드의 MS 검출 능력을 향상시키고 타액을 단순화 및 정제합니다. 에폭시 접착제를 사용하여 폴리에테르 세포막을 삼각형 폴리프로필렌 패들의 테두리에 밀봉합니다. 그런 다음 테플론 불소화 에틸렌 프로필렌 튜브를 삼각형의 실린더 출구에 부착합니다.

폴리프로필렌 패들로 프로브를 70% 알코올로 밤새 멸균합니다. 적절한 밀폐 여부를 평가하기 위해 LLUF 프로브를 50 mg/mL Blue dextran 용액에 2시간 동안 담급니다. 수집된 샘플에 blue dextran이 없는지 확인합니다.

20세에서 40세 사이의 건강한 자원봉사자를 모집하십시오. 물로 구강을 헹군 후, 피험자에게 전구강 타액 샘플을 얼음으로 냉각된 용기에 뱉도록 요청하십시오. 모든 샘플을 한데 모아 얼음 위에 보관하십시오.

수집 직후 200 µL의 타액을 가지고 4 °C실로 이동하여 LLUF 프로브를 이용한 샘플링을 진행하십시오. 이제 배양 접시에 담긴 사람의 타액에 폴리에테르 멤브레인을 담급니다. 주사기를 당겨 음압을 생성함으로써 타액 샘플링을 위한 초여과 과정을 모사하십시오.

다음으로 단백질 농도를 결정합니다. nano LC 질량 분석법 분석을 위해 타액 단백질 시료를 1 µg/µL 농도로 준비합니다. 시료 분석에는 Finnegan LTQ 질량 분석계와 온라인으로 연결된 exigent nano LC를 사용합니다. 먼저 오토샘플러를 통해 소화되지 않은 타액 시료 5 µL를 nano LC 시스템의 트랩 컬럼에 로딩합니다.

세척 단계 후, 밸브를 전환하여 트랩과 C 18 분리 컬럼에 buffer B를 0%에서 50%까지 선형 기울기로 공급합니다. Excalibur의 데이터 의존적 모드(data dependent mode)를 사용하여, 강도가 1×10⁴ 이상인 가장 강한 4개의 MS 이온에 대해 ms/ms 스펙트럼을 수집합니다. 각 샘플에 대해, 세 가지 서로 다른 독립적인 준비물로 2회 반복 분석을 수행합니다.

그런 다음 데이터 파일을 Sequester Sorcerer II 시스템으로 가져와 비효소 특이성(non enzyme specificity)을 사용하여 적절한 인간 NCBI 단백질 데이터베이스에 대해 검색하도록 선택합니다. Sequester 검색 후, 결과는 Sequester 결과를 기반으로 펩타이드 프로파일(peptide profit)과 단백질 프로파일(protein profit)에서 자동으로 필터링, 검증 및 표시됩니다. 펩타이드 프로파일은 펩타이드 할당이 정확한지 또는 부정확한지에 대한 종합적인 확률 P 점수를 추정하며, 각 펩타이드 서열에 대한 추가 정보도 식별합니다.

Protein profit은 Ms.Ms 스펙트럼에 할당된 펩타이드를 기반으로 각 단백질에 대해 0에서 1 사이의 확률 점수를 산출합니다. 본 섹션에서는 세균 검출 배양을 위해 구강 세균을 제거하는 LLUF 프로브의 능력을 결정하며, 호기성 세균 테스트를 위해 LLUF 프로브 수집 전후의 타액 샘플을 오거 플레이트에 도말합니다. 37 °C에서 하루 동안 항생제가 없는 LB 오거 플레이트를 사용하고, 혐기성 세균의 경우 가스 팩을 사용하여 배양합니다.

시료를 37 °C의 혐기성 조건에서 하루 동안 bru broth, auger 플레이트에 배양합니다. 롤리팝 형태의 초여과 장치 제작은 모사 구강 환경에서 타액 샘플링을 용이하게 합니다. 이 시스템에서는 분자량 컷오프가 30 kilodaltons인 음전하 폴리에테르술폰 막을 폴리프로필렌 패들에 접착하고 LLUF 프로브 앞에 배치하여 타액 내의 더 큰 단백질들을 걸러냅니다.

인체 구강 환경을 모사하기 위해, 주사기를 사용하여 스펀지를 타액에 적십니다. 타액은 연결된 튜브를 통해 여과 및 수집됩니다. LLUF 샘플링 전후의 타액 lc 크로마토그램을 비교하여, nano L-C-L-T-Q 질량 분석법으로 자생 타액 펩타이드를 식별하였습니다.

이러한 차분 크로마토그램은 화학적 또는 효소적 소화 과정 없이 도출되므로, 임상 목적의 시료 준비 과정을 단순화합니다. 본 시료의 경우, LLUF 분석을 통해 서로 다른 단백질 조성을 규명함으로써 소화되지 않은 타액에서 131개의 펩타이드를 확인하였습니다.

이 펩타이드들은 다양한 프롤린 풍부 단백질(proline-rich proteins)에서 유래한 단편들입니다. Actin, alpha amylase, alpha one globin, beta globin, his sustain one, keratin, one mucin, seven polymeric immunoglobin receptor, serin 및 S 100이 이에 해당합니다. LLUF 프로브로 필터링한 후 타액에서 확인된 26개의 고유 펩타이드들은 주로 다양한 프롤린 풍부 단백질에서 유래한 단편들입니다.

알파 아밀라아제에서 유래한 이 펩타이드는 LLUF 프로브를 사용하지 않고 수집한 타액 샘플에서만 검출되었으며, 이는 거대 단백질을 제거하는 LLUF 프로브의 능력을 보여줍니다. 매우 흥미롭게도, 거대 단백질을 제거한 후 LLUF 프로브로 샘플링한 타액에서 여러 서열 펩타이드가 검출되었으며, 특히 C 말단에 프롤린이 풍부한 펩타이드들이 초여과 LLUF 프로브 처리 후의 샘플에서 확인되었습니다. 이제 질량 분석을 위해 단순 타액에 A-L-L-L-L-U-F PRO를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.

일관된 조건 하에 타액을 단순하게 수집하는 것은 더 나은 분석을 위해 매우 중요합니다. 숙달된다면, 이 기술은 3시간 이내에 적절하게 수행될 수 있을 것이라 믿습니다. 롤리팝 형태의 초여과 프로브와 직접적인 nano LC-LTQ-MS 분석을 결합한 이 접근 방식은 인간 질병 진단을 위한 바이오마커의 임상 적용을 용이하게 합니다.