Name: 암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 배우세요 DNA 벡터 기반 RNA 간섭을 활용한 암 관련 유전자 기능 연구 방법입니다. 렌티바이러스를 이용한 안정적인 세포주 생성 및 체외·체내 분석을 통해 유전자 녹다운 효과를 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 연구 학자 미국 암 협회에서 보조금 (116403-RSG - 09-082-01-MGO)와 GS의 웨이크 포레스트 대학 보건 과학 교내 자금에 의해 부분적으로 지원되었다. DBS는 NCI 훈련 보조금 5T32CA079448에 의해 지원되었다.

1. shRNA 구조의 생성 <ol><li> 이전에 다음 ID로 출판 기준 6 등 Ambion 및 GenScript에서 &quot;siRNA 대상 찾기&quot;와 같은 웹 기반 알고리즘 서버를 사용을 기반으로 한 siRNA - 대상 시퀀스 (20-23 세포핵) 식별합니다. </li><li> 표 1의 그림 1과 예제 시퀀스의 설계에 기초 oligonucleotides를 합성. oligonucleotides의 P1과 P2 (30 94에서 denaturing의 사이클 ° 30 초에 대한 C, 60 소둔 ° 30 초위한 C 및 30 초 동안 72 ° C에서 elongating)와 U6 또는 H1를 나르는 플라스미드를 사용하여 PCR 증폭을 수행 템플릿으로 발기인. PCR 정화 칼럼을 사용하여 PCR 제품을 정화. BamHI과 HindIII하여 소화와 PCR 정화 칼럼을 사용하여 소화 DNA를 정화. oligonucleotides의 P3와 P4 (2.5 50 MM 트리스의 100 μl의 pmol / μl • 각각의 HCL, 산도 8.0) 5 분, 상온까지 천천히 시원한 위해 끓고하여.을 어닐링 lentiviral VEC을 소화이러한 BamHI 및 EcoRI으로, 그림 2A에서 설명하고, 젤 - 정화를 수행 하나로서 토르,. </li><li> 1시 10분 10초 어금니 비율 BamHI / EcoRI-소화 벡터, BamHI / HindIII-소화 PCR 조각과 annealed oligonucleotides 중 한 쌍 (HindIII 두 끝에 EcoRI 사이트를 형성)와 3 조각 내고을 수행 (그림 1). </li><li> 고효율 관할 E를 변환 출혈도 잡았 제품을 사용 대장균 DH5α 세포. oligonucleotides P5 (벡터) 및 P6 (H1 또는 U6 발기인에서). 7을 사용 식민지 차단 </li><li> 상용 키트와 긍정적인 식민지로부터 플라스미드 DNA를 준비하고 BamHI / EcoRI 소화와 DNA 아가로 오스 전기 영동에 의한 인서트의 존재를 확인합니다. oligonucleotide P5를 사용하여 모터와 shRNA를 포함하는 시퀀스 지역. </li><li> shRNA 식을 갖고 lentivirus의 DNA를 준비하는 플라스미드 DNA를 미디 또는 맥시 준비 키트 (내독소 프리가 좋습니다) 사용카세트. 260 NM에서 흡수를 측정하여 DNA의 농도를 결정합니다. 260 nm/280 nm의 비율을 사용하여 DNA의 순도를 확인하고 그것이 1.8-2.0의 범위에 빠지고 있는지 확인하십시오. 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 lentivirus 플라스미드 무결성을 확인합니다. transfection을위한 DNA는 슈퍼 코일이어야합니다. </li></ol> 2. Lentivirus의 Transfection 주의 사항 : Lentiviral 벡터가 (HIV-1) 게놈 및 복제 무능 바이러스-1 인간 면역 결핍에서 파생됩니다. 그들은 널리 세포를 분리 및 비 나누어 모두를 감염시킬 수있는 능력으로 인해 유전자 전달에 사용되었습니다. 그러나, 두 가지 주요 위험 lentivirus을 사용하여 연구에 존재합니다. 복제 - 관할 lentivirus의 생성 (1) 잠재. 3 세대 lentiviral 시스템이 사용되는 경우 이러한 위험을 크게 줄일 수 있습니다. oncogenesis (2) 잠재. 실시 삽입이 종양 발생 있거나 종양 진압을 주체할 경우이 위험을 악화 수 있습니다.HIV 기반 lentivirus에 관련된 연구 활동은 NIH (의 &quot;Lentiviral 벡터와 연구를 위해 Biosafety 고려 사항&quot;을 따라야 <a href="http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/rdna_rac/rac_guidance_lentivirus.html</a> ) 및 Biosafety위원회의 승인이 필요 연구자의 기관. lentiviral 벡터를 사용하는 경우 일반적으로 향상된 Biosafety 레벨 2 (BSL-2) 봉쇄는 실험실 설정이 필요합니다. <ol><li> 플레이트 4 × 10cm 요리와 야간 문화 완전한 DMEM 배지 (DMEM 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 2 MM L-글루타민, 100 단위 / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신과 함께 제공)와 10 6 HEK 293T 세포 37 5 % CO 2 배양기에서 ° C에서. 전 세럼 미디어 (Invitrogen)를 절감 사전 예열 Opti-MEM 5 ML과 매체를 교체합니다. </li><li> shRNA 함유 lentiviral 벡터의 10 μg, 5 μg 세 번째 gener 각각의 솔루션을 준비한다ation의 lentivirus 포장 plasmids (고순도를 살린, 세 개의 포장 plasmids는 VSV-G 같습니다 레브에 대한, 그리고 pMDLg / pRRE : 봉투 단백질, pRSV-레브 용을 개그 / lentivirus 포장에 필수적인 POL에 대한) (36) 2M CaCl 2 및 멸균 물 300 μl의 μl. </li><li> 식염수 버퍼 2 ×의 Hepes 300 μl (281 MM NaCl, 100 MM HEPES, 1.5 MM 나 2 HPO 4, 0.5 N NaOH에 의해 7.12로 조정하고 0.22 μm의 필터에 의해 소독 산도) : 솔루션 B를 준비합니다. </li><li> 피펫으로 솔루션 B를 통해 공기를 품어 동안 천천히 솔루션 B 솔루션에 놓습니다. 30 분 동안 상온에서 튜브를 남겨주세요. </li><li> 천천히 단계 2.1 준비 HEK 293T 세포 배양 접시에 혼합 솔루션에게 / B를 중단하고 4-6 H 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 완전한 DMEM 매체 7 ML과 매체를 교체합니다. 24 H 후, 완전한 DMEM 매체의 추가 5 ML을 추가합니다. 매체 cont을 수확문화의 또 다른 24 H 후 lentivirus을 aining. </li><li> 10 분 동안 1500 RPM, 주위 온도에서 매체를 봐. 0.45 μm의 필터를 사용하여 표면에 뜨는을 필터링하고 그 흐름을 통해 스핀 25,000 rpm으로 ultracentrifugation에 의해 lentivirus를 포함하는 매체 (SW28 스윙 버킷 로터와 125,000 × g &#39;를 동등, Beckman의 Ultracentrifuge XL-90), 4 ° C에서 90 분입니다. 5 % 표백제 (최종 농도)와 함께 컨테이너에 뜨는을 가만히 따르다. </li><li> 차가운 PBS의 0.5-1.0 ML에 lentivirus 펠렛을 Resuspend 및 튜브 당 50-100 μl로 lentivirus의 aliquots하다. -80에서 그들을 저장 ° C. </li><li> lentivirus의 titer는 실시간 PCR 프로토콜 8 의한 상업 키트 (예 : 셀 Biolabs에서 QuickTiter의 Lentivirus의 Quantitation 키트, 주식 등), 또는 형광 현미경이나 유동세포계측법를 사용하여 공동 표현 형광 마커를 결정하여 결정하실 수 있습니다 . 일반적으로, 한 10 cm 배양 접시는 0.5-1.0 대해 생산할 수 × 10 8 infec을tious 단위 (IU). </li></ol> 3. 감염된 세포의 감염 및 특성화 <ol><li> 종자는 세포 30~40%의 confluency (약 5-8 × 10 5 세포, 세포 크기에 따라)와 함께 6 - 잘 플레이트에 전체 매체 중 2 ML에서 감염되는. 37 하룻밤 문화 전지 5 % CO 2 배양기에서 ° C에서. </li><li> 신선한 매체의 1 ML 8 polybrene의 μg / ML (시그마, 고양이 # H9268) 또는 5 μg / 프로타민의 ML을 (시그마, 고양이 # P4020) 포함하는으로 매체를 교체합니다. </li><li> 감염 (방어) 형광 마커로 lentivirus을 사용하여 특정 세포주에 대한 범위 9 적당한 다수를 결정합니다. 계산이나 경험적으로 세포주를 감염하는 데 사용되는 lentivirus의 양을 결정한다. 천천히 접시에 lentivirus 내려 부드럽게 10 초 동안 흔들어. </li><li> 6 H에 대한 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 접시를 부화 후 정상 완료 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 적어도 두 다YS 감염 후, 형광 마커 및 / 표현 lentivirus 위해 형광 현미경을 사용하여 세포를 확인하거나 항생제 저항 유전자를 표현하는 lentiviral 벡터의 중간에 해당하는 항생제를 추가합니다. inducible 벡터 들어, Tet-ON 시스템 (그림 2), 문화로 중간에있는 세포는 테트라 사이클린 무료 FBS와 함께 준비했습니다. 세포에게 2-3일 포스트 감염을 분할. ≥ 2 일간 1.5 μg / ML doxycycline (Dox)와 함께 공급없이 중간에 culturing을하여 inducible 유전자 최저을 테스트하는 세포의 일부를 가져가라. </li><li> ≥ 이일 Dox뿐만 아니라 이후 서양 얼룩, 리얼 타임 PCR 또는 immunostaining ≥ 이일 감염 후 항생제 선택 후 2 일, 또는 (Tet-inducible에서 시스템에 대한)에 의해 유전자 최저를 확인합니다. </li><li> 대상 유전자 KN의 효과를 결정하기 위해 다양한 접근 방법 (예 : 세포 증식의 assays, 소프트 한천 문화 연구, 마이 그 레이션 assays, 침공 assays와 종양 형성 연구 등) 활용세포 강한 악의에 ockdown. </li></ol> 4. 이종 이식 마우스 모델 연구 <ol><li> 마우스 anesthetization과 생쥐의 감염을 막기 위해 70 %의 에탄올에 의한 주입에 대한 모든 표면을 청소합니다. 2 % 사용 isoflurane 사전 세포 접종에 마취 유도 챔버 10 분 안에 산소와 혼합.에게 athymic 누드 마우스 (NCI-프레데릭)를 마취 코 콘을 통해 산소와 혼합 isoflurane 1 %를 사용하여 마취를 유지합니다. 뛰어난 통풍과 방안에 대해이 단계를 수행하고 유도 실로 isoflurane 청소 필터를 첨부합니다. </li><li> shRNAs를 나르는 세포를 증식. inducible 벡터 Tet-켜기 위해 테트라 사이클린없는 매체를 사용하십시오. 세포를 Trypsinize 50 %의 Matrigel을 포함하는 완전한 매체에서 그들을 resuspend. 가열 패드에 누드 생쥐 (30 ° C)에 위치하고 마우스 당 1-2 사출 사이트와 생쥐에 세포를 200 μl (1-10 × 10 6 세포의 강한 악의에 따라)을 주입. 25과 주사기를 사용하십시오.피하 주사하고, 주사 orthotopic을위한 28-30 게이지 주사 바늘이 5 게이지 바늘. </li><li> 제정 shRNA 벡터의 경우 목표 유전자 shRNA과 뒤섞여 shRNA을 표현 세포로 주입 쥐를 2 그룹을 사용합니다. Tet는 -에서 inducible의 shRNA 벡터, 표적 유전자 shRNA과 뒤섞여 shRNA 정상적인 물을 공급하고 Dox (1.5 밀리그램 / ML) 물 (2 shRNAs × 2 트리 트먼트 = 4 그룹)를 포함한 들고 세포로 주입 쥐를 4 그룹을 활용 내용 . 일주일에 두 번 Dox 함유 물을 교체하십시오. </li><li> 디지털 버니어 캘리퍼스하여 매주 또는 격주 종양의 길이와 넓이를 모니터링하고 공식 V = 1 / 2 (길이 × 폭 2) 10 종양 볼륨 (V)를 계산합니다. 그 종양 볼륨 기관 ACUC의 지침 (예 : 체중의 10 %, 등) 초과하지 않도록하십시오. 그것이 광범위한 ulceration이나 괴사, 명백한 infectio의 흔적을 보여주는 경우 기관 ACUC 승인한 프로토콜을 사용하여 마우스를 안락사N, 통제 출혈 또는 말기 질환. </li><li> 종양 성장과 전이와 같은 반딧불의 루시페라제 등 발광 생물 마커 11, 표현 주사 종양 세포에 대해 모니터할 수 있습니다. 마우스 anesthetization과 생쥐의 감염을 막기 위해 70 %의 에탄올에 의한 영상의 모든 표면을 청소합니다. 4.1 단계에서 설명한대로 생쥐를 마취. luciferin (150 밀리그램 / ㎏) intraperitoneally을 주사. 이러한 IVIS 이미징 시스템 (캘리퍼스 생명 과학 주식 회사)와 같은 상용 이미징 시스템의 감염되지 않았소 이미징 챔버로 생쥐를 놓습니다. 산소와 혼합 isoflurane 1%으로 마취를 유지하기 위해 마취 레버를 켭니다. 뛰어난 통풍과 방안에 대해이 단계를 실시합니다. </li><li> 5 분 노출에 의해 첫 번째 이미지를 가지고 있으며 신호 강도를 확인합니다. 배경 대 최적의 신호로 이미지를 얻기 위해 노출 시간을 조정합니다. 경험적으로 이미징 시간을 확인,이 과정은 일반적으로 피하 종양에 1-5 분입니다. </li><li> 승인된 프로토콜에 의해 쥐를 안락사시켜야종양 크기는 약 1,000 mm 3, 또는 ACUC 지침에 의해 지정된 도달 기관 ACUC에 의해. 소비세 이종 이식 종양, 그들에게 무게와 사진을 찍고. 유전자 발현을 테스트하는 등 종양 세포 형태를 결정하는 병리 학적 분석 등 다양한 연구에 대한 종양 샘플과 서양 얼룩 및 실시간 PCR 연구를 처리합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 athymic 누드 생쥐에서,이 프로토콜은 반딧불 루시페라제-표현 MDA-MB-231 세포 (캘리퍼스 생명 과학 인간 유방 선암 세포)의 이종 이식 종양 형성에 YY1 최저의 효과를 연구하는 데 사용되었다. 인간 YY1의 shRNA 대상 시퀀스는 &quot;AGC AGA AGC AGG AGA TGC T를 GGG&quot;라는 것이다. 발진 시퀀스는 &quot;GGG ACT ACT CTA TTA CGT CAT T&quot;도 통제 알려진 어떤 성적표에 상당한 유사성을 가지고 있지 않은 (cont) shRNA을 위해 만들었습니다. 예를 들어 같은 YY1있는 inducible의 shRNA 구조 Tet-에서 확인하는 데 사용 oligonucleotides,, 표 1에 표시됩니다. 결과적으로, 두 lentiviral 벡터, pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA 및 pLu-Puro-Indu-cont shRNA은 건설되었고 그들은 lentiviruses를 생산하는 데 사용되었다. 우리는 개별적으로 테트라 사이클린 레귤레이터 (tetR)과​​ 반딧불의 루시페라제을 모두 표현이 MDA-MB-231 세포 클론 (클론 1, 3) 감염이 lentiviruses를 사용했습니다. Polyclonal 세포 인구는 puromycin 선택 후 얻은되었다. 그림 3A는 pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus 감염이 MDA-MB-231 세포에서 Dox 유발 YY1 최저를 보여줍니다. 그러면 이러한 inducible YY1 shRNA 및 cont shRNA의 lentiviruses에 의해 개별적으로 감염 YY1 고갈이 MDA-MB-231 세포 (그림 3B)의 invasiveness을 줄일 것을 관찰 클론 3 polyclonal 세포를 사용했습니다. indu-cont shRNA를 포함하는 세포 (그림 3C)이 효과를 표시하지 않은 반면 서양 얼룩 분석은 indu-YY1 shRNA과 MDA-MB-231 세포에서 Dox 유발 YY1 입을를 확인했다. 그러면 사용<html> 이종 이식 마우스 모델 연구를위한 세포. 컨트롤 그룹에 비해 indu-YY1 shRNA과 MDA-MB-231 세포에 의해 이식 및 Dox 함유 물과 함께 제공되는 마우스는 (그림 4B bioluminescence (그림 4A)에 의해 시각 때 감소 종양 형성을 보여주 및 종양 무게에 의해 결정 ). 이러한 이종 이식 종양에서 YY1 입을은 그림 4C에 나타난 서양 얼룩 연구에 의해 확인되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig1.jpg" /> 1 그림. shRNA 구조과 shRNA 전사의 생성을위한 개략도. primers의 P1 P6까지 (예 시퀀스에 대해 표 1 참조) 표시됩니다. 폴 III : RNA 중합 효소 III (D) :. 소화 끝. 도면이 스케일에없는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4129/4129fig1large.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 2 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4129/4129fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. () lentiviral 벡터 및 (B)의 메커니즘 Tet-에서 유전자 입을 사용 inducible의 H1업자.의 개략도 다이어그램 lentiviral 벡터는 pLL3.7 14 일 기준으로 재건축되었다. H1 - 저얼 : H1업자, UBC - 저얼 : 인간 ubiquitin의 C 프로 모터, Puro : puromycin, 트레 : 테트라 싸이클린 반응 요소, Dox : doxycycline. TetR : 테트라 사이클린 조절기. 5&#39;LTR, 3&#39;SIN-LTR과 WRE는 lentiviral 벡터 14 필수 구성 요소입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig3.jpg" /> 그림 3. Dox 유도된 YY1의 입을 및 MDA-MB-231 세포의 invasiveness에 미치는 영향. 에서 파생된 두 polyclonal 세포 인구의 대답 YY1 수준 TetR-표현 pLu-Puro-Indu-YY1 shRNA lentivirus에 의해 감염 Dox의 부재와 존재에 배양해 클론 1과 3. inducible의 shRNAs와 MDA-MB-231 세포의 B. Boyden 챔버 분석. (* P &lt;0다른 세 그룹 대 0.05). 네 개 세포 인구의 YY1 표현의 C. 대표 서양 blots. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4129/4129fig4.jpg" /> 4 그림. MDA-MB-231 세포에 의한 이종 이식 종양 형성의 유도 YY1 입을 효과. 세포 이식 (왼쪽)과 4 주 (오른쪽) 포스트 세포 접종에 IVIS 이미징 시스템에 의해 촬영된 대표적인 발광 생물 이미지의 A. 도식 다이어그램. 사주에서 B. 이종 이식 종양의 무게. * P ≤ 0.05. C. 서양은 YY1의 blots 및 Dox의 부재와 존재의 indu-YY1 shRNA과 MDA-MB-231 세포의 xenografts의 β-actin의 표현. 위에 레이블은 개별 생쥐들의 이름이다. <table border="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> 시퀀스 (5 &#39;- 3&#39;) </td><td> 용도 및 위치 </td></tr><tr><td> P1 (Tet-잠1) </td><td> cagt GGATCC CGA ACG CTG ACG TCA TCA ACC C </td><td> PCR, H1업자의 5&#39;-끝 </td></tr><tr><td> P1 (U6) </td><td> cagt GGATCC GAC GCC GCC ATC TCT AGG </td><td> PCR, U6업자의 5&#39;-끝 </td></tr><tr><td> P2 (YY1 용 H1 Tet-에 있음) </td><td> cagc AAGCTT GAA ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC합니다 GGG ATC TCT ATC ACT GAT AGG GAA C </td><td> PCR, Tet-에서 inducible의 H1업자의 3&#39;-끝의 </td></tr><tr><td> P2 (U6와 YY1의 경우) </td><td> cagc AAGCTT GAA ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC합니다 AAA CAA ggc TTT tct CCA agg gat </td><td> PCR, U6업자의 3&#39;-끝의 </td></tr><tr><td> P3 (YY1 용) </td><td> AGC TT ATC tgc ACC tgc TTC tgc TCC합니다 ttttt g </td><td> P4와 annealed 수 </td></tr><tr><td> P4 (YY1 용) </td><td> aattc aaaaa <str긴 사연&gt; ggg AGC 아가 AGC agg tgc 아가 타 </td><td> P3와 annealed 수 </td></tr><tr><td> P5 (pLL3.7 용) </td><td> ggg 전술 agt gca ggg gaa 아가 ATA g </td><td> PCR 검사의 경우 P6과 함께 사용 </td></tr><tr><td> P6 (H1 Tet-에 해당) </td><td> GAT TTC CCA GAA CAC ATA GCG 교류 </td><td> P5와 함께 사용되는 PCR 검사에 대한 </td></tr><tr><td> P6 (U6의 경우) </td><td> AGG AGT GTG TTC CTT TTG TGC TG </td><td> P5와 함께 사용되는 PCR 검사에 대한 </td></tr></tbody></table> 표 1. shRNA 구조를 생성에 사용되는 합성 oligonucleotides. P1과 마우스 U6와 Tet-inducible에서 인간의 H1의 발기인에 대한 P6 시퀀스가 제공됩니다. 인간 YY1는 GGG AGC AGA AGC AGG AGA TGC T. YY1에 특정한 시퀀스가​​ 강조 표시됩니다의 shRNA 대상 순서와 예제로 사용됩니다. YY1 두 P2 시퀀스는 각각 두 발기인 위해 설계되었습니다. 제정 U6 / YTet가 -에서 H1/YY1이 프로토콜에서 사용하는 도중에 Y1 shRNA은 이전 15 설명했다. P5는 벡터 구체적이고 pLL3.7 14가 표시되는 순서입니다. 제한 효소의 시퀀스는 시퀀스를 PCR 증폭시 발기인으로 어닐링하는 반면, 밑줄이되고 기울임 꼴 있습니다.

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<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 프로토콜은 shRNA를 사용하여 유전자를 허물고 생체내의 종양 세포 성장의 발광 생물 이미징을 사용하여 생물 학적 효과를 시각화하는 방법을 설명합니다. shRNA의 대상 사이트 (BamHI, HindIII와 EcoRI) 사용되는 세 개의 제한 사이트의가 없어야합니다 subcloning입니다. 드문 경우 이러한 사이트 중 하나라도 존재하면, 추가적인 제한 효소는 구조를 발전시키고 그것을 대체하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 몇 가지 주요 단계 shRNA lentiviral 벡터의 건설을 빠르게합니다. 첫째, U6 또는 H1 프로 모터를 포함하는 플라스미드 PCR 템플릿은 lentiviral 벡터 (일반적으로 암피실린)에서 다른 항생제 저항 유전자 (예 : kanamycin 등)가있을 수 있습니다. 이것은 플라스미드 템플릿에 의한 변화의 배경을 줄일 수 있습니다. 둘째, 그것은 유능한 E.을 사용할 필요가 변환의 높은...

RNA와 단백질 분석 및 세포 배양에 사용되는 일반적인 실험실 장비 이외에 다음과 같은 재료와 시약이 프로토콜이 필요합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> Biosafety 레벨 2 억제에 적합 Biosafety 내각 </td></tr><tr><td> PCR thermocycler </td></tr><tr><td> Ultracentrifuge </td></tr><tr><td> isoflurane 넝마주이로 마취 유도 챔버 </td></tr><tr><td> 디지털 버니어 캘리퍼스 </td></tr><tr><td> IVIS 이미징 시스템 </td></tr><tr><td> 고도로 유능한 DH5a E. 대장균 </td></tr><tr><td> EcoRI, BamHI, &amp; HindIII 제한 효소 </td></tr><tr><td> T4의 DNA Ligase </td></tr><tr><td> 3 세대 lentivirus 포장 plasmids VSV-G pRSV - 레브와 pMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> 자료 목록

암 관련 유전자 기능을 연구하기 dna를 벡터 기반의 rna 간섭

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA 간섭 (RNAi)는 특별히 굴욕적인 표적 mRNAs에 의해 유전자 발현을 억제. 유전자 입을 1 더블 표류하는 작은 간섭 RNA (siRNA)의 발견 이후, RNAi는 유전자 기능 연구에 강력한 연구 도구가되었습니다. 유전자 삭제에 비해 RNAi - 중재 유전자 입을은 그것이 수행되고있는 용이성 및 대부분의 세포 라인의 적합성 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 여러 연구가 암 연구에 RNAi 기술의 애플 리케이션을 증명하고있다. 특히 U6 또는 H1 프로 모터에 의해 구동 작은 머리핀 RNA (shRNA)를 생산하는 유전자 벡터 기반 기술의 개발이 가능 2,3 입을 장기와 inducible 유전자를했습니다. 같은 lentivirus와 같은 유전자 조작 바이러스 벡터,와 함께 그것의 사용은 안정 shRNA 표현에 대한 게놈의 DNA로 shRNA 제공 및 / 또는 통합의 높은 효율성을 용이하게합니다. 우리는 detaile을 설명D 절차 shRNA, lentivirus 생산과 세포 감염 및 마우스 이종 이식 모델을 이용한 기능성 연구를 표현하는 lentiviral 벡터의 건설을 포함하여 유전자 기능을 확인하기 위해 DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술을 사용하여. 다양한 전략 shRNA 구조를 생성에보고되었습니다. 프로토콜은 PCR 증폭 및 3 조각 내고를 고용하는 것은 직접적으로 그리고 효율적으로 생성하는데 사용될 수 있습니다 여기에서 설명한 shRNA 함유 shRNA 코딩 순서에 어떠한 여분의 염기 인접한를 떠나지 않고 lentiviral 구조를. 이 전략에 의해 만들어 shRNA-발현 카세트가 제한 효소에 의해 절단되기 때문에, 그들은 쉽게 다른 형광이나 항생제 마커와 다른 벡터로 이동할 수 있습니다. 대부분의 상용 transfection의 시약은 lentivirus 생산에 사용할 수 있습니다. 그러나,이 보고서에서, 우리는 90 %의 transfection 효율을 통해 달성할 수있는 칼슘 인산염 석출을 사용하는 경제적인 방법을 제공293T 세포. 제정 shRNA 발현 벡터에 비해 inducible의 shRNA 시스템은 세포 증식에​​ 필수적인 유전자를 쓰러뜨린에 특히 적합합니다. 우리는 음과 양 1 (YY1), 유방암 4,5에서 잠재적인 oncogene의 유전자 입을을 보여주 의해 Tet-에서 inducible shRNA 시스템과 종양 형성에 미치는 영향. lentivirus을 사용하여 연구 결과 검토 및 연구자의 기관 Biosafety위원회 biosafety 프로토콜의 승인이 필요합니다. 동물 모델을 이용한 연구 결과 검토 및 연구자의 교육 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (ACUC)에 의해 동물의 프로토콜의 승인이 필요합니다.

RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 녹아웃 이상의 많은 장점을 보유하고 광범위하게 유전자 기능 연구의 도구로 사용되었습니다. DNA를 벡터 기반의 RNAi 기술의 발명은 장기적으로 가능한 inducible 유전자 최저했고, 또한 유전자 입을의 가능성을 증가<em&gt; 생체내에서</em&gt;.

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 표적 mRNA를 특이적으로 분해함으로써 유전자 발현을 억제합니다. 이중 가닥의 짧은 간섭 RNA(small interference RNA)의 발견 이후...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 DNA 벡터 기반의 RNA 간섭을 이용하여 유전자 기능을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 특정 유전자를 표적으로 하는 shRNA 컨스트럭트를 설계하고 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 shRNA 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스를 생성하는 것입니다.그 다음 렌티바이러스를 세포에 감염시켜 안정적 세포주를 생성하며, 이렇게 렌티바이러스에 감염된 세포를 다양한 in vitro 및 in vivo 분석에 사용하여 표적 유전자의 억제 효과를 결정합니다. 궁극적으로, 활용된 분석법에 따라 in vitro 증식, 이동 및 침윤 분석뿐만 아니라 in vivo 이종이식 형성 모델을 통해 유전자 넉다운 결과로 인한 세포의 종양 형성능 변화를 확인할 수 있습니다. 시연을 맡은 이는 Daniel Stowell과 Ma Juan이며, Daniel은 본 연구실의 대학원생이고 Ma Ma는 테크니션입니다.Chang은 박사후 연구원입니다. 이 방법은 특정 유전자가 암의 발생 및 진행에 역할을 하는지, 그리고 이러한 과정의 어떤 측면에서 중요한지 등 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 설계를 시작하려면 기술된 기준에 따라 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 주문하십시오. 표적 유전자 내의 20~23 뉴클레오타이드 표적 서열을 포함하는 두 개의 역상보적 올리고를 준비하십시오.이들은 양 끝에 Eco RI 및 Hind III 사이트를 형성하게 됩니다. 어닐링 후, 표적 서열 및 그 3' 말단에 상보적인 역서열을 포함하는 또 다른 올리고가 상위 프라이머와 함께 H1 또는 U6 프로모터의 3' 말단에 어닐링됩니다.PCR을 사용하여 양 끝에 BAM HI 및 Hind III 사이트가 있는 단편을 제작합니다. 그동안 렌티바이러스 벡터와 PCR 단편을 제한효소로 처리합니다. 그런 다음 벡터, PCR 단편 및 Anil 올리고뉴클레오타이드 간의 3제 단편 결합 반응을 수행합니다.1:10:10 몰 비율로 혼합하면, 결과 벡터는 루프 영역에 His-tag 서열을 포함하는 목적 hRNA를 생성하게 됩니다. 유도성 벡터를 사용하는 경우, hRNA 생산은 Tet-on 시스템의 doxycycline과 같은 유도 분자의 존재 여부에 따라 결정됩니다. 이제 라이게이션 산물을 사용하여 효율이 높은 E. coli DH5$\alpha$ 수용성 세포에 형질전환시키고, 콜로니 기반 PCR 스크리닝을 통해 양성 벡터를 식별하십시오.벡터와 유도성 프로모터 결합 부위에 걸쳐 있는 산물을 증폭합니다. 상용 키트를 사용하여 양성 콜로니에서 플라스미드 DNA를 준비합니다. 그런 다음 BamHI 및 EcoRI 제한효소 처리와 DNA 아가로스 전기영동을 통해 삽입물의 존재를 확인합니다.또한, LIGA 뉴클레오타이드 P 5를 사용하여 프로모터와 S-H-R-N-A를 포함하는 영역의 서열을 분석합니다. 엔도톡신 제거 MIDI 또는 maxi prep 키트를 사용하여 HRNA 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 DNA를 준비합니다. 260 nm에서 빛 흡수도를 측정하여 DNA 농도를 결정하고, 260 nm 대비 280 nm 빛 흡수 비율이 1.8에서 2.0 사이인지 확인하여 DNA의 순도를 보장합니다.마지막으로 렌티바이러스 플라스미드를 에어로겔에서 전기영동하여 S-coil 형태인지 확인합니다. 형질전환 전, 피펫으로 솔루션 B에 공기를 불어넣으며 솔루션 A 0.9 milliliters를 솔루션 B 0.9 milliliters에 천천히 떨어뜨려 형질전환 준비물을 만듭니다. 그 다음, 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이어서, 혼합물 0.6 milliliters를 HEK 293T 세포가 배양된 10 centimeter 플레이트 3개에 천천히 떨어뜨립니다.그 후 4~6시간 뒤에 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 배지를 7 mL의 완전 DMEM 배지로 교체합니다. 24시간 후에 배지 5 mL를 추가로 넣고, 다시 24시간이 지나면 렌티바이러스가 포함된 배지를 수확합니다.수확한 배지를 실온에서 1500 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 0.45 micrometer 필터를 사용하여 상층액을 여과합니다. 렌티바이러스가 포함된 여과액을 초원심분리기로 원심분리합니다.상층액을 5% bleach가 들어 있는 폐기물 용기에 따라냅니다. 렌티바이러스 펠렛을 0.5~1 mL의 차가운 1X PBS에 재현탁합니다. 그 후 렌티바이러스 용액을 50~100 µL씩 소분하여 -80 °C에서 보관합니다.마지막으로, 신뢰할 수 있는 기술을 사용하여 렌티바이러스의 타이터를 측정합니다. 일반적으로 세포 감염을 진행하기 전, 10 centimeter 배양 접시에서 5,000만 내지 1억 개의 감염 단위가 생성됩니다. 본 절차를 위해 키트 또는 R-T-P-C-R을 사용하여 렌티바이러스 타이터의 MOI를 결정하십시오.4 미만의 MOI를 권장합니다. 감염시킬 세포를 6-웰 플레이트에 30~40% 밀도로 분주하고 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작하십시오. 다음 날.배지를 poly brain 또는 protamine이 포함된 신선한 배지 1 mL로 교체합니다. 그런 다음 형광 또는 항생제 마커가 포함된 렌티바이러스 1~2 million iu를 첨가합니다.플레이트를 10초 동안 천천히 흔들어 혼합한 후 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후, 배지를 일반 완전 배지로 교체하고 세포를 2일 동안 증식시킵니다. 2일 후에는 사용한 렌티바이러스에 관계없이 배지에 항생제나 유도제가 포함되어서는 안 됩니다.렌티바이러스에 항생제 마커가 포함되어 있는 경우 적절한 항생제를 추가하십시오. 마찬가지로, 렌티바이러스가 유도성인 경우 배양액의 절반에 유도제를 추가하십시오. 항생제와 유도제를 넣고 세포를 2~3일 더 배양한 후, 제노그라프트 trypsin eyes 전에 표적 유전자의 넉다운 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하십시오.대형 세포 배양 접시에서 세포를 수확하여 50% matrigel이 포함된 원래 배지에 재부유시킵니다. 암세포 재부유액과 50% matrigel, 그리고 주사기를 얼음 위에 유지하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 matrigel이 응고될 위험이 있으며, 이로 인해 감염 과정에 문제가 생길 수 있습니다.70% ethanol로 수술 부위를 철저히 세척하여 준비하고, 환기가 잘 되는 환경에서 유도 챔버에 isof fluorine 스캐빈저 필터를 장착하여 마취를 수행합니다. 세포 접종 3~5분 전에 1.5% oxygen과 혼합된 2% isof fluorine을 사용하여 thymic nude mice를 마취시킵니다. 그 후, 노즈콘(nose cone)을 통해 산소와 혼합된 2% isof fluorine을 공급하여 마취 상태를 유지합니다.30 °C로 설정된 가열 패드 위에 마우스를 배치합니다. 피하 주사를 위해서는 25.5 gauge 바늘을, 정위 주사를 위해서는 28~30 gauge 바늘이 장착된 주사기에 세포를 충전합니다. 마취 유도 5분 후, 한 곳 또는 두 곳의 부위에 200 µL의 볼루스로 100만에서 1,000만 개의 세포를 주입합니다.세포 수는 암세포의 악성도 또는 공격성에 따라 달라집니다. 구성적으로 활성화된 벡터의 경우, 표적 유전자 S-H-R-N-A 또는 벡터의 스크램블 S-H-R-N-A를 발현하는 세포를 주입한 두 그룹의 마우스를 이용하십시오. 동일한 두 그룹을 사용하되, 각 그룹을 식수에 유도제를 제공하는 하위 그룹과 제공하지 않는 하위 그룹으로 나누십시오.물을 포함한 음용수를 주 2회 교체하십시오. 캘리퍼스(C)를 사용하여 매주 또는 격주로 종양의 부피를 측정하십시오. 종양 부피가 기관 또는 IACUC 제한치를 초과하지 않도록 주의하고, 광범위한 궤양, 괴사, 명백한 감염, 조절되지 않는 출혈 또는 말기 질환 증상을 보이는 동물은 안락사시키십시오. 생물 발광 마커를 통해 종양의 성장 및 전이를 모니터링하려면, 작업 구역을 소독하고 가스 마취제가 있는 이미징 챔버 내에서 마우스를 마취시키십시오.먼저, 2~5분 동안 노출시킨 후 신호 강도를 확인하고 그에 따라 조정하십시오. 종양의 크기가 1000 cubic millimeters를 초과하거나 기관의 크기 제한을 넘어서는 경우, 희생 시 동물을 안락사시키고 종양 크기를 기록한 후 추가 분석을 위해 보관하십시오. 이 프로토콜은 athymic nude mice에 이식된 루시페라아제 발현 인간 유방 선암 세포의 제노그래프트 종양 형성에 대한 why Y one 녹다운의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.인간 YY1의 S-H-R-N-A 표적 서열과 알려진 인간 전사체와 유의미한 유사성이 없는 스크램블 대조군 S-H-R-N-A를 모두 테스트하였습니다. 그 결과, 두 개의 렌티바이러스 벡터를 구축하여 두 종류의 렌티바이러스를 생성하였습니다. 이를 각각 서로 다른 두 세포 집단에 감염시켜 다클론성 세포 집단을 확보하였습니다.퓨어마이신(puromycin) 선택 후, 웨스턴 블롯 분석을 통해 이러한 감염된 세포주에서 DS 유도 YY one 넉다운이 확인되었습니다. 다음으로, 유도성 YY one S-H-R-N-A 및 대조군 S-H-R-N-A가 감염된 클론 3의 다클론 세포 집단을 사용하였습니다.YY one 결핍이 침습에 미치는 영향을 테스트하기 위해 렌티바이러스(LENTIVIRUSES)를 사용하였습니다. 우리는 YY one 결핍이 세포의 침습성을 감소시키는 것을 관찰하였습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 indu YY one S-H-R-N-A를 가진 세포에서는 docs에 의해 YY one 사일런싱이 유도된 것을 확인한 반면, 대조군을 포함하는 세포에서는 그렇지 않았습니다.S-H-R-N-A는 이러한 효과를 보이지 않았습니다. 이후 이 세포들을 대조군 및 indu, YY one S-H-R-N-A가 이식된 마우스 제노그라프트 모델 연구에 사용하였으며, 물이 포함된 용량을 공급받은 군에서 생물발광 시각화 및 예상대로 측정된 종양 무게 모두에서 종양 형성이 유의하게 감소한 것이 확인되었습니다. 이러한 제노그라프트 종양에서의 YY one 사이런싱은 웨스턴 블롯을 통해 쉽게 확인되었습니다.연구 시, 렌티바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 유념하십시오. 렌티바이러스 벡터 연구에 관한 NIHB 안전 고려 사항에 따라, 모든 실험실 환경에서 강화된 생물 안전 2등급(BSL-2) 밀폐 절차가 요구됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

바이러스 감염에 관련된 소설 호스트 요소는 기능 RNAi 심사의 셀 기반의 게놈 전체의 손실을 통해 확인할 수 있습니다.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

RNA 간섭은 유전자의 기능을 분석하는 매우 효과적인...

dsRNA 주입하여 RNAi 간섭에 Drosophila 태아

여기, 우리는 실험실에서 중간 - 세균 딱정벌레, Dermestes maculatus (D. maculatus)를 양육하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 또한이 종에서 유전자 기능을 연구하기 위해 배아 표현형을 분석 배아 및 부모의 RNAi를위한 프로토콜과 방법을 공유 할 수 있습니다.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초, Dermestes maculatus

선물이 RIP-태그;를 활용 하 여 소설 체세포 유전자 전달 시스템을 설명 하는 프로토콜 RIP-tva 마우스 모델 전이에서 유전자의 기능 연구. 조류 레트로 바이러스 intracardiacally 성인 쥐에서 췌 장 β 세포의 사전 악성, 비 침 투 적인 병 변으로 유전자 전송을 보장 하기 위해 전달 됩니다.

식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

여기 우리는 프로토콜 설명 높은 처리량 RNAi 심사 oncolytic 바이러스 치료를 강화 하도록 조작 될 수 있는 호스트 대상을 폭로를 위한, 특히 rhabodvirus 및 vaccinia 바이러스 치료, 하지만 그것은 다른 oncolytic 쉽게 적용할 수 있습니다 바이러스 플랫폼 또는 변조 바이러스 복제를 일반적으로 호스트 유전자 발견.

RNAi 게놈 넓은 검사 Oncolytic 바이러스 치료 변조 호스트 요소를 식별 하

여기서 설명된 것은 생물학적으로 상승적인 miRNAs및 그들의 조립체를 짧은 트랜스게네인으로 특성화하기 위한 프로토콜이며, 이는 유전자 치료 애플리케이션을 위한 동시 과발현을 허용한다.

교모세포종에서 기능적으로 연관된 miRNAs의 특성화 및 유전자 치료를 위한 인공 클러스터로의 엔지니어링

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

상향 조절된 많은 유전자는 종양 세포의 이동과 침입을 자극하여 예후를 악화시킵니다. 어떤 유전자가 종양 세포의 이동과 침입을 조절하는지 알아내는 것은 매우 중요합니다. 이 프로토콜은 종양 세포의 이동 및 침입에 대한 유전자 발현 증가의 효과를 실시간으로 조사하는 방법을 제시합니다.

합성 mRNA transfection 후 종양 세포 이동 및 침습의 실시간 정량 측정

이 연구는 흑색종 세포에서 긴 non-coding RNA를 표적으로 하는 이중 CRISPRi 시스템을 제시합니다. 이를 통해 조합 유전자 녹다운(combinatorial gene knockdown) 및 합성 치사 스크리닝(synthetic lethal screening)을 가능하게 하여 잠재적인 치료 전략을 위한 암 특이적 lncRNA 상호 작용을 식별할 수 있습니다.

암세포에서 비암호화 RNA 간의 합성 치사 상호작용을 표적으로 하기 위한 이중 CRISPR-간섭 전략

우리는 송곳니 hindlimb의 근육 강도와 반복 편심 수축으로 근육 응답을 측정하기 위해 최소한 - 침략과 고통없이 방법을 설명합니다.

VIVO 개 근육 기능 분석에

배우세요 DNA 벡터 기반 RNA 간섭을 활용한 암 관련 유전자 기능 연구 방법입니다. 렌티바이러스를 이용한 안정적인 세포주 생성 및 체외·체내 분석을 통해 유전자 녹다운 효과를 평가할 수 있습니다.

암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

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