암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

이 절차의 전반적인 목표는 DNA 벡터 기반 RNA 간섭을 사용하여 유전자 기능을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 특정 유전자를 표적으로 하는 S-H-R-N-A 구조를 설계하고 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 SH RNA 발현 카세트를 운반하는 렌티바이러스를 생산하는 것입니다.

그런 다음 세포를 렌티바이러스로 감염시켜 안정적인 세포주를 생성하고, 렌티바이러스에 감염된 세포는 다양한 시험관 내 및 생체 내 분석에서 사용되어 관심 유전자를 침묵시키는 효과를 확인합니다. 궁극적으로, 사용된 분석법에 따라 결과는 in vitro 증식, 이동 및 침입 분석과 in vivo 이종 이식 모델의 사용을 통한 유전자 녹다운의 결과로 세포의 종양 생식력의 변화를 보여줄 수 있습니다. 절차를 시연하는 사람은 Daniel Stowell, ma Juan, Daniel은 제 연구실의 대학원생이고 Ma Ma는 기술자입니다.

Chang은 박사 후 연구원입니다. 이 방법은 특정 유전자가 암 발병 및 진행에 중요한 역할을 하는지 여부와 이러한 과정의 어떤 측면에 중요할 수 있는지와 같은 암 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 기술된 기준에 따라 올리고뉴클레오티드를 설계하고 주문하기 위해, 표적 유전자에 20 내지 23개의 뉴클레오티드 표적 서열을 포함하는 두 개의 역 상보적 올리고인 Anil을 선택합니다.

그들은 양쪽 끝에 eco R 1과 Hindi 3 사이트를 형성 할 것입니다. 무릎을 꿇은 후, 또 다른 올리고는 목표 서열에 대한 역 상보 서열과 그 3개의 프라임 엔드를 포함합니다. 상류 뇌관을 가진 H 1 U 6 발기인의 3개의 주요한 끝에 Neils.

PCR을 사용하여 양쪽 끝에 BAM H 1 및 힌디어 3 개의 부위가 있는 단편을 만듭니다. 한편, 렌티바이러스 벡터와 PCR 단편을 분해합니다. 그런 다음 벡터, PCR 단편 및 Anil 올리고 뉴클레오티드 사이의 3 단편 결찰 반응을 수행합니다.

1 대 10 대 10 몰 비율에서 결과 벡터는 루프 영역에서 힌디어 3 서열과 함께 관심 HRNA를 생성합니다. 유도 벡터가 사용되는 경우, HRNA 생산은 Tet on system에 대한 doxycycline과 같은 유도 분자의 존재에 달려 있습니다. 이제 결찰 산물을 사용하여 매우 효율적이고 유능한 대장균 DH 5개의 알파 세포를 형질전환하고 콜로니 기반 PCR 스크리닝을 사용하여 양성 벡터를 식별합니다.

벡터와 유도성 프로모터 결찰 부위에 걸쳐 있는 산물을 증폭합니다. 상용 키트를 사용하여 양성 콜로니의 혈장 DNA를 준비합니다. 그런 다음 BAM H one 및 ECO R one 분해 및 DNA 아가로스 전기영동으로 삽입물의 존재를 확인합니다.

또한, LIGA 뉴클레오티드 P five를 사용하여 프로모터 및 S-H-R-N-A를 포함하는 영역을 염기서열분석한다. 내독소가 없는 MIDI 또는 맥시 준비 키트를 사용하여 HRNA 발현 카세트를 운반하는 렌티바이러스 DNA를 준비합니다. 260 나노 미터에서 광 흡수를 측정하여 DNA 농도를 측정하고 260 - 280 나노 미터의 광 흡수 비율이 1.8에서 2.0 사이인지 확인하여 DN a의 순도를 확인합니다.

마지막으로 렌티바이러스 플라스미드를 에어로 겔에 실행하여 S가 감겨 있는지 확인합니다.transfection하기 전에 먼저 0.9ml의 용액 A를 0.9ml의 용액 B에 천천히 떨어뜨리고 피펫으로 용액 B를 통해 공기를 버블링하여 transfection을 준비합니다. 그런 다음 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 다음으로, 혼합물 0.6ml를 HEK 2 93 T 세포가 있는 3개의 서로 다른 10cm 플레이트에 천천히 떨어뜨립니다.

그런 다음 4-6시간 후에 세포를 인큐베이터로 다시 보냅니다. 매체를 7ml의 완전한 DMEM 배지로 교체합니다. 24시간 후에 배지 5ml를 더 첨가하고 24시간 후에 렌티바이러스가 포함된 배지를 수확합니다.

수확된 배지를 실온에서 1500RPM으로 10분 동안 회전시킵니다. 0.45마이크로미터 필터를 사용하여 상층액을 여과합니다. 초원심분리(ultra centrifugation)로 렌티바이러스(lentivirus)를 포함하는 매체를 통해 흐름을 회전시킵니다.

상층액을 5% 표백제가 들어있는 폐기물 용기에 디캔팅합니다. 렌티바이러스 펠릿을 1/2에서 1밀리리터의 차가운 XPBS에 재현탁합니다. 그런 다음 렌티바이러스 용액을 50-100마이크로리터 분취량으로 나누어 영하 80도에서 보관합니다.

마지막으로, 신뢰할 수 있는 기술을 사용하여 렌티바이러스의 역가를 측정합니다. 일반적으로 10cm 배양 접시는 세포 감염을 진행하기 전에 5천만에서 1억 개의 감염 단위를 생성합니다. 이 절차를 위해 키트 또는 R-T-P-C-R을 사용하여 렌티바이러스 역가의 MOI를 측정합니다.

MOI가 4보다 작으면 됩니다. 먼저 6웰 플레이트에 감염될 세포를 30-40% co의 유창성으로 파종하고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.

배지를 폴리 브레인 또는 프로타민이 함유된 1밀리리터의 신선한 배지로 교체하십시오. 그런 다음 1에서 200만 iu 사이를 추가합니다. 형광 또는 항생제 마커를 포함하는 렌티바이러스.

접시를 10초 동안 천천히 흔들어 섞고 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후 배지를 정상, 완전한 배지로 교체하고 2일 동안 세포를 증식시킵니다. 배지에는 2일 후에 사용된 렌티바이러스에 관계없이 항생제나 유도제가 포함되어서는 안 됩니다.

렌티바이러스에 항생제 마커가 포함되어 있는 경우 적절한 항생제를 추가합니다. 마찬가지로, 렌티바이러스가 유도가능한 경우 배양액의 절반에 유도제를 추가합니다. 항생제와 유도제로 2-3일 더 세포를 배양한 후, 이종 트립신 안구 이식 전에 표적 유전자의 녹다운을 테스트하기 위해 서양 혈액 분석을 수행합니다.

대형 세포 배양 용기의 세포를 50%마트리겔을 함유한 원래 배지에 재현탁합니다. 암세포를 50% 재현탁시키고 마트리겔과 주사기를 얼음 위에 두는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 마트리겔이 굳어지고 감염이 AB

70% 에탄올로 수술 부위를 깨끗이 세척하여 수술 부위를 준비하고, 환기가 잘 되는 상태에서 마취를 진행하고, 유도실에 불소 제거제 필터를 부착하여 마취를 실시합니다. 세포 접종 3-5분 전에 1.5%산소와 2%의 불소를 혼합하여 흉선 누드 마우스를 마취합니다. 그런 다음 콧방울을 통해 산소와 혼합된 불소 2%를 사용하여 마취를 유지합니다.

섭씨 30도로 설정된 발열 패드에 마우스를 놓습니다. 피하 주사를 위한 25 및 반 게이지 바늘 또는 이정소 주사를 위한 28-30 게이지 바늘을 사용하여 세포를 주사기에 로드합니다. 한두 군데에서 마취를 유도한 후 5분 후, 200마이크로리터 덩어리에 1-1,000만 개의 세포를 주입합니다.

세포 수는 암세포의 악성 종양 또는 공격성에 따라 다릅니다. 구조적 활성 벡터의 경우, 표적 유전자 S-H-R-N-A 또는 벡터에서 스크램블된 S-H-R-N-A 포르텟을 발현하는 세포를 주입한 두 그룹의 마우스를 사용합니다. 동일한 두 그룹을 사용하여 각각 물에 유도제가 제공되거나 제공되지 않는 하위 그룹으로 나눕니다.

물이 들어있는 문서를 일주일에 두 번 교체하십시오. 종양의 부피가 기관 또는 A CUC 한도를 초과하지 않는지 확인하고 광범위한 궤양, 괴사, 명백한 감염, 조절되지 않는 출혈 또는 말기 질환을 보이는 동물을 안락사시킵니다. 생물 발광 마커를 통해 종양 성장 및 전이를 모니터링하려면 작업 영역을 소독하고 기체 마취로 이미징 챔버에서 마우스를 마취합니다.

먼저 2-5분 동안 노출하고 신호 강도를 확인한 다음 그에 따라 조정합니다. 종양 크기가 1000입방밀리미터를 초과하거나 제물 때 동물을 안락사시키는 제도적 크기 제한이 있는 경우, 종양 크기를 문서화하고 추가 분석을 위해 보관합니다. 이 프로토콜은 흉선 누드 마우스에 이식된 인간 유방 선암 세포를 발현하는 루시페라아제의 이종이식 종양 형성에 대한 Y one knockdown의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.

알려진 인간 전사체와 유의한 유사성이 없는 인간 YY one의 S-H-R-N-A 표적 염기서열과 스크램블 대조군 S-H-R-N-A를 모두 테스트했습니다. 그 결과, 두 개의 렌티바이러스 벡터가 구축되어 두 개의 렌티바이러스를 생산하는 데 사용되었습니다. 둘 다 두 개의 서로 다른 세포 집단을 감염시키는 데 사용되었으며 다클론 세포 집단을 얻었습니다.

pur 마이신 선택 후. 서양의 혈액 분석은 DS가 이 감염된 세포주에서 YY 1 녹다운을 유도하는 것으로 확인되었습니다. 다음으로, 유도성 YY 1 S-H-R-N-A에 감염된 클론 3의 다클론 세포 집단과 대조군을 살펴보았다. 쉴라-르-나.

렌티바이러스는 YY 1 고갈이 침입에 미치는 영향을 테스트하기 위해 사용되었습니다. 우리는 YY 1 고갈이 세포의 침습성을 감소시키는 것을 관찰했습니다. 서양의 혈액 분석은 의사가 indu YY one S-H-R-N-A를 가진 세포에서 YY one 침묵을 유도하는 반면, 세포는 대조군을 포함하는 것을 확인했습니다.

S-H-R-N-A는 이러한 효과를 나타내지 않았습니다. 그런 다음 이러한 세포를 이종이식 마우스 모델 연구에 사용하여 대조군과 비교했으며, 물을 함유한 dos를 공급받은 YY 1개의 S-H-R-N-A 이식 마우스는 생물 발광으로 시각화했을 때 그리고 종양 무게가 예상대로 측정되었을 때 종양 형성이 크게 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 이종이식 종양에서 침묵하는 YY 1은 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 쉽게 확인되었습니다.

연구: 렌티바이러스 벡터를 사용하는 NIHB 안전 고려 사항에 따라 렌티바이러스 바이러스를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 모든 실험실 환경에는 향상된 B 안전 수준 2 격리 절차가 필요합니다.