암 관련 유전자 기능을 연구하기 DNA를 벡터 기반의 RNA 간섭

이 실험 절차의 전반적인 목표는 DNA 벡터 기반의 RNA 간섭을 이용하여 유전자 기능을 결정하는 것입니다. 이는 먼저 특정 유전자를 표적으로 하는 shRNA 컨스트럭트를 설계하고 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 shRNA 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스를 생성하는 것입니다.

그 다음 렌티바이러스를 세포에 감염시켜 안정적 세포주를 생성하며, 이렇게 렌티바이러스에 감염된 세포를 다양한 in vitro 및 in vivo 분석에 사용하여 표적 유전자의 억제 효과를 결정합니다. 궁극적으로, 활용된 분석법에 따라 in vitro 증식, 이동 및 침윤 분석뿐만 아니라 in vivo 이종이식 형성 모델을 통해 유전자 넉다운 결과로 인한 세포의 종양 형성능 변화를 확인할 수 있습니다. 시연을 맡은 이는 Daniel Stowell과 Ma Juan이며, Daniel은 본 연구실의 대학원생이고 Ma Ma는 테크니션입니다.

Chang은 박사후 연구원입니다. 이 방법은 특정 유전자가 암의 발생 및 진행에 역할을 하는지, 그리고 이러한 과정의 어떤 측면에서 중요한지 등 암 연구 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 설계를 시작하려면 기술된 기준에 따라 올리고뉴클레오타이드를 설계하고 주문하십시오. 표적 유전자 내의 20~23 뉴클레오타이드 표적 서열을 포함하는 두 개의 역상보적 올리고를 준비하십시오.

이들은 양 끝에 Eco RI 및 Hind III 사이트를 형성하게 됩니다. 어닐링 후, 표적 서열 및 그 3' 말단에 상보적인 역서열을 포함하는 또 다른 올리고가 상위 프라이머와 함께 H1 또는 U6 프로모터의 3' 말단에 어닐링됩니다.

PCR을 사용하여 양 끝에 BAM HI 및 Hind III 사이트가 있는 단편을 제작합니다. 그동안 렌티바이러스 벡터와 PCR 단편을 제한효소로 처리합니다. 그런 다음 벡터, PCR 단편 및 Anil 올리고뉴클레오타이드 간의 3제 단편 결합 반응을 수행합니다.

1:10:10 몰 비율로 혼합하면, 결과 벡터는 루프 영역에 His-tag 서열을 포함하는 목적 hRNA를 생성하게 됩니다. 유도성 벡터를 사용하는 경우, hRNA 생산은 Tet-on 시스템의 doxycycline과 같은 유도 분자의 존재 여부에 따라 결정됩니다. 이제 라이게이션 산물을 사용하여 효율이 높은 E. coli DH5$\alpha$ 수용성 세포에 형질전환시키고, 콜로니 기반 PCR 스크리닝을 통해 양성 벡터를 식별하십시오.

벡터와 유도성 프로모터 결합 부위에 걸쳐 있는 산물을 증폭합니다. 상용 키트를 사용하여 양성 콜로니에서 플라스미드 DNA를 준비합니다. 그런 다음 BamHI 및 EcoRI 제한효소 처리와 DNA 아가로스 전기영동을 통해 삽입물의 존재를 확인합니다.

또한, LIGA 뉴클레오타이드 P 5를 사용하여 프로모터와 S-H-R-N-A를 포함하는 영역의 서열을 분석합니다. 엔도톡신 제거 MIDI 또는 maxi prep 키트를 사용하여 HRNA 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 DNA를 준비합니다. 260 nm에서 빛 흡수도를 측정하여 DNA 농도를 결정하고, 260 nm 대비 280 nm 빛 흡수 비율이 1.8에서 2.0 사이인지 확인하여 DNA의 순도를 보장합니다.

마지막으로 렌티바이러스 플라스미드를 에어로겔에서 전기영동하여 S-coil 형태인지 확인합니다. 형질전환 전, 피펫으로 솔루션 B에 공기를 불어넣으며 솔루션 A 0.9 milliliters를 솔루션 B 0.9 milliliters에 천천히 떨어뜨려 형질전환 준비물을 만듭니다. 그 다음, 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이어서, 혼합물 0.6 milliliters를 HEK 293T 세포가 배양된 10 centimeter 플레이트 3개에 천천히 떨어뜨립니다.

그 후 4~6시간 뒤에 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 배지를 7 mL의 완전 DMEM 배지로 교체합니다. 24시간 후에 배지 5 mL를 추가로 넣고, 다시 24시간이 지나면 렌티바이러스가 포함된 배지를 수확합니다.

수확한 배지를 실온에서 1500 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 0.45 micrometer 필터를 사용하여 상층액을 여과합니다. 렌티바이러스가 포함된 여과액을 초원심분리기로 원심분리합니다.

상층액을 5% bleach가 들어 있는 폐기물 용기에 따라냅니다. 렌티바이러스 펠렛을 0.5~1 mL의 차가운 1X PBS에 재현탁합니다. 그 후 렌티바이러스 용액을 50~100 µL씩 소분하여 -80 °C에서 보관합니다.

마지막으로, 신뢰할 수 있는 기술을 사용하여 렌티바이러스의 타이터를 측정합니다. 일반적으로 세포 감염을 진행하기 전, 10 centimeter 배양 접시에서 5,000만 내지 1억 개의 감염 단위가 생성됩니다. 본 절차를 위해 키트 또는 R-T-P-C-R을 사용하여 렌티바이러스 타이터의 MOI를 결정하십시오.

4 미만의 MOI를 권장합니다. 감염시킬 세포를 6-웰 플레이트에 30~40% 밀도로 분주하고 하룻밤 동안 배양하는 것으로 시작하십시오. 다음 날.

배지를 poly brain 또는 protamine이 포함된 신선한 배지 1 mL로 교체합니다. 그런 다음 형광 또는 항생제 마커가 포함된 렌티바이러스 1~2 million iu를 첨가합니다.

플레이트를 10초 동안 천천히 흔들어 혼합한 후 6시간 동안 배양합니다. 6시간 후, 배지를 일반 완전 배지로 교체하고 세포를 2일 동안 증식시킵니다. 2일 후에는 사용한 렌티바이러스에 관계없이 배지에 항생제나 유도제가 포함되어서는 안 됩니다.

렌티바이러스에 항생제 마커가 포함되어 있는 경우 적절한 항생제를 추가하십시오. 마찬가지로, 렌티바이러스가 유도성인 경우 배양액의 절반에 유도제를 추가하십시오. 항생제와 유도제를 넣고 세포를 2~3일 더 배양한 후, 제노그라프트 trypsin eyes 전에 표적 유전자의 넉다운 여부를 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하십시오.

대형 세포 배양 접시에서 세포를 수확하여 50% matrigel이 포함된 원래 배지에 재부유시킵니다. 암세포 재부유액과 50% matrigel, 그리고 주사기를 얼음 위에 유지하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 matrigel이 응고될 위험이 있으며, 이로 인해 감염 과정에 문제가 생길 수 있습니다.

70% ethanol로 수술 부위를 철저히 세척하여 준비하고, 환기가 잘 되는 환경에서 유도 챔버에 isof fluorine 스캐빈저 필터를 장착하여 마취를 수행합니다. 세포 접종 3~5분 전에 1.5% oxygen과 혼합된 2% isof fluorine을 사용하여 thymic nude mice를 마취시킵니다. 그 후, 노즈콘(nose cone)을 통해 산소와 혼합된 2% isof fluorine을 공급하여 마취 상태를 유지합니다.

30 °C로 설정된 가열 패드 위에 마우스를 배치합니다. 피하 주사를 위해서는 25.5 gauge 바늘을, 정위 주사를 위해서는 28~30 gauge 바늘이 장착된 주사기에 세포를 충전합니다. 마취 유도 5분 후, 한 곳 또는 두 곳의 부위에 200 µL의 볼루스로 100만에서 1,000만 개의 세포를 주입합니다.

세포 수는 암세포의 악성도 또는 공격성에 따라 달라집니다. 구성적으로 활성화된 벡터의 경우, 표적 유전자 S-H-R-N-A 또는 벡터의 스크램블 S-H-R-N-A를 발현하는 세포를 주입한 두 그룹의 마우스를 이용하십시오. 동일한 두 그룹을 사용하되, 각 그룹을 식수에 유도제를 제공하는 하위 그룹과 제공하지 않는 하위 그룹으로 나누십시오.

물을 포함한 음용수를 주 2회 교체하십시오. 캘리퍼스(C)를 사용하여 매주 또는 격주로 종양의 부피를 측정하십시오. 종양 부피가 기관 또는 IACUC 제한치를 초과하지 않도록 주의하고, 광범위한 궤양, 괴사, 명백한 감염, 조절되지 않는 출혈 또는 말기 질환 증상을 보이는 동물은 안락사시키십시오. 생물 발광 마커를 통해 종양의 성장 및 전이를 모니터링하려면, 작업 구역을 소독하고 가스 마취제가 있는 이미징 챔버 내에서 마우스를 마취시키십시오.

먼저, 2~5분 동안 노출시킨 후 신호 강도를 확인하고 그에 따라 조정하십시오. 종양의 크기가 1000 cubic millimeters를 초과하거나 기관의 크기 제한을 넘어서는 경우, 희생 시 동물을 안락사시키고 종양 크기를 기록한 후 추가 분석을 위해 보관하십시오. 이 프로토콜은 athymic nude mice에 이식된 루시페라아제 발현 인간 유방 선암 세포의 제노그래프트 종양 형성에 대한 why Y one 녹다운의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다.

인간 YY1의 S-H-R-N-A 표적 서열과 알려진 인간 전사체와 유의미한 유사성이 없는 스크램블 대조군 S-H-R-N-A를 모두 테스트하였습니다. 그 결과, 두 개의 렌티바이러스 벡터를 구축하여 두 종류의 렌티바이러스를 생성하였습니다. 이를 각각 서로 다른 두 세포 집단에 감염시켜 다클론성 세포 집단을 확보하였습니다.

퓨어마이신(puromycin) 선택 후, 웨스턴 블롯 분석을 통해 이러한 감염된 세포주에서 DS 유도 YY one 넉다운이 확인되었습니다. 다음으로, 유도성 YY one S-H-R-N-A 및 대조군 S-H-R-N-A가 감염된 클론 3의 다클론 세포 집단을 사용하였습니다.

YY one 결핍이 침습에 미치는 영향을 테스트하기 위해 렌티바이러스(LENTIVIRUSES)를 사용하였습니다. 우리는 YY one 결핍이 세포의 침습성을 감소시키는 것을 관찰하였습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 indu YY one S-H-R-N-A를 가진 세포에서는 docs에 의해 YY one 사일런싱이 유도된 것을 확인한 반면, 대조군을 포함하는 세포에서는 그렇지 않았습니다.

S-H-R-N-A는 이러한 효과를 보이지 않았습니다. 이후 이 세포들을 대조군 및 indu, YY one S-H-R-N-A가 이식된 마우스 제노그라프트 모델 연구에 사용하였으며, 물이 포함된 용량을 공급받은 군에서 생물발광 시각화 및 예상대로 측정된 종양 무게 모두에서 종양 형성이 유의하게 감소한 것이 확인되었습니다. 이러한 제노그라프트 종양에서의 YY one 사이런싱은 웨스턴 블롯을 통해 쉽게 확인되었습니다.

연구 시, 렌티바이러스를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 유념하십시오. 렌티바이러스 벡터 연구에 관한 NIHB 안전 고려 사항에 따라, 모든 실험실 환경에서 강화된 생물 안전 2등급(BSL-2) 밀폐 절차가 요구됩니다.