가스 크로마토 그래피에 의한 operant 에탄올 자기 관리 및 에탄올 결정시 에탄올의 Microdialysis

이 절차의 전반적인 목표는 에탄올 자가 투여 세션 동안 뇌 투석액의 에탄올 수치를 모니터링하는 것입니다. 이 방법을 동기식 자가 투여 행동과 비교하기 위해, 먼저 미세 투석 가이드, 캐뉼라 및 테더 볼트를 외과적으로 이식한 다음 쥐가 에탄올을 조작적으로 자가 투여하도록 훈련시켜 이를 수행합니다. 두 번째 단계는 쥐를 머리 단계 밧줄에 익숙화하여 미세 투석 중에 에탄올 자가 투여를 방해하지 않도록

그런 다음 에탄올 자가 투여 세션 동안 미세 투석이 수행되며, 이 세션 동안 다이얼레이트의 일부가 에탄올 분석을 위해 준비됩니다. 다음으로, 다이얼레이트 샘플은 화염 이온화 검출 기능이 있는 가스 크로마토그래프를 사용하여 에탄올 농도를 분석합니다. 궁극적으로, 얻어진 결과는 에탄올이 에탄올 자가 투여 세션 동안 뇌의 관심 영역에 도달하는 시간 경과를 보여줍니다.

꼬리 또는 복재정맥 천자와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 절차가 샘플 수집 시 방해를 최소화하고 동물이 행동 작업을 수행하는 동안 관심 뇌 영역에서 시간 경과에 따른 약물 측정이 가능하다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 여러 가지 전문 기술이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것이며, 그 중 대부분은 반복적인 연습이나 경험을 통해서만 습득할 수 있습니다. 또한 우리 연구실의 학부 연구 조교인 Jeffrey Dilley가 절차를 시연할 것입니다.

표시된 모든 동물 절차는 텍사스 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았으며 실험실 동물 규정의 관리 및 사용에 대한 모든 지침을 따릅니다. University of Texas at Austin은 ALAC 인증 시설로, 뇌의 관심 영역 위에 21 게이지 캐뉼라를 외과적으로 이식한 긴 Evans 쥐가 이러한 행동 미세 투석 실험에 사용됩니다. 모든 동물은 다음 절차를 시작하기 전에 최소 1주일 동안 수술 후 관리 및 회복을 받아야 하며 건강해야 합니다.

리히터 개폐식 레버와 티퍼 튜브가 장착된 med associates 조작실에 쥐를 놓고 10% 자당 용액에 접근하기 위해 레버를 누르도록 훈련시킵니다. 쥐가 자당 용액에 반응하도록 훈련을 받은 후, 두 번째에서 마지막 조작 세션 전날 밤에 여러 번의 음주 세션을 통해 용액에 에탄올을 점진적으로 추가하는 적절한 훈련 일정으로 시작합니다. 동물을 마취시키고 진정 수준을 확인한 후 테더 스프링을 쥐의 머리 스테이지에 있는 테더 볼트에 부착하여 평형 레버, 암, 회전 테더, 스프링 및 링 스탠드로 구성된 장치에 익숙화합니다.

쥐가 집 케이지의 수술실에서 애드리도, 음식, 물이 있는 밤을 보내게 한 다음, 미세 투석 실험 전날 밧줄과 동반 장비를 준비한 상태에서 다음 날의 훈련 세션을 완료하도록 합니다. 쥐를 불소로 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행하여 진정 상태를 확인하고 인공 뇌척수액이 관류된 미세 투석 프로브를 삽입합니다. 프로브를 적절하게 고정한 다음 프로브 유량을 분당 0.2마이크로리터로 조정합니다.

쥐를 수술실의 가정용 우리에 넣어 모든 투석 장비를 갖춘 상태에서 밤을 보내고 lib, 음식 및 물을 추가합니다. 실험이 시작되기 최소 2시간 전에 프로브를 삽입한 다음 날에는 프로브를 작동 유량으로 높입니다. Hamilton 주사기를 사용하여 프로브 유속이 일정하고 설정된 유속의 90% 이상인지 확인합니다.

투석 샘플에서 신경전달물질을 평가하는 경우, 실험의 모든 단계에서 샘플을 채취합니다. 동물이 집 우리에 있는 동안 투석 샘플을 수집하는 것으로 시작하십시오. 나중에 분석할 수 있도록 적절한 방식으로 샘플을 보관하십시오.

쥐를 조작실로 조심스럽게 옮기고 챔버를 제어하는 조작 프로그램을 시작합니다. 레버가 확장되기 전에 레버가 챔버 안으로 확장될 때까지 랫드가 두 개의 샘플을 기다리는 동안 샘플을 계속 채취합니다. 적절한 투석액 분취액을 2ml 유리 바이알에 피펫으로 주입하고 밀폐된 격막, 피펫으로 바이알을 밀봉하고 에탄올 샘플을 신속하게 밀봉하여 에탄올 분석을 위한 각 투석액 샘플의 일부를 수집하기 시작합니다.

에탄올은 휘발성이고 시료 부피가 적기 때문에 시료 준비가 일관되지 않거나 느리면 부정확한 결과를 초래할 수 있습니다. 나머지는 신경전달물질 분석을 위해 보관합니다. 20분의 음주 시간은 메드 어소시에이츠(Med Associates) 컴퓨터 프로그램이 레버를 챔버 안으로 확장한 후 시작되며, 쥐가 레버를 눌러 음주 용액 한 병에 접근한 후 시작됩니다.

전체 음료 기간 동안 샘플을 계속 채취하십시오 : 음료 시간이 끝난 후 컴퓨터 프로그램은 챔버에서 병을 집어 넣습니다. 미세 투석 실험이 끝날 때까지 추가로 20분 동안 음주 후 동물을 챔버에 보관하십시오. 쥐를 마취 한 후 프로브를 제거하십시오.

동물이 즉시 인도적으로 안락사되지 않으면 탐침관을 시각화할 수 있도록 폐쇄기를 교체하십시오. 실험 후 3일 이내에 뇌를 수집합니다. 화염 이온화 검출기가 있는 가스 크로마토그래프, 섭씨 50도로 가열된 헤드스페이스 자동 샘플러, 헬륨을 이동상으로 사용하는 모세관 컬럼을 사용하여 외부 에탄올 표준물질과 함께 샘플을 분석합니다.

크로마토그램을 기록하고 분석하려면 크로마토그래피 워크스테이션 소프트웨어를 사용하여 에탄올 분석을 위해 시스템을 준비합니다. 재순환 수조를 사용하여 자동 샘플러 플레이트를 가열하고 공기와 수소 탱크를 엽니다. 그런 다음 시작 프로그램을 시작합니다.

준비가 되면 20분 동안 연소를 시작하여 섬유의 오염을 제거합니다. 100 밀리리터 부피 플라스크를 사용하여 238 마이크로리터의 95% 에탄올을 물로 희석하여 최종 부피 100 밀리리터로 표준물질을 만듭니다. 일대일 시리얼 희석을 사용하여 표준물질을 생성합니다.

표준물질을 유리 바이알에 피펫으로 넣고 샘플이 준비된 대로 정확하게 밀봉합니다. 당신의 기준에 따라 물 블랭크를 실행하십시오. 표준물질과 샘플을 자동 샘플러 트레이에 넣고 전체 액체 분취액이 기화될 때까지 가열합니다.

표준물질 및 샘플을 실행하려면 어떤 샘플이 어떤 자동 샘플러 슬롯에 있는지 확인하고 각 샘플에 구멍을 뚫어야 함을 기록하는 샘플 목록을 만듭니다. 데이터 파일을 선택한 폴더로 라우팅한 다음 샘플에 대해 선택한 방법을 선택하고 실행을 시작합니다. 시스템이 샘플을 실행한 후 프로그램이 각 피크를 올바르게 통합했는지 확인합니다.

그래프, 알려진 각 외부 표준의 함수로 나타낸 피크 높이. 에탄올 농도. 점으로 지정된 선형 함수를 사용하여 각 투석액 샘플의 에탄올 농도를 보간합니다.

이 그림은 3가지 농도의 에탄올 표준물질에 대한 크로마토그램의 예시와 에탄올 자가 투여 세션이 끝날 때 수집된 쥐 투석액 샘플에 대한 1개의 크로마토그램을 보여줍니다. 에탄올 피크는 상대적으로 대칭적이어야 하고, 머무름 시간이 일정해야 하며, 신호 대 잡음비가 10보다 커야 합니다. 이러한 기준을 충족하지 못한다는 것은 시스템에 유지보수, 고품질 크로마토그래피가 필요하며, 올바른 표준물질이 자가 투여 과정에서 에탄올 자가 투여 동물로부터 수집된 투석액 샘플의 에탄올 농도를 계산하는 데 사용되는 선형 표준 곡선을 생성한다는 것을 의미합니다.

유도된 투석액 에탄올 농도는 in vivo 프로브 회수를 위해 보정되지 않았으며 뇌 에탄올 조직 농도의 일부일 뿐입니다. 에탄올의 정량적 미세투석이 필요한 경우, 세포외 공간에서 프로브로 확산되는 에탄올의 추출 분획을 실험적으로 측정합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 4-5시간 안에 완료할 수 있습니다.

이것은 행동 세션의 길이에 따라 달라집니다. 실험의 미세투석 단계를 성공적으로 완료하는 것은 준비 단계의 품질에 크게 좌우됩니다. 이 절차를 시도하는 것은 쥐를 잘 다루고 투석 실험 중에 발생할 수 있는 주의를 산만하게 할 수 있는 자극에 익숙화하여 동물의 자가 투여 행동에 영향을 미치지 않는지 확인하는 것이 중요합니다.