Name: 나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 학습하세요 지질 Vesicles 제조를 위한 압력 제어 압출 방법을 통해 균일한 나노 크기의 리포솜을 효율적으로 준비하는 기술을. 동적 광 산란과 나노입자 추적 분석으로 크기를 검증합니다.

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이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 공동 혁신 수상에 의해 지원되었다. 램 시그널링 및 건강 교육 기금의 셀룰러 규정 국립 연구소 (T32 GM008759)와 NIH 루스 L. Kirschstein 사전 박사 연구원 (CA165349-01)에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 소중한 의견 교수 마이클 스토 웰 (CU 볼더), 교수 더글러스 말하지 그래과 교수 롭 필립스 (Caltech)에 감사드립니다.

1. 리포좀 준비 <ol><li> 테플론 늘어선 모자와 함께 20 ML의 유리관을 검색합니다. </li><li> 오염을 방지하기 위해 사용하는 사전 클로로포름 모든 유리 제품과 주사기를 청소합니다. </li><li> 250 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 유리관에 시약 등급의 클로로포름 100 μL를 전송합니다. </li><li> 100 μL 빵빵한 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리관에 시약 등급의 메탄올 30 μL를 추가합니다. </li><li> phosphatidylethanolamine (교황) : 2 MM 7:1.5:1.5 phosphatidylcholine (POPC) 준비하려면 콜레스테롤 지질 솔루션을, 11 밀리그램 / ML 10 밀리그램 / ML 교황과 20 μL의 μL 10 밀리그램 / ML POPC, 42의 216 μL를 전송 20 ML의 유리관에 CHCl 3 콜레스테롤 솔루션. </li><li> lipids의 박막은 유리병의 바닥에서 발견된 때까지 느린 흐름 아르곤 또는 질소 가스를 사용하는 유기 용제를 증발. </li><li> 잔류 용매를 제거하려면 최소 30 분 동안 진공 건조기에서 uncapped 유리관를 놓습니다. </li><li> TR버퍼의 ansfer이 ML은 이전에 하이드 레이트 lipids를로 유리관에, 0.2 미크론 필터를 통과했다. </li><li> ° C에서 하룻밤 4에 혼합 부화하고 48 시간 이내에 사용합니다. </li></ol> 2. 냉동 및 해동 : 30의 리포좀 크기 - 100 nm의 전용 <ol><li> 15 초동안 액체 질소의 리포좀 정지 고정. </li><li> 42에서 가열 블록을 사용하여 리포좀 서스펜션을 녹여 ° ~ 3 분정도 C의 온도. </li><li> 5 사이클 총 단계 2.1 및 2.2를 반복합니다. </li></ol> 3. 밀어냄 정확하게 그들의 가이드북에서 악기 개요를 사용 Liposofast LF-50 압출기를 조립하는 Avestin 지침을 따릅니다. <ol><li> 지원 필터 자료의 대형 홀 지원 화면 (원형 구멍이있는) 장소, 원형 소결 접시 (구멍없이) 한 배수 디스크 (직경 25 ㎜), 하나의 폴리 카보 네이트 막 (직경 25 ㎜)으로 따라갔다. </li><li> 작고 검은 놓으십시오지원 필터 기지로 확보하기 멤브레인 위에 O-링. </li><li> 4 해당 구멍에 4 개의 나사를 조이고으로 가기 필터 압출기을 첨부합니다. </li><li> 대형 압출기 배럴 아래로 필터 압출기 유닛을 조립. 실린더 배럴로 리포좀 솔루션을 추가합니다. 순서 압출 배럴 위에 다음을 추가하십시오 대형 원형 O-링, 좁은 모자, 큰 원형 O-링, 둥근 모자. </li><li> 압출기 배럴 위쪽에 가스 레귤레이터를 부착하여 압력 릴리프 밸브를 포함한 공기 누출을 방지하기 위해 모든 밸브를 닫습니다. 20 ML의 유리관 또는 압출기 필터 유닛 이하 50 ML Erlenmeyer 플라스크를 놓습니다. 안전 밸브 조절기에 연결되어 있고 압력이 600 PSI를 초과하는 경우에 공개할 것입니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다. </li><li> 질소 압력이 400 나노미터 liposomes, 100 나노미터 liposomes을위한 125 PSI, 30 나노미터 liposomes 용 400-500 PSI 25 PSI로 늘립니다. </li><li> 리포좀 susp 조심질소에 의해 강요되는 동안 ension 그것은 용기에 배출로. 더 이상 유리관에 압출기 필터를 통해 액체 전달을 관찰 않을 때까지 질소가 흐르는 유지. </li></ol> 4. 동적 라이트 산란 (DL을) 분석 <ol><li> 20 μm의 리포좀 용액의 50 μL를 준비합니다. </li><li> 전원 및 램프 소스를 켭니다. </li><li> DynaPro 소프트웨어를 엽니다. </li><li> 30 nm의 100 nm의와&gt; 100 나노미터 liposomes을 감지하는 알고리즘 MS800 모델의 liposomes를 검색하는 MS / X 알고리즘 모델에 소프트웨어를 설정합니다. </li><li> 하드웨어에 연결합니다. </li><li> 셀 홀더에 석영 cuvette 및 삽입 리포좀 샘플의 Pipet 14 μL. </li><li> 시작을 누릅니다. </li><li> 30 인수 - ~ 20 이후에 중지를 누르십시오. </li><li> 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 봉우리를 분석합니다. </li></ol> 5. Nanoparticle 추적 분석 (NTA) <ol><li> 500 μL, 0.1 μm의의 리포좀을 준비솔루션입니다. </li><li> 물과 에탄올과 샘플 격실을 씻어. </li><li> 보푸라기가없는 종이 타월로 샘플 격실을 건조합니다. </li><li> 레이저 전원과 컴퓨터를 켭니다. </li><li> 샘플 구획​​에 0.1 μm의 리포좀 용액 300 μL를 제공합니다. </li><li> 온도 제어 및 Nanoparticle 추적 분석 소프트웨어를 엽니다. </li><li> 레이저를 설정 버튼을 캡처 누르십시오. </li><li> 무대를 이동하고 현미경의 초점을 조정하기 위해 수평 및 수직 조정을 사용합니다. </li><li> 원하는 온도 (20 ° C)와 녹화 시간 (최소 30 초)로 설정합니다. </li><li> 시간의 지정된 금액에 대한 리포좀 입자의 여러 그림 프레임을 데리고 녹음 버튼을 누릅니다. 그것이 각 입자의 움직임을 추적으로 히스토그램의 직경 리포좀 크기에 해당하는 봉우리를 분석. </li></ol> 6. 대표 결과 압출 방법을 요약 스키마 P입니다그림 1에서 높았다. , 최적의 결과를 얻을 수 30 nm의의 직경과 liposomes의 준비는 ~ 500 PSI 및 100 nm의 직경의 높은 압력을 필요로하는 것은 빠른 필터 속도를 달성하기위한 125 PSI의 압력이 필요합니다. 400 nm의 직경을 보려면 ~ 25 PSI의 낮은 압력 vesicles가 크고 균질 liposomes을 길어지다 및 형성 있도록 느린 필터 율을, 달성하는 것이 좋습니다. 우리는 일관성있는 서브 마이크론 소포 크기를 생산을위한 최적의 압력을 결정하기 위해 일련의 실험을 실시 하였다. 우리는 압력뿐만 아니라 압출은 기공 크기 30, 100, 400 nm의 폴리 카보 네이트와 필터를 통과의 수를 다양하고 각각의 원하는 크기에 적절한 압력을 발견했다. 30 나노미터 모공의 경우, 500 PSI 아래의 압력은 신장 때문에 큰 소포 크기를 초래, 유속이 줄어 듭니다. 100 나노미터 모공의 경우 지속적인 흐름이 125 PSI에 달성되었다. 400 나노미터 모공의 경우, 낮은 압력 (25 PSI)는 vesicles가 큰 소포의로 길어지다하실 수 있습니다izes. 느린 드롭 현명한 여과 유량이 큰 서브 마이크론 vesicles 13 만들 최적입니다. 우리는 세 가지 직경의 크기, 즉 30, 100 400 nm의를 통해 압출 리포좀 크기를 결정하기 위해 DL을 수행했습니다. DL을이 입자 직경을 결정하기 위해 흩어져 빛을 수집 설립 방법입니다. 필터 구멍을 통해 오 패스 2 25 PSI에서 400 nm의 폴리 카보 네이트 막과 125 PSI에서 100 nm의 폴리 카보 네이트 멤브레인, 필터 기공을 통해 오 패스 500 PSI에 폴리 카보 네이트 30 nm의 막 통해 2 mm의 우리는 압출 충분 liposomes 필터 구멍을 통해 전달합니다. 30, 100 400 nm의 기공 크기 liposomes와 DL을 기준으로 측정의 직경 66 줄 ± 28, 138 ± 18 360 ± 25 nm의 (그림 2). 그것이 47 ± 16 nm의 직경을 기록한 그림 2와 같이 50 나노미터 폴리스티렌 구슬의 정지 보정 표준으로 사용되었다. 퍼센트 polydispersity은 리포좀 크기 사이에는 중복이 없다는 것을 보여줍니다. 그것은이 악기가 큰 입자를 12으로 가지고 알려진 편견으로 인해 DL을 분석을 사용할 때 30 nm의 이상의 직경을 관찰하는 것이 일반적입니다. 크고 작은 입자의 빛 산란 강도는 서스펜션 12 liposomes를 해결하는 하나의 검출 방법에서 동시에 수집하기 때문에 어렵습니다. 이 기악 제한에도 불구하고, 교정 곡선은 가까운 선형 상관 관계에 대해 설명합니다. NTA는 입자 굴절률이나 밀도 독립 액체 매질에서 확산의 직접적인 관찰에서 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이것은 고해상도 기술은 DL을 가진 liposomes의 측정을 보완하는 데 사용할 수 있습니다. NTA는 교정에 사용되었다 직경 95 ± 48 356 ± 51 nm의 두 100 nm의 400 나노미터 폴리스티렌 솔루션을 기록했다. 30 nm의 100 nm의의 지질 솔루션은 더 검색을 가지고 관찰되었다<html> 등 29 평균 크기는 ± 14, 95 ± 17, 359 ± 73 nm의 생산을, 그림 3에 표시된 DL을 비교한 경작할 직경. 1000 NM - NTA는 감도가 50의 입자를 측정할 수 있기 때문에 미세한 입자를 계량하기위한보다 일반적인 특성화 기법이 될 수 있습니다. 교정 곡선은 녹화된 NTA 직경 대 폴리 카보 네이트 멤브레인 모공 사이에 선형 상관 관계를 보여줍니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 리포좀의 크기 </td><td> 감지 임계값 </td><td> 예상 최소 입자 크기 (NM) </td></tr><tr><td> 30 nm의 </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm의 </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm의 </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> 표 1. Nanosight 매개 변수. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1. 설명 압출 방식의 플로우 차트, 어떻게 압력과 질소 유량은 다른 리포좀 지름의 균질성을 제어합니다. 리포좀 수화에 따라 다양한 크기의 unilamellar vesicles 다른 압력에서 다른 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터 모공을 통해 압출 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> 그림 2. 압출에 따라 양적 리포좀 크기를 설명하는 동적 라이트 산란 (DL을) 데이터. () 막대 그래프는 세 리포좀 샘플의 직경을 설명하기 위해 표시됩니다. 50 나노미터 폴리스티렌 (PS) 구슬의 보정 기준은 참고 자료로 사용되었다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플에 대한 막대 위에 표시됩니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 DL을 녹음한 직경에 대해 설명합니다. 비록 30 nm의 100 nm의 크기 레코드더 큰 400 nm의 크기가 약간 낮은 크기를 기록하면서 에드는 자신의 기공 크기보다 높은 가치, 교정 곡선 (B)는 X-축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 표현 근처 선형 상관 관계를 보여주고, y 축은 설명 DL을하여 리포좀 직경을 기록했다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> 압출 다음 리포좀 크기를 설명하는 그림 3. Nanoparticle 추적 분석 (NTA) 데이터. () 막대 그래프는 각 리포좀 시료의 직경을 나타냅니다. x 축은 솔루션을 통해 압출 있었다 그중 기공 크기를 설명합니다. y 축은 NTA에 의해 기록된 크기의 직경을 설명합니다. 평균 리포좀 지름은 각 샘플 위에 분류됩니다. (B) NTA 교정 곡선은 기록 직경 대 필터 멤브레인 기공 크기 사이에 DL을 교정 곡선보다 더 선형 상관 관계를 보여줍니다. x 축은 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공 크기를 설명. y 축은 NTA에 의해 기록된 리포좀 직경에 대해 설명합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> 그림 4. 압출 다음 각 리포좀의 크기 (500 μm의)를 보여주는 부정적 얼룩 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지. 물에 1 % Uranyl 아세트산 전에 34,000 × 확대 건조 및 이미징에 샘플을 착색하는 데 사용된 곳을 탄소 Formvar 메쉬 격자는 부정, 샘플 염색법 이전에 퇴원했다. 크기 30, 100, 400 nm의은 분명히 서로 별개입니다. 배율은 25,000 ×로 설정되었다. 눈금 막대는 0.5 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> 그림 5. 시간 코스 실험은 세 리포좀 크기와 함께 실시되었다. 동적 광 산란 (DL을)이 각각 리포좀 용액 후 즉시 압출을위한 측정되었다. 모든 리포좀 솔루션은 4에 저장된 °C 하룻밤. 그들의 지름은 하룻밤 배양 후 DL을하여 기록되었다. 아니 변화에 리틀은 16 시간 잠복기 후에 관찰되었다.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Avestin Liposofast LF-50 압출기를 사용하여, 우리는 얼마나 작은 크기, 합성 liposomes는 압력 제어 시스템을 통해 준비가되어 보여주었다. 그것은 multilamellar vesicles 작은 nanoparticles의 생산으로 이어질 수 리포좀 보습, 따라 자발적으로 형성 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이러한 작은 multilamellar vesicles은 필연적으로 대형 필터 기공 제작한 unilamellar vesicles의 솔루션에 이질의 원인, 대형 폴리 카보 네이트 멤브레인 기공의 크기를 통해 흐를 것이다. 따라서, 그것의 균질성 향상, 큰 기공 크기는 lipids에게 융합과 큰 vesicles로 길어지다 충분한 시간을주기 위해 (위의 설명에 400 nm의 직경 모공을위한 즉, 25 PSI)를 사용하는 경우 질소 흐름의 압력을 줄일 것을 권장합니다 솔루션입니다. &lt;100 nm의, 고압 (위에서 설명된 바와 같이 30과 100 nm의에 대한 즉, 400-500의 PSI)의 직경과 lip...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 02432-25ML </td><td> 95 %의 안정제 </td></tr><tr><td> 고급 메탄올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 압출기 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Phospholipids </td><td> 아벤티 폴라 Lipids </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 나란하고 세공 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td></td><td> 25mm 직경 </td></tr><tr><td> 디스크에게 PE 드레인 </td><td> Avestin 주식 회사 </td><td> 230,600 </td><td> 25mm 직경 </td></tr></tbody></table>

나노 크기의 지질 vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes는 광범위하게 단백질 - 단백질과 단백질 - 지질 상호 작용 3, 모니터 약물 전달 4,5, 그리고 캡슐 4 공부하는 플랫폼을 흉내낸 세포막로 사용되는 천연 및 합성 phospholipids로 이루어진 인위적으로 준비 vesicles 있습니다. Phospholipids 자연스럽게 마이셀에서 자신을 구별, 곡선 지질 bilayers을 작성 6. Liposomes은 전통적으로 bilayers, 즉 대형 unilamellar vesicles (LUVs), 작은 unilamellar vesicles (포드 SUV 차량용) 및 multilamellar vesicles (MLVs) 7의 크기와 수에 의해 분류됩니다. 특히, 다양한 크기의 균질 liposomes의 준비는 엔도와 exocytosis, 멤브레인 융합, 그리고 단백질 밀매 8, 세포 신호 전달에 중요한 역할을 막 곡률을 공부하는 것이 중요합니다. 400 - 여러 그룹은 단백질이 막 곡률을 포함하기 때문에 직경의 liposomes 준비 과정 &lt;100 조절하는 데 사용되는 방법 분석세포의 기능 3 자신의 행위를 파악하고 NM. 기타 차량에 관심 9 마약을 운반하고 전달로 liposomes을 공부하고, 리포좀은 마약 캡슐에 초점. 리포좀 형성 9시 보고된으로 약물 캡슐이 형성될 수 있습니다. 우리 압출 단계는 두 가지 이유로 캡슐화된 약물에 영향을 미치지 않습니다, 즉 (1) 약물 캡슐이 단계 이전에 달성되어야하고 (2) liposomes 안전 수성 코어에서 마약을 운반, 그들의 자연적인 biophysical 안정성을 유지한다. 이러한 연구 목표는 더욱 안정적인 서브 마이크론 지질 vesicles을 설계하기위한 최적의 방법에 대한 필요성을 제안합니다. 그럼에도 불구하고, 현재 리포좀 준비 기술 (sonication 10, 냉동 및 해동 10, 침전)이 biophysical를 제한 높은 일관성 및 효율성 10,5와 높은 곡면 (예 : 직경 &lt;100 nm의)에 liposomes의 준비를 허용하지 않습니다 emergi의 연구막 곡률 감지의 NG 분야. 여기, 우리는 생물 학적 관련 liposomes 다양한위한 강력한 준비 방법을 제시한다. 가스 기밀 주사기와 폴리 카보 네이트 점막 10,5를 사용하여 수동 압출은 일반적인 관행이지만 구멍 크기가 적용된 매뉴얼의 압력 변화로 인해로 인해 &lt;100 nm의 사용시 이질이 자주 관찰된다. 우리는 직경 30 nm의 400 사이의 범위 합성 liposomes를 준비하는 일정한 압력 제어 압출 장치를 채용. 동적 광 산란 (DL을) 10, 전자 현미경 11 nanoparticle 추적 분석 (NTA) 12 우리의 프로토콜에 설명된대로 상용 폴리스티렌 (PS) 교정 표준으로 사용되는 구슬과 함께 리포좀 크기를 계량하는 데 사용되었다. 근처의 선형 상관 관계는 우리의 압력 제어 리포좀 준비 높은 충실도를 나타내는업자 기공 크기와 실험적으로 결정 liposomes 사이에 관찰 충족되었다석탄통. 더 나아가, 우리는이 지질 소포 준비 방법은 여러 가지 리포좀 크기의 독립, 일반적으로 적용하는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 우리는 또한 최대 16 시간 동안이 준비된 liposomes 안정 것을 시간 코스 연구에서 증명하고있다. 대표적인 나노 크기의 리포좀 준비 프로토콜은 다음과 시연한다.

이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비<sup&gt; 1,2</sup&gt;, 리포좀 압출 및 크기 특성화는 제한된 표시됩니다.

나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법

리포좀은 천연 및 합성 인지질로 구성된 인공적으로 제조된 소포로, 세포막 모사 플랫폼으로 널리 사용됩니다...

다음 실험의 전반적인 목표는 생물학적으로 유효한 지질 소포를 제조하는 견고한 방법을 제시하는 것입니다. 이는 인지질을 유리 바이알에 혼합 및 전이시킨 후, 수성 완충액으로 수화시켜 다중 층판 SLE 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 동결-해동법을 수행하며, 이를 통해 다중 층판 소포로부터 단일 층판 소포를 생성합니다.다음으로, 결정된 최적 압력을 사용하여 리포좀 현탁액을 익스트루더(extruder)에 통과시켜 원하는 크기의 균일한 지질 소포를 생성합니다. 동적 광산란법(dynamic light scattering) 및 나노입자 추적 분석(nanparticle tracking analysis)을 통해 일관된 서브마이크론 크기의 소포가 형성되었음을 확인하는 결과를 얻었습니다. 초음파 처리나 침전법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 효율적인 지질 소포 크기 조절을 위해 최적화된 질소 유량이 적용된 압력 제어 시스템을 사용한다는 점입니다.이 절차를 시작하려면 Teflon 라이닝 캡이 있는 20 milliliter 유리 바이알을 준비하고, 오염을 방지하기 위해 사용 전 모든 유리 기구와 주사기를 클로로포름으로 세척하십시오. 250 microliter 밀폐형 유리 주사기를 사용하여 시약 등급의 클로로포름 100 microliters를 유리 바이알로 옮깁니다. 100 microliter 밀폐형 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리 바이알에 시약 등급의 메탄올 30 microliters를 추가하십시오.10 mg/mL POPC 216 µL, 10 mg/mL POPE 42 µL, 그리고 11 mg/mL 콜레스테롤 용액 20 µL를 20 mL 유리 바이알에 옮겨 2 mM POPC/POPE/콜레스테롤 지질 용액을 준비합니다. 바이알 바닥에 지질의 얇은 막이 관찰될 때까지 아르곤 또는 질소 가스를 천천히 흘려 유기 용매를 증발시킵니다. 뚜껑을 열어둔 유리 바이알을 진공 데시케이터에 넣고 최소 30분 동안 보관합니다.잔류 용매를 제거하기 위해, 이전에 0.2 micron 필터로 여과한 버퍼 2 mL를 유리 바이알에 옮겨 지질을 수화시킵니다. 혼합물을 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하며, 리포좀 크기가 30에서 100 nm인 경우 48시간 이내에 사용하십시오. 리포좀 현탁액을 액체 질소에 15초 동안 급속 냉동합니다.그런 다음 42 °C의 가열 블록을 사용하여 리포좀 현탁액을 약 3분 동안 해동합니다. 동결-해동 과정을 총 5회 반복합니다. 동결 후 해동을 수행하면 다중층 소포(multi lamella vesicles)로부터 단층 소포가 형성되며, 압출 과정 중의 지질 포집 효율이 향상됩니다.다음으로, Avastin 지침에 따라 lipo so fast LF 50 압출기를 조심스럽게 조립하여 압출을 준비하십시오. 질소 누출은 원하는 유속에 영향을 미치므로 올바른 조립이 매우 중요합니다. 성공적인 수행을 위해 다음 단계를 주의 깊게 진행하십시오.기밀 밀봉을 위해, 대공 지지 스크린을 지지 필터 베이스에 넣은 후 원형 센터 디시, 드레인 디스크 1개, 폴리카보네이트 멤브레인 1개를 순서대로 배치합니다. 멤브레인 위에 작은 검은색 O-링을 올리고 이를 지지 필터 베이스에 고정합니다.네 개의 해당 구멍에 네 개의 나사를 조여 상단 필터 압출기를 부착합니다. 대형 압출 배럴 아래에 필터 압출기 유닛을 조립합니다. 압출 배럴 상단의 실린더 배럴에 리포좀 용액을 넣습니다.커다란 원형 O-링, 좁은 캡, 커다란 원형 O-링 및 원형 캡을 배치합니다. 가스 레귤레이터를 압출기 배럴 상단에 부착하고, 압력 방출 밸브를 포함한 모든 밸브를 닫아 공기 누출을 방지합니다. 압출기 필터 유닛 아래에 20 milliliter 유리 바이알 또는 50 milliliter 삼각 플라스크를 놓습니다.안전 밸브가 레귤레이터에 연결되어 있으며, 압력이 600 PSI를 초과하면 압력을 방출합니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다. 질소 압력을 400 nanometer 리포좀의 경우 25 PSI로, 100 nanometer 리포좀의 경우 125 PSI로, 30 nanometer 리포좀의 경우 400 ~ 500 PSI로 높입니다. 질소에 의해 밀려나 리포좀 현탁액이 용기로 배출될 때까지 관찰합니다.액체가 더 이상 보이지 않을 때까지 질소 흐름을 유지하십시오. 압출 필터를 통해 유리 파일로 통과시켜 DLS 분석을 수행합니다. 먼저, 인산 완충 식염수 또는 PBS에 희석된 20 µM 리포좀 용액 50 µL를 준비하십시오.그 다음 전원과 램프 광원을 켭니다. dynapro 소프트웨어를 실행하십시오. 원하는 크기의 리포좀을 검출할 수 있도록 소프트웨어를 알고리즘 모델로 설정합니다.하드웨어에 연결한 후, 14 µL의 리포좀 샘플을 석영 큐벳에 피펫팅하여 셀 홀더에 삽입하고, 시작 버튼을 누릅니다. 약 20~30회 데이터 수집 후 정지 버튼을 누릅니다. 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 피크를 분석합니다. 나노입자 추적 분석은 PBS에 용해된 500 µL의 0.1 µM 리포좀 용액 준비로 시작하며, 샘플 챔버를 물과 에탄올로 헹굽니다.그 다음 보풀 없는 종이 타월로 시료 챔버를 건조합니다. 레이저 전원과 컴퓨터를 켜고 300 µL의 0.1 M 리포좀 용액을 시료 챔버에 주입합니다. 온도 제어 장치와 나노입자 추적 분석 소프트웨어를 실행합니다.캡처 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 수평 및 수직 조절 장치를 사용하여 스테이지를 이동시키고 현미경 초점을 조정합니다. 원하는 온도와 기록 시간을 설정하십시오.기록 버튼을 눌러 지정된 시간 동안 리포좀 입자의 사진 프레임을 여러 번 촬영합니다. 각 입자의 움직임을 추적하여 히스토그램에 나타나는 리포좀 크기 직경에 해당하는 피크를 분석합니다. DLS는 산란광을 수집하여 입자 직경을 결정하는 확립된 방법이며, 리포좀 크기를 측정하기 위해 수행되었습니다.수화된 리포좀을 서술된 프로토콜에 따라 다양한 크기와 압력의 폴리카보네이트 멤브레인으로 압출하였습니다. DLS로 측정한 리포좀의 직경은 30 nanometer 공극 크기의 경우 66 ± 28 nanometers였으며, 100 nanometer 공극 크기의 경우 138 ± 80 nanometers, 400 nanometer 공극 크기의 경우 360 ± 25 nanometers였습니다.직경 50 nm로 연마된 Irene 비즈 현탁액을 보정 표준물질로 사용하였으며, 측정된 직경은 47 ± 16 nm였습니다. 다분산 지수(percent poly dispersity)를 통해 리포좀 크기 간의 중첩이 없음을 확인하였습니다. DLS 분석은 큰 입자에 편향되는 특성이 있으므로, 일반적으로 30 nm보다 큰 직경이 관찰됩니다.이러한 기기적 한계에도 불구하고, 검정 곡선은 선형 상관관계를 나타냅니다. 나노입자 추적 분석(Nanoparticle tracking analysis)은 입자의 굴절률이나 밀도와 관계없이 액체 매질에서의 확산을 직접 관찰하여 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이 고해상도 기술을 DLS를 이용한 리포좀 측정의 보완 방법으로 사용할 수 있으며, 검정에 사용된 100 nm 및 400 nm 폴리스티렌 용액 두 가지에 대해 NTA로 기록된 직경은 각각 95 ± 48 nm 및 356 ± 51 nm였습니다.지질 용액은 DLS와 비교했을 때 더 유사한 직경을 나타냈으며, 평균 크기는 30 nm 공극 크기의 경우 29 ± 14 nm, 100 nm 공극 크기의 경우 95 ± 17 nm, 400 nm 공극 크기의 경우 359 ± 73 nm로 측정되었습니다. NTA는 50에서 1000 nm 크기의 입자를 측정할 수 있는 감도를 갖추고 있어, 미세 입자를 정량화하는 더 일반적인 특성 분석 기술이 될 수 있습니다. 검량선은 폴리카보네이트 막의 공극과 기록된 NTA 직경 사이에 선형 상관관계가 있음을 보여줍니다. 음성 염색 투과 전자 현미경 이미지에서는 압출 후 각 리포좀 크기가 30, 100, 400 nm로 서로 명확하게 구분됨을 확인할 수 있습니다.배율은 25,000배로 설정하였으며, 스케일 바는 0.5 microns를 나타냅니다. 세 가지 리포좀 크기로 시간 경과 실험을 수행하였습니다. 압출 직후 각 리포좀 용액에 대해 DLS를 측정하였습니다.모든 리포좀 용액은 4°C에서 하룻밤 동안 보관되었습니다. 하룻밤 배양 후 DLS를 통해 직경을 다시 측정하였습니다. 60시간의 배양 기간 후에는 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았습니다. 이 절차를 수행할 때, 압출 필터를 여러 번 통과시키면 베시코 용액의 균질성을 높일 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.또한, 클로로포름에 의한 폴리프로필렌 튜브의 용출로 인한 오염을 방지하기 위해 시료 준비 시 유리 바이알과 주사기를 사용하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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