나노 크기의 지질 Vesicles의 준비를 위해 지속적인 압력 제어 압출 방법
2012년 6월 22일
이 프로토콜은 균질성의 높은 수준과 함께 서브 마이크론 크기의 지질 vesicles을 준비하기위한 압출 방식을 설명합니다. 이 방법은 리포좀 준비 제어 질소 유량과 압력 제어 시스템을 사용합니다. 지질 준비 1,2, 리포좀 압출 및 크기 특성화는 제한된 표시됩니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 생물학적으로 관련된 지질 소포에 대한 강력한 준비 방법을 제시하는 것입니다. 이는 인지질을 혼합하여 유리 바이알에 전달하고 수성 완충액으로 수화하여 다중 라멜라 SLE 현탁액을 생성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 동결 및 해동 방법이 수행되며, 그 결과 다중 라멜라 소포에서 Ella Vesicles가 생성됩니다.
다음으로, 리포좀 현탁액은 결정된 최적 압력을 사용하여 압출기를 통과하여 원하는 크기의 균질한 지질 소포를 생성합니다. 동적 광 산란 및 나노 입자 추적 분석을 기반으로 일관된 서브미크론 소포 크기를 보여주는 결과를 얻었습니다. 초음파 처리 및 침전과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 효율적인 지질 소포 크기 준비를 위해 최적으로 결정된 질소 유속을 가진 압력 제어 시스템을 사용한다는 것입니다.
이 절차를 시작하려면 테프론이 안감을 덧댄 캡이 있는 20ml 유리 바이알을 꺼내고 오염을 방지하기 위해 사용하기 전에 모든 유리 제품과 주사기를 클로로포름으로 세척합니다. 250마이크로리터의 밀폐 유리 주사기를 사용하여 100마이크로리터의 시약 등급 클로로포름을 유리 바이알로 옮깁니다. 100마이크로리터 밀폐 유리 주사기를 사용하여 동일한 유리 바이알에 30마이크로리터의 시약 등급 메탄올을 추가합니다.
216 마이크로리터의 10 밀리리터 팝 C 42 마이크로리터를 10 밀리리터 당 밀리리터로 옮겨 2 밀리몰 pop C 양귀비 콜레스테롤 콜레스테롤 지질 용액을 준비합니다. 팝 e 및 20 밀리리터당 11 밀리그램의 마이크로 리터. 20ml 유리 바이알에 대한 콜레스테롤 용액은 바이알 바닥에서 지질의 박막이 관찰될 때까지 저속 아르곤 또는 질소 가스를 사용하여 유기 용매를 증발시키고 뚜껑이 없는 유리 바이알을 진공 건조제에 최소 30분 동안 놓습니다.
잔류 용매를 제거하려면 이전에 0.2미크론 필터를 통과한 2ml의 완충액을 유리 바이알로 옮겨 지질을 수화합니다. 혼합물을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하고 30-100 나노 미터 크기의 리포솜에 대해 48 시간 이내에 사용하십시오. 리포좀 현탁액을 액체 질소에서 15초 동안 제거합니다.
그런 다음 42도 SIU에서 약 3분 동안 가열 블록을 사용하여 리포좀 현탁액을 해동합니다. 총 5회 동안 동결 해동 과정을 반복합니다. 동결 및 후속 해동은 다중 라멜라 소포에서 Ella Les를 생성하고 압출 중 지질 포획 효율을 향상시킵니다.
다음으로, Lipo를 매우 빠르게 조심스럽게 조립하기 위해 Avastin 지침에 따라 압출을 준비합니다. LF 50 압출기의 올바른 조립은 바람직한 유속에 영향을 미치는 질소 누출을 방지하는 데 중요합니다. 성공을 보장하려면 다음 단계를 주의 깊게 수행하십시오.
기밀 밀봉을 생성합니다. 큰 구멍 지지 스크린을 지지 필터 베이스에 놓고 원형 중앙 접시, 배수 디스크 1개, 폴리카보네이트 멤브레인 1개를 놓습니다. 멤브레인 위에 작은 검은색 O-링을 놓고 지지 필터 베이스에 고정합니다.
4개의 해당 구멍에 있는 4개의 나사를 조여 상단 필터 압출기를 부착합니다. 대형 압출기 배럴 아래에 필터 압출기 장치를 조립합니다. 압출 배럴 상단의 실린더 배럴에 리포좀 용액을 추가합니다.
큰 원형 O-링, 좁은 캡, 큰 원형 O-링 및 원형 캡을 놓습니다. 가스 조절기를 압출기 배럴 상단에 부착하고 압력 릴리프 밸브를 포함한 모든 밸브를 닫아 공기 누출을 방지합니다. 20ml 유리 바이알 또는 50ml 삼각 플라스크를 압출기 필터 장치 아래에 놓습니다.
안전 밸브는 레귤레이터에 연결되어 있으며 압력이 600PS를 초과하면 해제됩니다. 질소 가스를 켜고 압출기에 연결된 가스 밸브를 엽니다. 질소 압력을 400 나노미터 리포좀의 경우 25 PSI, 100 나노미터 리포좀의 경우 125 PSI, 30 나노미터 리포좀의 경우 400 - 500 PSI로 높입니다. 리포좀 현탁액이 질소에 의해 밀려나면서 용기 안으로 배출될 때까지 관찰하십시오.
액체가 관찰되지 않을 때까지 질소를 계속 흐르게 하십시오. 압출기 필터를 통해 유리 파일로 통과시켜 DLS 분석을 수행합니다. 먼저, 인산염 완충 식염수 또는 PBS에 희석된 20마이크로몰 리포좀 용액 50마이크로리터를 준비합니다.
그런 다음 전원과 램프를 켭니다. dynapro 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어를 알고리즘 모델로 설정하여 원하는 크기에서 리포좀을 검출합니다.
하드웨어 피펫에 14마이크로리터의 리포좀 샘플을 석영 베트에 연결하고 셀 홀더에 삽입한 후 약 20-30회 획득 후 시작을 누르고 중지를 누릅니다. 히스토그램에 기록된 평균 리포좀 직경 피크를 분석합니다. 나노 입자 추적 분석은 PBS에 용해 된 500 마이크로 리터 0.1 마이크로 몰 리포좀 용액을 준비하고 물과 에탄올로 샘플 구획을 헹구는 것으로 시작됩니다.
그런 다음 보푸라기가 없는 종이 타월로 샘플 구획을 건조시킵니다. 레이저 전원을 켜면 컴퓨터가 300마이크로리터의 0.1몰 리포좀 용액을 시료 격실에 전달합니다. 온도 제어 장치와 나노 입자 추적 분석 소프트웨어를 엽니다.
캡처 버튼을 눌러 레이저를 켭니다. 수평 및 수직 조정을 사용하여 스테이지를 이동하고 현미경 초점을 조정합니다. 원하는 온도와 녹화 시간을 설정하세요.
기록 버튼을 눌러 지정된 시간 동안 리포좀 입자의 여러 액자를 촬영합니다. 각 입자의 움직임을 추적하는 히스토그램의 직경 리포좀 크기에 해당하는 피크를 분석합니다. DLS는 산란광을 수집하여 입자 직경을 결정하는 확립된 방법이며 리포좀 크기를 결정하기 위해 수행되었습니다.
수화된 리포좀은 서면 프로토콜에 설명된 대로 다양한 크기와 압력으로 폴리카보네이트 멤브레인을 통해 압출되었습니다. 30 나노미터 공극 크기에 대해 DLS로 측정한 리포좀의 직경은 66 플러스 마이너스 28 나노미터였습니다. 100 나노 미터의 경우 공극 크기는 138 플러스 마이너스 80 나노 미터이고 400 나노 미터 공극 크기는 360 플러스 마이너스 25 나노 미터였습니다.
50나노미터 광택 처리된 Irene 비드의 현탁액이 보정 표준으로 사용되어 47 플러스 또는 마이너스 16 나노미터의 직경을 기록했습니다. 퍼센트 폴리 분산도는 리포좀 크기 내에 중복이 없음을 보여줍니다. DLS 분석을 사용할 때 30나노미터보다 높은 직경을 관찰하는 것은 이 기기가 더 큰 입자에 대해 가지고 있는 바이어스가 알려져 있기 때문에 일반적입니다.
이러한 기기적 한계에도 불구하고 검량선은 비선형 상관관계를 설명합니다. 나노 입자 추적 분석은 입자 굴절률 또는 밀도와 무관하게 액체 매질에서 확산을 직접 관찰하여 각 입자의 크기를 측정하는 새로운 기술입니다. 이 고분해능 기술은 DLS로 리포솜 측정을 보완하는 데 사용할 수 있으며, NTA는 2개의 100 나노미터 및 400 나노미터 폴리스티렌 용액에 대해 95 플러스 또는 마이너스 48 나노미터 및 356 플러스 또는 마이너스 51 나노미터의 직경을 기록했습니다.
지질 용액은 30 나노 미터 공극 크기의 경우 29 플러스 또는 마이너스 14 나노 미터, 100 나노 미터 공극 크기의 경우 95 플러스 또는 마이너스 17 나노 미터, 400 나노 미터 공극 크기의 경우 359 플러스 또는 마이너스 73 나노 미터의 평균 크기를 생산하는 DLS에 비해 더 유사한 직경을 가지고 있습니다. NTA는 감도로 50-1000나노미터의 입자를 측정할 수 있기 때문에 미세한 입자를 정량화하는 보다 일반적인 특성화 기술일 수 있습니다. 검량선은 폴리카보네이트 멤브레인 일시 중지와 기록된 NTA 직경 음성 염색 투과 사이의 선형 상관관계를 보여줍니다.전자 현미경 이미지는 압출 크기 3, 100 및 400 나노미터에 따른 각 리포좀 크기를 보여주며 서로 명확하게 구별됩니다.
배율은 25, 000 배로 설정되었으며 눈금 막대는 0.5 미크론을 나타냅니다. 세 가지 리포솜 크기로 시간 과정 실험을 수행했습니다. DLS는 압출 직후 각 리포좀 용액에 대해 측정되었습니다.
모든 리포좀 용액은 밤새 섭씨 4도에서 보관되었습니다. 그들의 직경은 하룻밤 배양 후 DLS에 의해 다시 기록되었습니다. 60시간의 배양 기간 후 변화가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았습니다.이 절차를 시도하는 동안 압출 필터를 여러 번 통과하면 Vesco 용액 균질성이 향상된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.
또한 클로로포름의 폴리프로필렌 튜브에 의한 침출을 통한 오염을 방지하기 위해 샘플 준비를 위해 유리 바이알과 주사기를 사용하는 것을 잊지 마십시오.
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개요
이 프로토콜은 압력 제어 시스템을 사용하여 생물학적으로 관련된 지질 소포를 준비하기 위한 견고한 방법을 설명합니다. 이 방법은 서브 마이크론 크기의 지질 소포에서 높은 수준의 균일성을 보장합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 생화학
- 생물물리학
- 나노 기술
배경
- 지질 소포는 다양한 생물학적 응용에 중요합니다.
- 소니케이션과 같은 전통적인 방법은 일관된 크기를 제공하지 않을 수 있습니다.
- 압력 제어 시스템은 준비 과정을 향상시킬 수 있습니다.
- 동적 광 산란 및 나노 입자 추적은 크기 특성화에 사용됩니다.
연구 목적
- 지질 소포 준비를 위한 효율적인 방법을 제시합니다.
- 소포 크기에서 높은 수준의 균일성을 달성합니다.
- 이 방법의 효율성을 전통적인 기술과 비교합니다.
사용된 방법
- 수성 완충액과 인지질을 혼합하여 다중 라멜라 SLE 현탁액을 생성합니다.
- 동결 및 해동 방법을 적용하여 Ella 소포를 생산합니다.
- 리포솜 현탁액에 대한 최적의 압력으로 압출기를 사용합니다.
- 동적 광 산란 및 나노 입자 추적 분석을 통해 소포 크기를 특성화합니다.
주요 결과
- 일관된 서브 마이크론 크기의 소포가 달성되었습니다.
- 이 방법은 소니케이션 및 침전에 비해 장점을 보여주었습니다.
- 최적의 질소 유량은 준비 효율성을 향상시켰습니다.
- 결과는 생산된 지질 소포의 균일성을 확인했습니다.
결론
- 이 방법은 지질 소포 준비를 위한 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공합니다.
- 크기 일관성 및 균일성에 중요한 개선을 제공합니다.
- 압력 제어 시스템은 이 프로토콜의 주요 혁신입니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Consistent preparation of nano-sized lipid vesicles is critical for biopharma R&D, enabling reliable modeling of membrane dynamics and drug encapsulation studies. The constant pressure-controlled extrusion method addresses longstanding challenges in vesicle size homogeneity, supporting predictive confidence in early discovery and formulation workflows. This capability enhances translational continuity from mechanistic studies to preclinical evaluation of lipid-based delivery systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of membrane curvature effects on protein-lipid and protein-protein interactions.
- Supports functional validation of membrane-associated targets by providing uniform vesicle platforms.
- Facilitates mechanistic de-risking in studies of endocytosis, exocytosis, and membrane fusion.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, size-defined liposomes for standardized assay development.
- Improves assay reliability by minimizing vesicle heterogeneity and batch variability.
- Enables scalable preparation of vesicles for high-throughput compound screening and encapsulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides stable vesicle formulations for drug delivery and encapsulation research.
- Ensures continuity in vesicle properties from in vitro mechanistic studies to preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of lipid-based delivery candidates by demonstrating vesicle stability and size fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both mechanistic studies and formulation development for lipid-based therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on membrane curvature and protein trafficking using uniform vesicle systems.
- Screening: Provides assay-ready liposomes with validated size distributions for compound evaluation.
- Analytics: Employs DLS and NTA for quantitative vesicle size measurement and batch-to-batch comparability.
- Translational Research: Maintains vesicle stability and size for downstream preclinical and encapsulation studies.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, scalable platform for repeated vesicle preparation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane biology and drug delivery research.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation, reducing variability and manual error.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by ensuring reliable vesicle properties for downstream studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-based candidates through reproducible formulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid chemistry and vesicle characterization techniques.
- Needs access to pressure-controlled extrusion apparatus and analytical tools such as DLS and NTA.
- Demands rigorous cleaning protocols to prevent sample contamination.
- Adaptable to various lipid compositions and vesicle sizes as supported by protocol.
- Instrumental limitations in size measurement (e.g., DLS bias) should be considered in data interpretation.
