제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

다음 실험의 전반적인 목표는 부착성 세포 유형을 다양한 Combinator 미세환경 집합에 병렬로 노출시켜, 서로 다른 미세환경이 세포 기능에 미치는 영향을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 미세환경 단백질 혼합물의 흡수를 지원하는 프린팅 기판을 제작합니다. 그 다음 미세환경 단백질의 마스터 플레이트를 준비하며, 이를 이용하여 quill 또는 capillary pin 마이크로어레이 프린팅 로봇으로 ME 어레이를 프린팅합니다.

다음으로 미세환경 단백질의 마스터 플레이트를 준비합니다. 그 후, 세포 수를 제한하는 옵션을 선택하여 ME 어레이 상에서 부착 세포를 배양합니다. 도출된 결과는 면역형광 분석을 기반으로 하여, 서로 다른 미세환경이 분화 또는 증식과 같은 세포 기능에 미치는 영향을 보여줍니다.

우리는 처음에 인간 기억 줄기세포의 운명 결정에 조직 미세환경이 미치는 영향을 정량화하고자 할 때 이 방법 아이디어를 얻었으나, 생체 내(in vivo) 연구는 불가능하다는 것을 깨달았습니다. 현재 이 방법은 개발되어 세포 생물학, 연구 및 신약 개발 분야에서 다양하게 응용되고 있습니다. PDMS는 저렴하고 준비와 프린팅이 용이하며, 더 단단한 조직을 모사하는 기질로 사용됩니다.

하지만 PDMS의 소수성으로 인해 PDMS로 제작된 장치를 사용할 때 일부 세포주와 호환되지 않을 수 있습니다. 라텍스는 PDMS 중합을 억제할 수 있으므로 비라텍스 장갑을 사용하십시오. 일회용 플라스틱 컵에 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 베이스와 경화제를 10:1 비율로 혼합하고, 나무 또는 플라스틱 설압자로 세게 섞어 줍니다.

다음으로, 실온의 진공 벨(vacuum bell)에서 혼합물을 30분 동안 탈기합니다. 이제 스핀 코터(spin coater)의 구동 진공 척(vacuum chuck) 위에 표준 현미경 슬라이드를 중앙에 맞추고, 혼합된 엘라스토머 폴리머 0.5 milliliters를 슬라이드 표면 중앙에 떨어뜨린 후 6,000 RPM으로 60초 동안 스핀 코팅합니다. PDMS가 코팅된 슬라이드를 70 °C에서 4시간부터 하룻밤 동안 경화시킵니다.

슬라이드는 실온에서 밀폐하여 수개월 동안 보관할 수 있습니다. PA는 더 부드러운 조직을 모사할 수 있는 하이드로겔이며, PA 세포는 세포 부착을 지원하는 단백질이 존재하는 지점에만 부착됩니다. 수산화나트륨으로 슬라이드를 식각하는 것으로 시작하십시오.

슬라이드를 80 °C의 히트 블록 위에 놓습니다. 각 슬라이드에 0.1 N 수산화나트륨 1 mL를 떨어뜨립니다. PA가 실패하지 않도록 슬라이드 표면 전체를 반드시 덮어야 합니다.

수산화나트륨을 증발시켜 흰색 막이 남게 합니다. 표면이 완전히 덮이지 않은 경우 이 과정을 반복합니다. 필요한 경우 슬라이드는 실온에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.

다음으로, 흄 후드 내에서 슬라이드를 PES로 코팅합니다. 15 milliliter 접시에 슬라이드를 넣습니다. 수산화나트륨으로 식각된 각 슬라이드에 300 microliters의 PES를 첨가합니다.

APES를 수산화나트륨 슬라이드와 정확히 5분 동안 반응시킵니다. 더 오래 방치하지 마십시오. 슬라이드의 양면을 탈이온수로 2~3회 충분히 세척하여 APES를 씻어냅니다.

그렇지 않으면 다음 단계에서 슬라이드 위에 갈색 침전물이 형성되어 산화될 것입니다. 이제 슬라이드 표면의 모든 용액을 각 디쉬로 흡입하여 제거하십시오. PBS에 희석된 0.5% glutaraldehyde 25 milliliters를 첨가하십시오.

슬라이드를 암소에 두고 30분 동안 대기합니다. 30분 후, 슬라이드 표면에서 모든 glutaraldehyde 용액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 흡수성 먼지 없는 종이를 사용하여 슬라이드를 조심스럽게 건조시킵니다.

필요한 경우, 이제 슬라이드를 실온에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. PA 혼합물을 준비하고 탈기시킨 후, 중합 속도를 늦추기 위해 얼음 위에 둡니다. 얼음 위에 둔 각 혼합물로 슬라이드를 준비하기 직전에, ammonium per sulfate와 temid를 첨가하고 피펫을 사용하여 5~10초 동안 트리투레이션(tritrate)합니다.

이제 PA 혼합물을 슬라이드 표면에 피펫으로 분주합니다. PA의 양은 필요한 겔 경도에 따라 달라집니다. 그런 다음 기포 형성을 방지하기 위해 압력을 가하지 않은 상태로 PA 위에 유리 커버 슬립을 덮습니다.

PA 젤을 2시간 동안 중합시킨 후, 탈이온수 상태에서 커버 슬립을 제거합니다. PA 젤 슬라이드를 대형 코플란 자(coplan jars)의 물에 담가 하룻밤 동안 세척합니다. 다음 날, 반응하지 않은 아크릴아마이드를 제거하기 위해 PA 젤이 완전히 굳을 때까지 슬라이드를 건조합니다.

그 후 슬라이드는 밀폐된 슬라이드 보관함에 넣어 4°C에서 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 2챔버 슬라이드의 프린팅된 어레이를 둘러싸도록 플라스틱 챔버를 장착합니다. 챔버를 제거하고 면도날을 사용하여 절반으로 자릅니다.

1mL 피펫 팁을 사용하여 챔버 가장자리에 아쿠아리움 실리콘을 얇게 바른 후, 이를 Emmy 어레이 표면에 눌러 부착합니다. 이때 실리콘이 어레이의 어느 특징적인 부분에도 닿지 않도록 주의하십시오. 배양 웰을 Emmy 어레이에 단단히 부착하는 것이 매우 중요한데, 이는 웰의 부착 상태가 불량할 경우 챔버에서 배지가 누출되어 광범위한 세포 사멸이 발생할 수 있기 때문입니다.

PDMS 코팅 슬라이드의 경우, 겔 유형에 관계없이 수성 1% Pluronic F 108 내에서 진공 상태로 15분 동안 배양하여 슬라이드를 블로킹하고, 항생제가 포함된 세포 배양 배지로 어레이를 3회 헹구되 각 세척당 5분씩 수행합니다. 이는 반응하지 않은 단량체를 제거하기 위함이며, 특히 PA 겔의 경우 이러한 단량체가 세포에 독성을 나타낼 수 있습니다. 세 번째 세척 후, 겔을 재수화시키기 위해 배지 내에서 30분 동안 추가로 배양합니다.

이제 4~5개의 어레이를 15 cm 멸균 페트리 접시에 넣으십시오. 접시에 해당 응용 분야에 필요한 농도로 준비된 목적 세포가 포함된 최종 배지 부피의 절반을 추가합니다. ME 어레이는 사용 중인 세포 유형의 유지 관리에 적합한 배양기에 배치해야 합니다.

관찰하는 동안 15~20분마다 현미경으로 세포가 프린팅된 패턴에 균일하게 부착되었는지 확인하십시오. 부착된 세포와 부유 세포를 구분하기 위해 ME 어레이를 가볍게 흔들어 줍니다. 부착 시간은 다를 수 있으나, PA 코팅된 ME 어레이의 경우 일반적으로 2시간 이내에 완료됩니다.

부착 포화 상태에 도달하거나 시간 제한이 되었을 때, 결합하지 않은 세포를 흡입하여 제거하고 PDMS 코팅 ME 어레이의 디시를 최종 부피까지 채웁니다. 배지를 모두 제거하면 세포가 사멸하므로, 이 슬라이드에서 배지를 교체할 때는 순차적으로 배지 부피의 절반을 교체한 후 디시를 최종 부피까지 채우십시오.

일반적인 배지 교체를 통해 며칠 동안 배양을 진행할 수 있습니다. 파라포름알데히드, 알데히드, 메탄올 아세톤과 같은 일반적인 고정제는 Emmy 어레이 시스템과 호환됩니다. PDMS 코팅된 ME 어레이를 염색할 때에도 반드시 젖은 상태를 유지해야 함을 잊지 마십시오.

염색된 ME 어레이 슬라이드를 준비하기 위해 절반 부피 교체 기술을 계속 진행합니다. 면도날을 사용하여 챔버를 제거하고 플로라(flora)를 사용하여 커버 슬립을 장착합니다. G 단백질을 퀼 핀(quill pin)의 정사각형 팁 실리콘 핀을 사용하여 프린트된 PDMS 코팅 ME 어레이에 장착했습니다.

마이크로어레이 프린팅 로봇을 이용한 다양한 단백질의 증착은 항체를 이용한 면역형광법으로 확인되었습니다. 마스터 플레이트 내 단백질 용액의 희석 농도는 프린팅 기판 표면에 증착된 양을 반영하였으며, 세포들은 프린팅된 패턴을 따라 명확하게 부착되었습니다. 마찬가지로, Emmy 어레이를 40,000 패스 규모로 프린팅했을 때에도 동일하게 명확한 세포 부착 패턴이 나타났습니다.

PA gel 두 가지 미세환경 단백질이 인간 다능성 유선 상피 전구세포주에서 농도 의존적인 케라틴 발현 프로필을 유도했습니다. 케라틴 8 신호 대 케라틴 14 신호의 로그 비율은 신호의 변동성과 재현성을 보여줍니다. 24시간 배양 후, 결합되지 않은 세포들을 세척하여 제거하며 12개의 me 어레이를 분석합니다.

제1형 콜라겐과 재조합 인간 p-cadherin의 서로 다른 희석 배수가 케라틴 발현의 변화를 유도하는지 결정하기 위해 표준 통계 분석을 사용하였습니다. 초기에는 부착 직후 특징물 상의 세포들 사이에서 평균과의 차이가 없었습니다. 그러나 24시간 후, 고농도의 제1형 콜라겐은 유의미하게 더 높은 케라틴 8 발현을 유도하였습니다.

반면, 여기서의 고농도 PCA는 강력한 keratin 14 신호를 유도했습니다. 이러한 결과는 이능성 기억 전구세포(bipotent memory progenitor cells)에 관한 이전의 보고들과 일치합니다. 이러한 세포 미세환경 상호작용의 동적이고 상호 보완적인 특성으로 인해, 이 세포들 자체가 프린팅된 미세환경의 조성을 변화시킬 수 있습니다.

따라서 출력한 미세환경의 급성 영향을 이해하기 위해서는, 본 절차 이후 노출 시간이 48시간을 초과해서는 안 됩니다. 형광 또는 화학적으로 측정 가능한 모든 이론적 프로세스는 미세환경의 함수로 평가될 수 있으며, 이를 통해 '서로 다른 미세환경이 암 세포주의 약물 반응을 어떻게 변화시키는가?'와 같은 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이는 주로 세포 사멸 및 증식의 변화를 통해 확인 가능합니다.

또는 미세환경이 전구세포의 분화를 어떻게 변화시키는지에 대해 설명합니다.