체외에서 공동 감염 모델 Plasmodium falciparum - HIV-1 상호 작용

우리는을 개발했습니다

이 절차의 전반적인 목표는 인간 1차 단핵구 유래 대식세포에서 HIV 1의 복제에 대한 plasmodium fpar 감염된 적혈구의 효과를 연구하기 위한 시험관 내 모델을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 VEAC 시스템을 사용하여 플라스모듐(plasmodium), 파라 감염 가짜 적혈구를 분리한 다음 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염된 세포에 노출시킴으로써 이루어집니다. 다음으로, 적혈구에 노출된 단핵구 유래 대식세포는 완전 복제 HIV 또는 단일 복제 루시페라제 인코딩, HIV에 감염됩니다.

마지막으로, 배양 상등액은 루시페라제 인코딩 바이러스에 대한 완전 복제 바이러스에 대해 감염 후 3일, 6일, 9일 및 12일에 수확됩니다. 감염된 세포는 감염 72시간 후에 거짓말을 합니다. 궁극적으로, 바이러스 복제는 Eliza에 의한 상등액 내 HIV one P 24 capsid 단백질의 양을 정량화하여 모니터링할 수 있으며, 세포 용해물의 luciferase 정량화를 통해 바이러스 전사를 모니터링할 수 있습니다.

이 방법은 말라리아, HIV 동시 감염 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 플라스모디움 기생충에 의한 감염은 HIV 복제에 어떤 영향을 미칩니까? 이 방법은 대식세포에서 플라스모듐과 HIV 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었지만 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

예를 들어, 수지상 세포, 단핵구 또는 CD 4 T 세포는 절차를 시연하는 Guadalupe Andreani가 될 것입니다. 실험실의 박사후 연구원 배양판에서 적혈구를 채취하여 회수된 세포를 10ml의 단핵구 유래 대식세포 배지로 세척한 다음 펠릿을 12ml의 단핵구 유래 대식세포 배양 배지에 재현탁합니다. 이제 세포 현탁액을 Milton ECS 컬럼에 천천히 추가하고 새로운 배지로 컬럼을 한 번 세척한 후 현탁액이 흐르도록 한 다음 자석에서 제거하고 12ml의 단핵구 유래 대식세포 배양을 플러시합니다.

컬럼을 통해 배지를 통해 감염된 적혈구를 피하여 멸균관으로 들어가 단핵구 유래 대식세포를 감염되거나 감염되지 않은 적혈구에 노출시킵니다. 단핵구 유래 대식세포를 포함하는 이전에 준비된 24웰 플레이트의 각 웰에 적절한 적혈구 현탁액을 추가합니다. 4 시간 후 5 % 이산화탄소에서 섭씨 37도에서 공동 배양을 배양하고 적혈구를 포함하는 배지를 제거한 다음 600 마이크로 리터의 내독소가없는 PBS를 각각에 부드럽게 첨가하고 각 세척 직후 PBS를 3 번 흡인합니다.

이제 200 마이크로 리터의 얼음, 차갑고 멸균 된 물을 각 우물에 20 초 후에 적혈구가 흡입합니다. 그런 다음 600 마이크로 리터의 단핵구 유래 대식 세포 배양 배지를 각 웰에 배지하고 섭씨 37 도에서 24 시간 동안 배양하고 5 % 이산화탄소를 배양합니다. HIV에 대한 plasmodium false parem의 효과를 평가하기 위해, NL 4 개의 3 개의 BO IV 1 개의 바이러스를 포함하는 300 마이크로 리터의 단핵구 유래 대식 세포 배지에서 단핵구 유래 대식 세포의 1 복제를 이 그림에 묘사 된 프로토콜과 유사한 적절한 웰에 넣는다.

공동 배양을 2시간 동안 배양한 후 600마이크로리터의 내독소가 없는 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 600 μl에서 새로운 monocyte 유래 대식 세포 배지를 각 well에 공급하고 3, 6, 9 및 12 일에 공동 배양을 계속합니다.초기 바이러스 감염 후 회수 된 세포 현탁액을 200 μl의 신선한 monocyte 유래 대식 세포로 교체하여 각 snat의 200 μl를 수확합니다. 보통. 그런 다음 수확된 상등액을 섭씨 영하 20도에서 보관하여 나중에 Eliza가 분석할 수 있도록 합니다.

HIV에 대한 기생충의 영향을 결정하기 위해, 300 마이크로리터의 단핵구 유래 대식세포 배지에서 하나의 유전자 발현을 통해 본 문서에 예시된 프로토콜과 유사한 해당 웰에 대한 루시페라제 ENC 코팅 바이러스의 P 24를 함유하는 단핵구 유래 대식세포 배지를 배팅합니다. non luciferase ENC 코팅 바이러스에 대해 표시된 대로 코드 배양을 배양 및 세척한 후 감염 후 72시간 후에 배지를 제거하고 luciferase assay 200마이크로리터를 추가합니다. Hit lysis buffer는 이제 부드러운 흔들기로 실온에서 세포를 용해한 다음 섭씨 영하 20도에서 공동 배양액을 보관합니다.

플레이트를 해동한 후 각 웰에서 40마이크로리터의 용해물을 96웰 광도계 플레이트의 해당 웰로 이동합니다. 그런 다음 각각에 100마이크로리터의 luciferase 분석 키트 luciferase 기질을 추가합니다. 마지막으로 광도계에서 반딧불이 루시퍼라아제 활성을 측정합니다.

이 실험에서 제조업체의 지침에 따라 단핵구 유래 대식세포를 감염되거나 감염되지 않은 적혈구에 노출시킨 다음 NL 4 3 blen에 감염시켰습니다. 방금 시연된 바와 같이, 바이러스 단백질 P 24의 생산은 초기 바이러스 감염 후 다른 시점에서 무세포 상등액에서 HIV one P 24에 대해 ELIZA에 의해 모니터링되었습니다. 기생충으로 전처리된 단핵구 유래 대식세포의 상층에서 HIV one P 24 capsid protein에 의해 측정된 12일째에 바이러스 입자의 방출이 현저히 감소한 것에 주목하십시오.

이 실험에서는 단핵구 유래 대식세포를 감염된 적혈구와 감염되지 않은 적혈구에 노출시킨 다음 방금 설명한 바와 같이 루시페라아제로 인코딩된 바이러스에 감염된 다음 초기 바이러스 감염 후 72시간 후에 세포 용해물에서 루시페라제 발현을 평가했습니다. 외인성 VS를 보유한 이러한 바이러스에 의한 단핵구 유래 대식세포 감염. VG 또는 HIV one 당단백질은 p false spar에 노출된 세포에서 루시페라아제 생성을 현저히 줄였습니다. VSVG 의사 유형 바이러스는 VSPG 의사 유형 입자의 감염 효율이 더 높기 때문에 JRFL보다 훨씬 더 큰 루시퍼라제 활성을 나타냈다는 점은 주목할 만합니다.

이 기술을 통해 말라리아, HIV 동시 감염 분야의 연구자들은 여러 면역 세포 유형 연구에 적용할 수 있는 시험관 내 모델에서 이 두 병원체 간의 상호 작용을 탐구할 수 있습니다.