Name: 체외에서 공동 감염 모델 Plasmodium falciparum - HIV-1 상호 작용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 학습하세요 Plasmodium falciparum이 HIV-1 복제에 미치는 영향을 연구하는 체외 공동 감염 모델을 통해 말라리아와 HIV 공동 감염 메커니즘을 탐색하는 방법을 배우세요.

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이 작품은 촉매 공동 감염 및 공동 morbidities의 부여를 통해 건강 연구의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 인간의 적혈구는 센터 Hospitalier 드 난 Université 라발 혈액 은행에 의해 제공되었다.

주 : HIV-1과 Plasmodium falciparum과 실험이 적절한 biosafety 수준의 실험실에서 수행되어야합니다 (기생충에 대한 BSL2 및 BSL3 HIV-1과 공동 감염)과 잠재적으로 감염된 사람의 혈액을 사용할 때 특별한주의가 납치되어야합니다. 1. 말초혈 Mononuclear 세포 (PBMC) 정화 (8, 9 일 기준) <ol><li> anticoagulants (헤파린, 구연산, 산성 구연산의 덱스 트로 오스 또는 구연산 인산 덱스 트로 오스)로 치료가 건강한 기증자 (500 ML)에서 신선한 인간의 피를 함께 시작합니다. 정화 및 분리 PBMC하고 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 때 내독소없는 시약을 사용합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 함께 튜브를 포함한 혈액 가방, 소독, 튜브를 잘라 조심스럽게 T150 플라스크에 혈액을 전송합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브 (Ficoll는 실내 온도에 도달했음을 확인) 당 15 ML Lymphocytes 분리 매체 (Ficoll) 16 튜브를 준비합니다.위에 신선한 혈액을 조심스럽게 층 30 ML. </li><li> 20시 30 분 400 XG에서 원심 ° 떨어져 휴식 C #. </li><li> 원심 분리하는 동안 튜브 방마다 온도 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 25 ML 8 X 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 조심스럽게 HBSS (튜브 당 수영장이 휴대폰 고리)를 포함하는 50 ML 튜브로 인터페이스에서 흐린 셀 링 (PBMC를 포함) 전송합니다. HBSS로 50 ML에 볼륨을 작성합니다. </li><li> 20 15 분 150 XG에서 원심 °에서 휴식도 C #. </li><li> 흐린 셀 링의 원심 분리하는 동안, Ficoll 단계, 50 ML 원뿔 튜브를 채울 수영장 플라즈마에서 노란색 상위 레이어를 수집합니다. ° C에서 30 분 동안하고 1,800 X g에서 10 분 스핀 56시 50 ML 튜브를 가열하여 플라즈마에 보완 Inactivate. 뜨는 (나중 단계에서 중간 보충으로 사용할 수 있습니다 포함되어 있습니다 희석 autologous 플라즈마)를 유지. </li><li> 조심스럽게 뜨는 및 resuspen를 제거D 50 ML 관 당 HBSS와 수영장이 알약의 25 ML의 1.7 단계에서 세포 펠릿. 20 ° C.에 8 분 300 XG에 스핀 </li><li> 신중하게 뜨는을 제거 한 50 ML 튜브 10 ML의 HBSS와 수영장에서 알약을 resuspend. </li><li> , 나누어지는을 가지고 사망률을 평가하기 위해 trypan 파랑 배제를 수행하고 PBMC를 계산합니다. </li><li> HBSS 300 X g에서 10 분 스핀과 함께 50 ML 완료 볼륨. 표면에 뜨는를 제거하고 (하나는 혈액 500 ML에서 400-500 X 10 6 PBMC 주위를 취득한다) 5x10 6 셀 / ML에 RPMI 1640에서 셀을 resuspend. </li></ol> 2. Monocytes - 유래 Macrophages (MDM) 차별 (8, 9 일 기준) <ol><li> RPMI 1640 (25 ML / 접시)와 15cm 요리의 씨앗 약 1.25 X 10 8 PBMC. </li><li> 세포가 5 % CO 2 분위기로 37 ° C에서 1-2 시간 동안 준수합시다. </li><li> 새로운 플라스크에 비 준수 세포를 전송 15 ML 내독소없는 PBS 회 (5 판을 씻어분, 300 XG). 준수 세포 절연 monocytes 있습니다. </li><li> 갓 격리 monocytes가 MDM으로 차별화하도록하려면 5 % autologous 플라즈마 (단계 1.8부터)와 함께 보충 RPMI 1640 배지의 20 ML에 추가합니다. 인간 재조합 대식 세포의 콜로니 자극 인자 (M-CSF, 25 NG / ML) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 솔루션 (PS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신)를 추가합니다. 2 일 품어, 중간을 변경할 37 5퍼센트에서 ° C에서 CO 2 분위기에서 2-3 여분 일 부화. </li><li> 오래된 매체를 제거하고 내독소 무료 PBS로 한 번 씻고, PBS를 부드럽게 추가하고 즉시 기음. 완전히 차별 MDM를 분리하려면, 5 % CO에서 37 ° C에서 15-20 분 ~ 7 ML Accutase (Accutase, 플라스틱 접시에서 세포의 분리를 허용 프로 테아제와 collagenolytic 활동의 상용 믹스)와 세포 치료 이 분위기, 중간 시간에 부드럽게 신난다. </li><li> (세포를 보호하는 데 도움이되는 동안 각 플레이트에 3-5 ML autologous 플라즈마를 (단계 1.8에서) 추가) 부서. </li><li> 부드럽게 매체가 50 ML 튜브의 모든 시간과 전송 / 수영장에서 전지를 다루고 있는지 확인하는 세포가 다쳤어요. </li><li> 가능한 많은 세포로 복구하는 내독소 무료 PBS로 번호판을 씻어. </li><li> 뜨는 삭제, 200 XG에서 5 분 던가. </li><li> 5 ML MDM 문화 매체 (RPMI 1640 10% 보완-inactivated 태아 소 혈청 (iFBS), PS, 25 밀리미터 HEPES와 보충)와 카운트 세포 (MDM 총 PBMC의 보통 2~8%를 얻을)에 Resuspend 펠릿. 참고 : MDM의 나누어지는가 유동세포계측법하여 세포 인구 순결을 평가하기 위해이 단계에서 넘어 수도 있고 보통은 99 % MDM 급행 CD14을 획득하였습니다. </li><li> 24 잘 접시에 잘마다 MDM 문화 매체 600 μl의 씨앗 1x10 5 MDM. </li><li> 감염 전에 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 3. HIV-1 바이러스성 주식의 생산 및 Quantitation <ol><li> HEK293T 세포 follo에 칼슘 인산염 transfection을 사용하여 바이러스 주식을 생산Fortin 외의 날개 프로토콜. 10. </li><li> R pHCMV-G의 +와 10 μg, 또는 NL4.3 룩의 15 μg - 중 NL4.3 루크 + 환경을 20 μg으로 루시페라제 인코딩 리포터 유전자를 포함하는 단일 사이클 바이러스, 공동 transfect HEK293T 세포를 얻기 위해 + 유럽 표준안 - R +와 pJRFL 유럽 표준안 중 15 μg. + 제어 당단백질 - 결함 바이러스를 생성 R - NL4.3 루크 + 환경을 30 μg을 사용합니다. 완전 replicative 바이러스의 경우 NL4.3Bal 유럽 표준안의 30 μg을 사용합니다. 벡터 pHCMV-G와 pJRFL 유럽 표준안은 각각 소낭성의 구염 바이러스의 봉투 glycoproteins (VSV-G)를 인코딩 및 CXCR5 - 열대 HIV-1 (NL4.3Bal 유럽 표준안 다를)으로. plasmids에 대한 자세한 내용은 8에서 얻을 수있다. Plasmids는 NIH 에이즈 연구 및 레퍼런스 프로그램 (NIAID, NIH)을 통해 얻을 수있다. </li><li> HIV-1 p24 capsid 단백질 11 엘리사를 사용하여 모든 바이러스 주식을 수량그리고 사용하기 전에 자신의 감염 가능성을 확인합니다. 우리는 TZM-BL 표시기 세포 12 사용을 통해 바이러스 주식의 감염을 평가. </li></ol> 4. Plasmodium falciparum의 기생충의 문화 (13 기준) 기생충 4.1 일반 문화 및 유지 보수 <ol><li> P.를 유지 0.5 % (W / V) Albumax II, 25 μg / ML Gentamicin과 보완 RPMI 1640의 4 % 혈소판 (25 MM HEPES 및 25 밀리미터 NaHCO 3 버퍼)에서 인간의 적혈구 (혈액 그룹 O +)의 falciparum 3D7 성별이없는 무대 기생충 37시 370μM의 Hypoxanthine 질소의 1 % 산소 / 5 % 이산화탄소의 혼합 기체에서 ° C #. </li><li> Parasitemia는 문화의 얇은 얼룩을하고 15 % Giemsa 용액으로 더럽히는 것으로 모니터링할 수 있습니다. </li><li> 기생충은 컨트롤로 사용할으로 항상 동일한 조건에서 감염되지 않은 적혈구 (uRBC) 문화 요리를 유지합니다. 늦은 무대 parasit를 구하려면초밖에 (trophozoites / 조기 schizonts)는 다음과 같이 기생충을 동기화 : </li></ol> 4.2 기생충 동기화 <ol><li> 아침에 300 XG에서 스핀 5 분 기생충 문화를 수확하고 뜨는 버리고. </li><li> 5% (W / V) 37시 D-Sorbitol 및 부화 5 분 ° C. 5 만원 셀 볼륨에 Resuspend 펠릿 </li><li> 300 X g에서 5 분 던가, 30 ML 문화 매체에 뜨는, resuspend 펠릿를 버리고 인큐베이터에 다시 넣어. </li><li> 약 8 시간 후 반복 단단히 동기 기생충을 얻기 위해 4.2.3에 4.2.1 단계를 반복합니다. 늦은 무대 기생충 (trophozoites / 조기 schizonts)은 다음 실험을 수행하기 위해 다음날 아침 수확한 수 있습니다. 이전 정화하기 전 라이프 사이클 단계를 확인하는 Giemsa의 염색법을 수행합니다. </li></ol> 4.3 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (iRBC) 정화 <ol><li> 70 % 에탄올과 P로 VarioMacs 분리기 (스탠드와 자석)을 소독생물 학적 후드 밑에 레이스. </li><li> CS 열 아래로 세 방향 꼭지를 수정합니다. </li><li> Miltenyi 특수 커터와 바늘 플라스틱 프로텍터의 끝을 잘라 꼭지 바닥에 바늘을 고정시킨다. </li><li> 신중 자석에 열을 잠금. </li><li> 천천히 꼭지의 왼쪽에 엉망 키트 - 동봉된 주사기로 MDM 문화 매체의 10 ML을 주입하여 열에있는 모든 공기 방울을 제거합니다. </li><li> ~ 20 ML MDM 문화 매체에 칼럼을 씻으십시오. </li><li> 문화 판에서 수확 RBC는 10 ML MDM 매체 (300 XG, 5 분)로 한번 씻어 및 12 ML의 MDM 문화 매체에서 RBC 펠렛을 resuspend. 천천히 열을 추가하고 (trophozoite 또는 schizont 단계에 기생충을 포함하는 유일한 감염된 적혈구 인해 hemozoin 크리스털의 존재에 자기장에 의해 유지됩니다)를 통해 서스펜션 흘러가게. </li><li> 20 ML 매체로 한번 씻어하고 열의 맨 위에있는 흰색 디스크에 도달하면 액체 흐름을 중지합니다. </li><li>12 ML MDM 문화 매체와 깨끗한 무균 튜브에 자석 및 elute의 iRBC에서 열을 제거합니다. </li><li> 비방 회수 iRBC의 나누어지는과 Giemsa은 라이프 사이클 단계를 확인 더럽히는 것 수행합니다. </li><li> 혈구계 (격리된 RBC 100 % iRBC입니다)를 사용하여 복구 iRBC 세어보세요. </li><li> 펠렛 전지 (300 XG, 5 분), 뜨는 버리고 500 μl 신선한 AB + 인간의 혈청 (opsonisation 단계 14)로 세포를 치료. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 원하는 농도로 iRBC 10 ML MDM 문화 매체 박스 (300 x G, 5 분), 그리고 resuspend에 한번 씻는다. 보통 10 % parasitemia 15cm 배양 접시는 대략 ~ 0.5-1x10 8 단단히 동기 iRBC을 제공합니다. </li></ol> 5. Plasmodium falciparum에 대한 MDM의 노출 <ol><li> 75:1의 MDM : uRBC 또는 iRBC에 대한 MDM을 폭로하기 위해 세포 uRBC / iRBC의 비율을 얻기 위해 MDM 문화 매체에 resuspended해야합니다. 이전에MDM을 포함하는 준비된 24 잘 접시, 각도에 적절한 RBC 서스펜션 볼륨을 추가합니다. 세중의 모든 실험을 수행합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 4 시간을위한 공동 문화를 품다. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. </li><li> 나머지 RBC를 lyse하려면 20 초 및 대기음을 위해 얼음처럼 차가운 멸균 물 200 μl를 추가하여 우물을 씻는다. </li><li> 600 μl MDM 문화 매체를 추가하고 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 24 시간을 품어. </li></ol> 6. 완전 Replicative HIV-1과 MDM의 감염 <ol><li> P.의 효과를 평가하기 위해서는 MDM의 HIV-1 복제의 falciparum은 그림 1A, 해당 우물의 NL4.3Bal 유럽 표준안 바이러스의 p24의 10 NG (MDM 미디어 300 μl의)에 명시된 방식에 따라 추가, 컨트롤 우물에서만 MDM 매체를 추가하십시오 . </li><li> 5에서 37 ° C에서 2 시간을 품다% 2 분위기를 공동. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회와 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 일 3, 6, 9 및 12은 수확 후 신선한 MDM 매체 200 μl를 추가, 각 뜨는 200 μl, 바이러스 감염의 시작에 따라. Fortin 외 10. 따라 엘리사하여 주요 HIV-1 p24 capsid 단백질의 quantitation 위해 -20 ° C에서 수확 supernatants 보관하십시오. </li></ol> 7. 단일 사이클 바이러스 인코딩 루시페라제있는 MDM의 감염 <ol><li> R + (- MDM에서 HIV-1 유전자 발현에있는 기생충의 영향을 결정하기 위해서는, 10 NG p24 (MDM 매체 300 μl)을 NL4.3 루크 + 환경을 하나의, 그림 1B에서 설명한 방식에 따라, 추가 VSV-G), NL4.3 루크 + 환경을 - R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 루크 +유럽 ​​표준안 - 해당 우물의 R은 + 바이러스. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 2 시간을 품어. </li><li> 내독소없는 PBS 3 회 600 μl로 세포를 씻어, 부드럽게 PBS를 추가하고 즉시 기음. 잘마다 신선한 MDM 매체 600 μl를 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 매체 72 시간 다음과 같은 감염을 제거하고 용해 버퍼 1X (루시페라제 분석 키트와 함께 제공되는) 200 μl를 추가합니다. 세포가 부드러운 진동과 함께 실온에서 lyse하자. -20 ° C.에 저장 </li><li> 접시를 해동하고 96 잘 luminometer 플레이트에 lysate 40 μl를 전송, 루시페라제 기판의 100 μl을 (루시페라제 분석 키트와 함께 제공)을 추가하고 제조 업체의 지침에 따라 luminometer에서 루시페라제 (반딧불 루시페라제) 활동을 측정합니다. </li></ol> 8. 대표 결과 우리의 공동 감염 모델을 사용하여, 우리는 그 exposur를 보여P.의 전자 MDM의 falciparum는 HIV-1 감염에 그들의 자화율을 낮춥니다. 실제로 상당한 감소 (P는 &lt;0.05, 2 방법으로 ANOVA, 하루에 12)와 같은 표면에 뜨는에서 HIV-1 p24 capsid 단백질에 의해 측정된 바이러스 입자의 릴리스는, 기생충 (그림 2A)와 pretreated MDM에서 관찰된다. 이러한 관찰은 루시페라제-리포터 유전자를 인코딩 바이러스에 감염된 세포에 확인됩니다. 외인성 VSV-G 또는 HIV-1 glycoproteins 중 하나를 품고 같은 바이러스와 MDM 감염은 P.에 노출된 세포에서 현저하게 (P &lt;0.05, 학생의 T-테스트) 이하 루시페라제 생산에 이르게 falciparum (그림 2B). 그것은 VSV-G-pseudotyped 바이러스들이 JRFLenv 대응보다 훨씬 큰 루시페라제 활동을 발생한 주목할만한이며 이것은 VSV-G pseudotyped 입자 15보다 감염의 효율성 때문입니다. 기생충 박람회가 MDM의 영향으로 바이러스의 두 유형이 그것이 바이러스성 유전자 전처의 일부 단계에 영향을 미치는 것이 좋습니다 것을 감안할 때pression (그림 2B). 그것은 그 세포 생존 능력이 지켜지 억제가 세포 사망으로 인한 구체적이고 없다는 것을 나타냅니다 iRBC (데이터가 표시되지 않음)으로 MDM 박람회에 의해 영향을받지되었다 언급하는 것도 중요하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig1.jpg" /> 1 그림. 완전 replicative 바이러스와 MDM 감염) 플레이트 체계 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구에 노출 세포. 발 :. NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / uRBC에 감염된 세포 : 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3Bal 유럽 표준안 발 / iRBC 감염 :.. MDM 감염 iRBC 및 NL4.3Bal 유럽 표준안 B로 감염된에 노출된 세포) 플레이트 방식으로 단일 사이클 루시페라제 인코딩 바이러스 모의 :. 감염되지 않은 세포. uRBC : 감염되지 않은 적혈구에 노출 세포. iRBC : 전지는 Plasmodium falciparum-I에 노출적혈구를 nfected. Δenv : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + JRFL :. NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-G : NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (vsv-G) Δenv / uRBC :.. 세포 uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을-R + Δenv / iRBC 감염 : 세포 iRBC에 노출 그리고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 - R + JRFL / uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안).. JRFL / iRBC : iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (JRFL 유럽 표준안). vsv-g/uRBC : uRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 세포 - R + (vsv-G) vsv-g/iRBC :. 전지 iRBC에 노출하고 NL4.3 루크 + 환경을 감염 - R + (vsv-G). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/&gt; 그림 2. 4. 시간을 위해 MDM)과 광범위하게 씻겨 : MDM의 HIV-1 바이러스 제작에 대한 Plasmodium falciparum의) 효과 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 노출되었다. 세포는 2 시간에 대한 p24 NL4.3Bal 유럽 표준안의 10ng에 감염되었다. 바이러스성 생산 초기 바이러스 감염에 따라 다른 시간 지점에서 셀 - 무료 뜨는에서 HIV-1 p24에 대한 엘리사에 의해 감시되었다. . 대표 실험은 MDM의 HIV-1 바이러스의 전사에 대한 Plasmodium falciparum의 B) 효과를 보이고있다 MDM이 비율은 75:1 (uRBC / iRBC에서 uRBC 또는 iRBC에 감염되었습니다. MDM). 루크 + 환경을 R + (JRFL 유럽 표준안) 또는 NL4.3 - - R + NL4.3 루크 + 유럽 표준안 - 셀 그런 다음 단일 사이클 바이러스의 p24의 10ng (중 NL4.3 루크 + 환경을 감염된 R + (vsv- G)). 루시페라제 표현이 세포는 초기 바이러스 감염에 따라 72 시간을 lysates에서 평가되었다. 대표 실험이 나타납니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

우리는 바이러스성 유전자 발현이나 단핵구 파생 macrophages의 자손 바이러스 생산과 복제 중 하나를 분석하여 HIV-1 바이러스 사이클, 즉에서 말라리아 기생충의 영향을 분석하는 두 가지 방법을 그림했습니다. 비슷한 접근 방식은 다른 HIV-1-기생충 공동 감염 16에 사용되었습니다. 그러나 이러한 새로운 데이터는 말라리아 - HIV-1 감염의 공동 조사에서 앞으로 단계입니다. . 실제로 Diou 외 8 HIV-1 복제에 hemozoin의 영향 살지 기생충을 연구, 우리의 결과와 합의, 그들은 MDMs hemozoin는 MDM에 의해 바이러스 생산을 억제하기 위해 자체는 충분한 것을 관찰하고, 아닙니다. 설명 실험적 레이아웃을 사용하여, 우리는 관찰 그 P. falciparum은 macrophages의 HIV-1 replicative 사이클에 대한 명확한 해로운 영향을 미치는 : 바이러스성 생산의 중요한 억제가 macrophages 기생충에 미리 노출에서 관찰된다 (Figur전자 2A) 및 바이러스성 전사에 기생충의 구체적인 영향은 그림 2B에 그림 있습니다. 그러나 바이러스성 항목이나 핵융합 기생충의 추가 효과 (decapsidation), 또는 단백질 합성 또는 바이러스성 입자 조립 및 신진 등 사후 통합 메커니즘,에서를 떠날 수 없어요. 또한, 그것은 기생충이 바이러스와 동일한 시간 또는 다음 MDM 감염에 하나 추가된 경우 HIV-1 복제에 다른 영향을받을 것이 가능합니다. 우리는 시험 관내 공동 감염 모델에서 HIV-1 / P. 대한 세부 조사를 수행하는 강력한 도구를 제공합니다 숙주 세포의 상호 작용 falciparum. 예를 들어, 대상 및 바이러스성 retrotranscription와 숙주 세포의 게놈에 바이러스성 게놈 통합에 대한 구체적인 절차를 정할 수있는 정량 실시간 PCR, 같은 다른 기술을 사용하여이 실험적인 레이아웃의 조합은 아주 가능하며 추가 insi를 양보해야공동 감염에 관여하는 메커니즘에 ghts. 또한, 구체적인 assays 더욱 바이러스성 복제에 대한 효과를 분석하는이 기본 프로토콜에 적용할 수있는 바이러스성주기 (바이러스성 융합, decapsidation, 입학 quantitation)의 초기 단계를 평가합니다. 실제로도 표준 HIV-1 반전 transcriptase의 quantitation의 assays는 알만 HIV-1 p24 위해 엘리사를 대체할 수있는 삼중 수소 - 라벨이 세포핵을 사용하여 이러한 수정이 프로토콜은 HIV-1 quantitation 및 검출에 관한 방법에 유연성을 보여줍니다. MDM 이외에도, 우리는 우리의 시스템이 다른 세포 유형과 같은 monocytes와 돌기 세포와 같은 HIV-1-말라리아 상호 작용에 대한 관련성이 높은 적응력을 기대합니다. MDM은 자기편 세포가있다는 사실은 어떤 macrophages를 제​​거하지 않고도에서 촬영되지 않았거나 MDM과 접촉에 그 iRBC 밖으로 세척 용이를 위해 수 있도록, 그들의 조작을 용이하게합니다. 이러한 이점은 SE를 복잡하게, 정직에서 배양해되어 돌기 세포 및 monocytes, 사용자에게 적용되지 않을 것입니다같은 세포가 우리가 현재이 문제를 해결하고있는 uRBC 및 무료 iRBC의 paration. Google 시스템은 또한 이러한 공동 배양 실험에서 CD4 양성 T 세포 같은 다른 면역 세포에서 HIV-1 바이러스의 생리주기에 Plasmodium 노출 단핵구 파생 세포의 효과와 같은 더 복잡한 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 프로토콜은 P.의 효과를 보는 실험에 적합 될 수 HIV-1에 감염된 개인을위한 PBMC에서 HIV-1 재가입에 falciparum의 iRBCs. 윤리 명세서 인간의 PBMC는 센터 Hospitalier 드 난 Université 라발 연구 센터 생명 윤리위원회의 지침에 따라, 건강한 기증자의 혈액에서 얻은되었다. 서면동의 모든 혈액 기증자로부터 얻은 것입니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Multicell </td><td> 350-000-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS-내독소 무료 </td><td> 시그마 </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Wisent </td><td> 080-150 </td><td> 30 분 동안 56 ° C에서 열 inactivated </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4555-56 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax II </td><td> Gibco </td><td> 11021-037 </td><td> RPMI 1640에 녹아있는, 필터 - 살균 </td></tr><tr><td> 림프구 분리 매체 </td><td> Multicell </td><td> 305-010-CL </td><td></td></tr><tr><td> 화이트 luminometer 플레이트 </td><td> Promega </td><td> Z3291 </td><td></td></tr><tr><td> CS Mac에서 분리 columms </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-041-305 </td><td></td></tr><tr><td> VarioMacs 분리기 </td><td> Miltenyi 생명 공학 </td><td> 130-090-282 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 용액 </td><td> Wisent </td><td> 450-201-EL </td><td></td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S1876 </td><td></td></tr><tr><td> 셀 스크레이퍼 (25 ㎝) </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1830 </td><td></td></tr><tr><td> 24 음 세포​​ 배양 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,047 </td><td></td></tr><tr><td> 150 X 20mm 배양 접시 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td></td></tr><tr><td> M-CSF </td><td> Genscript </td><td> Z02001 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 혈청 AB + </td><td> 밸리 바이오 메디컬 </td><td> HP1022 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Wisent </td><td> 311-505-CL </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1397 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxanthine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H9636 </td><td></td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 루시페라제 분석 시스템 </td><td> Promega </td><td> E1500 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 적혈구 </td><td></td><td></td><td> 획득은 철이 혈액 은행에서 정화. </td></tr></tbody></table>

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - hiv-1 상호 작용

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, 말라리아의 가장 치명적인 형태의 원인이되는 에이전트, 인간 면역 결핍 바이러스 타입 -1 (HIV-1)은 연간 1 천 4 백 사망자의 총 책임이되고, 세계적으로 가장 중요한 건강 문제 중입니다. 특히 개발 지역, 사하라 사막 이남의 아프리카, 말라리아와 HIV-1과 공동 감염은 흔히 있지만,이 두 질환 사이의 상호 작용에서 자신의 광범위한 중복으로 인해이 저조한 이​​해된다. 역학 보고서 말라리아 감염이 transiently HIV-1 복제를 강화하고 공동 감염된 개인 2,3에서 HIV-1 바이러스 부하를 증가 것을 제안했습니다. 이 viremia가 antimalarials 치료 후 몇 주 동안 높은 유지하기 때문에,이 현상은 질병의 진행 및 전송에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 관측 뒤에 세포 면역 메커니즘은 기뻐서 연구되지 ​​않았습니다. 시험 관내 연구 investig의 몇HIV-1에 대한 말라리아의 영향을 ating 것은 용해 말라리아 항원에 대한 노출이 면역 세포에서 HIV-1 감염 및 재활 성화를 높일 수있다는 증명하고있다. 그러나 이러한 연구는 P. 전체 세포 추출물을 사용 falciparum schizont 단계의 기생충 및 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC), 말라리아 구성 요소 (들)이 관찰된 효과와 어떤 대상 호스트 세포가 4,5 줄에 책임이있는 해독하기 어렵다 만들기. 최근 작품은 macrophages 8 HIV-1 감염을 감소하는 말라리아 색소 hemozoin에 미숙 단핵구 파생 돌기 세포의 노출은 CD4 + T 세포 6,7에 HIV-1을 전송하는 능력을 증가하는 입증했지만했다. 이 복잡​​한 과정, 말라리아 기생충과 다른 관련성이 인간의 기본 세포 인구의 HIV-1 사이의 상호 작용의 체계적인 분석에 대해 설명해 주실 매우 필요합니다. H의 영향을 조사하는 몇 가지 기법미생물의 phagocytosis와 HIV-1 복제에 같은 병원균의 효과에 대한 IV-1은 설명했습니다. 우리는 여기서 P.의 효과를 조사할 수있는 방법을 제시 인간의 기본 단핵구 파생 macrophages에서의 HIV-1의 복제에 falciparum에 감염된 적혈구. 감염된 macrophages에 의해 발표된 바이러스의 수량에 대한 효과를 측정에 의해 결정되는 동안 HIV-1 transcriptional / translational 이벤트 기생충 노출의 영향은 루시페라제 리포터 유전자는 환경을 유전자를 교체하였습니다하는 단일 사이클 pseudotyped 바이러스를 사용하여 감시하고 있습니다 셀 supernatants에 엘리사에 의해 p24 HIV-1 capsid 단백질.

우리는을 개발했습니다<em&gt; 체외에서</em의 영향을 연구하기&gt; 말라리아 - HIV-1 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; 인간의 기본 단핵구 파생 macrophages의 HIV-1 replicative주기에. 이 다재 다능한 시스템은 쉽게 HIV-1 감염에 감염될 다른 일차 전지 종류에 적응하실 수 있습니다.

<em&gt; 체외에서</em공부하기&gt; 공동 감염 모델<em&gt; Plasmodium falciparum</em인간의 기본 단핵구 파생 면역 세포에서&gt; - HIV-1 상호 작용

가장 치명적인 형태의 말라리아 원인균인 Plasmodium falciparum과 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)은 가장 중요한 ...

본 절차의 전반적인 목표는 인간 일차 단핵구 유래 대식세포에서 HIV-1의 복제에 *Plasmodium falciparum* 감염 적혈구가 미치는 영향을 연구하기 위한 인비트로(in vitro) 모델을 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 VEAC 시스템을 사용하여 *P. falciparum* 감염 적혈구를 분리한 후, 인간 단핵구 유래 대식세포를 감염된 세포에 노출시킵니다. 다음으로, 적혈구에 노출된 단핵구 유래 대식세포를 완전 복제 가능 HIV 또는 단일 복제 루시페라아제 인코딩 HIV로 감염시킵니다.마지막으로, 완전 복제 바이러스 및 루시페레이스 인코딩 바이러스의 경우 감염 후 3, 6, 9, 12일째에 배양 상층액을 수집합니다. 감염된 세포는 감염 72시간 후에 용해시킵니다. 최종적으로, ELISA를 통해 상층액 내 HIV-1 p24 캡시드 단백질의 양을 측정함으로써 바이러스 복제를 모니터링할 수 있으며, 세포 용해물의 루시페레이스 정량을 통해 바이러스 전사를 모니터링할 수 있습니다.이 방법은 말라리아와 HIV 공동 감염 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 플라스모디움(plasmodium) 기생충 감염이 HIV 복제에 어떤 영향을 미치는가가 있습니다. 이 방법은 대식세포 내에서 플라스모디움과 HIV-1 간의 상호작용을 연구하기 위해 개발되었으나, 다른 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.예를 들어, 수지상 세포, 단핵구 또는 CD4 T 세포를 이용한 실험 절차는 연구실의 박사후 연구원인 Guadalupe Andreani가 시연하겠습니다. 먼저 배양 플레이트에서 적혈구를 수확하고, 회수된 세포를 10 mL의 단핵구 유래 대식세포 배지로 세척한 다음, 침전물을 12 mL의 단핵구 유래 대식세포 배양 배지에 다시 현탁하십시오. 이제 세포 현탁액을 Milton ECS 컬럼에 천천히 첨가하고 현탁액이 통과하도록 둡니다. 신선한 배지로 컬럼을 한 번 세척한 후, 자석에서 컬럼을 제거하고 12 mL의 단핵구 유래 대식세포 배양액을 흘려보내십시오.배지를 컬럼에 통과시켜 감염된 적혈구를 멸균 튜브에 용출함으로써, 단핵구 유래 대식세포를 감염 또는 비감염 적혈구에 노출시킵니다. 단핵구 유래 대식세포가 포함된 미리 준비된 24-웰 플레이트의 각 웰에 적절한 부피의 적혈구 현탁액을 첨가합니다. 공동 배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 4시간 후, 적혈구가 포함된 배지를 제거한 다음 600 µL의 엔도톡신 제거 PBS를 각 웰에 부드럽게 첨가하며, 각 세척 단계 직후에 PBS를 즉시 흡입하여 이 과정을 3회 반복합니다.이제 각 웰에 200 µL의 차갑고 멸균된 물을 첨가하여 적혈구를 용혈시킨 후, 20초 뒤에 물을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 각 웰에 600 µL의 단핵구 유래 대식세포 배양 배지를 첨가하고, 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양합니다. 단핵구 유래 대식세포에서 Plasmodium falciparum이 HIV-1 복제에 미치는 영향을 평가하기 위해, 이 그림에 묘사된 프로토콜과 유사하게 해당 웰에 NL4-3 BO HIV-1 바이러스의 p24가 포함된 단핵구 유래 대식세포 배지 300 µL를 첨가합니다.공배양물을 2시간 동안 배양한 후, endotoxin free PBS 600 µL로 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 신선한 단핵구 유래 대식세포 배지 600 µL를 첨가하고, 초기 바이러스 감염 후 3, 6, 9, 12일에 공배양물을 계속 배양합니다. 각 상층액 200 µL를 수확하고, 회수된 세포 현탁액을 신선한 단핵구 유래 대식세포 배지 200 µL로 대체합니다. 이후 수확한 상층액은 나중에 ELISA로 분석할 수 있도록 -20 °C에서 보관합니다.기생충이 단핵구 유래 대식세포 내 HIV-1 유전자 발현에 미치는 영향을 결정하기 위해, 여기에 설명된 프로토콜과 유사하게 luciferase ENC 코팅된 표적 바이러스의 P 24가 포함된 단핵구 유래 대식세포 배지 300 µL를 해당 웰에 첨가합니다. luciferase ENC 코팅되지 않은 바이러스에 대해 보여준 것과 같이 공동 배양물을 배양 및 세척한 후, 감염 72시간 뒤에 배지를 제거하고 200 µL의 luciferase assay 히트 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가합니다. 실온에서 가볍게 흔들어 세포를 용해시킨 다음, 공동 배양물을 -20 °C에서 보관하십시오.플레이트를 해동한 후, 각 웰에서 40 µL의 용해물을 96-웰 루미노미터 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 그런 다음 각 웰에 루시퍼라제 분석 키트의 루시퍼라제 기질 100 µL를 추가합니다. 마지막으로 루미노미터에서 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정합니다.본 실험의 제조사 지침에 따라, 단핵구 유래 대식세포를 감염되었거나 감염되지 않은 적혈구에 노출시킨 후 NL 4-3 strain으로 감염시켰습니다. 앞서 시연한 바와 같이, 초기 바이러스 감염 후 서로 다른 시점에서 세포 제거 상층액 내의 HIV-1 p24에 대한 ELISA를 통해 바이러스 단백질 p24의 생성을 모니터링했습니다. 기생충으로 전처리한 단핵구 유래 대식세포의 상층액에서 HIV-1 p24 캡시드 단백질로 측정한 결과, 12일차에 바이러스 입자의 방출이 유의하게 감소했음에 유의하십시오.본 실험에서는 단핵구 유래 대식세포를 감염된 적혈구 및 감염되지 않은 적혈구에 노출시킨 후, 앞서 시연한 바와 같이 루시페레이스(luciferase)가 인코딩된 바이러스를 감염시켰습니다. 이후 최초 바이러스 감염 72시간 후에 세포 용해물에서 루시페레이스 발현을 평가하였습니다. 외인성 VSVG 또는 HIV-1 당단백질을 보유한 이러한 바이러스에 단핵구 유래 대식세포를 감염시킨 결과, p false spar에 노출된 세포에서 루시페레이스 생성이 유의하게 적게 나타났습니다. 특히 VSVG 슈도타이핑(pseudotyped) 바이러스는 VSVG 슈도타이핑 입자의 높은 감염 효율로 인해 JRFL-1 대응물보다 훨씬 더 높은 루시페레이스 활성을 보였다는 점이 주목할 만합니다.이 기술을 통해 말라리아 및 HIV 공동 감염 분야의 연구자들은 여러 면역 세포 유형 연구에 적용 가능한 인비트로(in vitro) 모델에서 이 두 병원체 사이의 상호작용을 탐구할 수 있을 것입니다.

an-vitro-co-infection-model-to-study-plasmodium-falciparum-hiv-1

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

이 비디오는 인간 면역결핍 바이러스 1형, HIV-1에 의한 인간 자궁 점막 조직의 생체 외 감염 및 공기-액체 계면에서 젤라틴 스펀지 위에 대한 유지 관리를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 인간 조직 내에서 HIV-1 복제 및 발병 기전을 모니터링할 수 있습니다.

생체 외 조건에서 HIV 발병기전을 연구하기 위한 인간 자궁경부 점막 감염 모델

이 비디오는 체외 말라리아-HIV 동시 감염 세포 배양 모델의 생성을 보여줍니다. Plasmodium falciparum 기생된 적혈구와 공동 배양된 HIV 감염 말초 혈액 단핵 세포는 잠재적으로 서로의 성장을 지원하고 HIV 및 말라리아 동시 감염에서 면역 반응 및 질병 진행에 대한 통찰력을 제공합니다.

말라리아-HIV 동시 감염의 체외 세포 배양 모델 생성

인간 호흡기 세포융합 바이러스(HRSV)는 어린 유아에게 심각한 세기관지염을 유발할 수 있습니다. 중증 HRSV 질환의 발병 기전 중 일부는 숙주 면역 반응에 의해 발생합니다. HRSV를 이용한 일차 인간 면역 세포의 자극은 염증 경로 및 감염의 활성화를 연구하기 위한 빠르고 재현 가능한 모델 시스템을 제공합니다.

인간 호흡기 세포융합 바이러스 감염에 대한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 면역 반응을 연구하기 위한 체외 모델

무 세포 HIV-1 입자와는 달리, 감염된 CD4 + T 세포를 형질 효과적으로 수지상 세포 (PDCS)에 의해 감지된다. 이 원고는 타입 I IFN의 방출에 의해 평가로서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 또는 격리 PDCS는 PDCS 의해 선천성 센싱을 평가하는 HIV-1 감염 T 세포와 공동 배양 방법을 설명한다.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

인간 동시 감염은 체외에서 복제하기 어렵습니다. 그러나 인간 말라리아 기생충은 HIV에 자연적으로 감염된 갓 분리된 인간 말초 혈액 단핵 세포와 마찬가지로 체외에서 쉽게 배양할 수 있습니다. 이는 HIV 동시 감염의 맥락에서 말라리아 기생충에 대한 조기 면역 반응을 연구하기 위한 훌륭한 모델을 제공합니다.

<em&gt; 체외</em&gt; HIV 공동 감염의 맥락에서 말라리아에 면역 반응을 측정하기위한 모델

이 프로토콜은 HIV 감염에 대한 줄기 세포 기반 엔지니어링 면역을 가진 인간화 된 골수/간/흉선 마우스 모델을 구성하는 방법을 설명합니다.

인간화 된 마우스 모델에 HIV 감염에 대 한 줄기 세포를 기반으로 설계된 내성

인간의 조직 비보 전 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)의 감염 바이러스 병의 귀중 한 3D 모델을 제공합니다. 여기, 우리는 프로토콜 처리 및 조직 표본에서 인간의 편도 에이즈-1 여성 생식 기 거칠어 감염과 액체 공기 인터페이스에 문화에서 그들을 유지 하는 것을 설명 합니다.

전 비보 인간 면역 결핍 바이러스 1와 Histoculture 인간 림프 조직 및 여성 생식 기 점 막의 감염

여기에 제시된 것은 HIV에 감염된 개인과 건강한 대조군으로부터 인간의 1차 단핵구를 분리, 배양, 트랜스펙팅 및 분화하기 위한 최적화된 프로토콜입니다.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

이 프로토콜은 EcoHIV 감염과 Tmem119-EGFP 마우스의 조합이 HIV 관련 신경인지 장애의 설치류 모델에서 미세아교세포 변형 및 바이러스 저장소를 조사하기 위한 귀중한 생물학적 시스템을 제공하는 방법을 설명합니다.

Microglia-Manipulated Transgenic Mice에서 EcoHIV 감염 세포 식별

학습하세요 Plasmodium falciparum이 HIV-1 복제에 미치는 영향을 연구하는 체외 공동 감염 모델을 통해 말라리아와 HIV 공동 감염 메커니즘을 탐색하는 방법을 배우세요.

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