병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

다음 실험의 전반적인 목적은 수선 후 형광을 발하는 분자 비콘을 사용하여 DNA 수선 속도와 세포 핵 추출물을 실시간으로 측정하는 것입니다. 염기 절제 수선 분자 비콘은 단일 염기 손상을 포함하는 스템-루프 구조의 데옥시 올리고뉴클레오타이드로 구성되며, 접혔을 때 5' 말단에는 6-carboxyfluorescein 작용기가, 3' 말단에는 Dabcyl 작용기가 결합되어 있습니다. 6-FAM 작용기는 푀르스터 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 Dabcyl에 의해 비형광 상태로 소광됩니다.

DNA 복구 활성을 평가하기 위해, 복구 효소가 포함된 세포 핵 추출물과 비콘을 함께 배양합니다. DNA 글리코실라제(DNA Glycosylate)가 비콘의 DNA 손상 부위를 인식하여 제거합니다. 그 결과 생성된 ABA 사이트는 AP 엔도뉴클레아제 1(AP endonuclease one) 또는 ape one의 기질이 됩니다. APE one은 이를 인식하여 ABA 사이트의 DNA 백본을 절단하며, 이를 통해 6-fam이 포함된 DNA가 헤어핀 구조로부터 자유롭게 해리될 수 있게 합니다.

소광제(quencher)로부터의 분리는 DNA 복구 수준에 비례하는 형광 증가를 가져오며, 이는 정량적 실시간 PCR 기기를 사용하여 실시간으로 측정할 수 있습니다. DNA 손상을 복구하는 능력은 모든 세포와 유기체에 있어 매우 중요합니다. 수많은 세포 내 DNA 복구 경로 중에서 염기 절제 복구(base excision repair)는 산화적 또는 화학적 손상으로 인해 발생할 수 있는 손상된 염기를 표적으로 하며, 염기 절제 복구에 영향을 줄 수 있는 개별 세포 요소의 역할을 밝히는 것이 저희 실험실 연구의 주요 목표 중 하나입니다.

따라서 DNA 복구 활성을 정확하고 민감하게 측정하는 것이 본 연구실의 관심사가 되었습니다. 본 분석법은 이러한 데이터를 제공할 수 있습니다. 32 PN 표지 및 겔 전기영동 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 방사성 표지 기질을 사용하지 않으며, DNA 복구 속도를 실시간으로 측정할 수 있고, 동적 범위가 매우 넓다는 점입니다.

또한, 이 접근 방식은 여러 가지 서로 다른 형광체 및/또는 염기 손상을 이용하여 기질 특이성을 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 당사는 본 분석법이 다양한 설정에서 정량성이 높고 매우 민감하다는 것을 입증하였습니다. 이 염기 절제 수복 분자 비콘 분석법은 반응 속도론적 분석에 적합합니다.

이 분석법의 높은 민감도와 특이성 덕분에 염기 절단 복구의 정확한 정량이 가능하며, 따라서 복구 억제제 스크리닝이나 검증에 유용합니다. 또한, 기능적 바이오마커 측정을 위해 조직 및 종양 세포 용해물의 DNA 복구 활성을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 본 분석법에 사용할 분자 비콘을 설계할 때, 여기에 표시된 것과 같이 길이가 43base인 다음의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 고려하십시오.

원활하게 작동합니다. DNA 서열은 고유할 필요는 없으나, 헤어핀 구조 형성이 가능해야 합니다. 여기에 표시된 것처럼 굴곡진 형태일 때, uracil 또는 tetra hydro furin과 같은 특정 염기 손상을 삽입함으로써 특이성을 확보할 수 있습니다.

5' 말단에서 6개 염기 떨어진 X 위치의 GC 함량은 최소 32%여야 하며, 5' 말단에는 GB 염기가 위치해서는 안 됩니다. 5' 말단에는 6-carboxy fluorescein 또는 6-FAM을 접합하고, 3' 말단은 dab sil로 변형해야 합니다. 이는 DNA 수선 단백질의 기질이 되어 glycosyl release의 결합과 활성을 보장하게 됩니다.

병변의 위치는 헤어핀 구조 및 DNA 끝단으로부터 충분한 공간을 확보할 수 있도록 선택되었습니다. 줄기(stem) 또는 헤어핀 이중가닥의 길이는 최소 15 base pair여야 합니다. 권장되는 루프 길이는 13 base입니다.

대조군 분자 비콘은 DNA 손상이 포함되어 있지 않다는 점을 제외하고 실험군 분자 비콘과 동일해야 합니다. 따라서 이는 DNA 복구 효소에 의해 인식되지 않아야 합니다. 분자 비콘이 준비되면, 가열되기 전까지 비콘이 형광을 발하지 않는지 확인하기 위해 품질 평가를 수행해야 합니다.

최적의 용융 온도를 결정하기 위해, 추출 과정의 모든 단계는 얼음 위 또는 4°C에서 수행해야 합니다. 단백질 안정성을 확보하기 위해, 다음 항목들을 미리 냉각하여 실험 준비를 합니다: 샘플당 1L 비커 2개, 투석 버퍼, 투석 챔버, 원심분리기 튜브, 주사기 및 바늘.

15 milliliter 원추형 튜브에 라벨을 붙여 얼음 위에 둡니다. 세포에서 배양액을 흡입하여 제거한 다음, 7.5 milliliters의 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 각 디쉬에 5 milliliters의 차가운 PBS를 넣고 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어 모읍니다.

세포를 냉각된 15 mL 원심 분리관으로 옮긴 후, 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 유사한 튜브에 들어있는 기지의 액체 부피와 비교하여 세포 침전물 부피(packed cell volume)를 추정합니다. 튜브를 1분 더 원심 분리한 다음, 피펫을 사용하여 남아있는 PBS를 제거합니다.

농축된 세포 부피 50 µL당 150 µL의 nuke buster extraction reagent one을 사용하여 세포 펠렛을 현탁합니다. 그다음 현탁된 세포를 미리 냉각시킨 1.5 mL 튜브로 옮기고 고속으로 15초 동안 볼텍싱합니다. 볼텍싱 후 튜브를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고, 다시 15초 동안 볼텍싱한 뒤 4 °C에서 13,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 세포질 분획이 포함된 상층액을 제거하여 버립니다. 농축된 세포 부피 50 µL당 100 x protease inhibitor cocktail 1 µL, 100 mM DTT 1 µL 및 nuke buster extraction reagent two 75 µL의 혼합액으로 펠렛을 재현탁합니다.

고속으로 15초 동안 세포를 볼텍싱합니다. 얼음 위에서 5분간 배양한 후, 다시 고속으로 15초 동안 볼텍싱하고 4°C에서 13,000 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 핵 단백질이 포함된 상층액을 시린지를 사용하여 7,000 분자량 컷오프의 슬라이드 투석 카세트로 옮깁니다.

다음으로, 미리 냉각시킨 투석 완충액 500 mL에 1 M DTT 500 µL를 첨가하고, 4 °C에서 가볍게 교반하며 90분 동안 용해물을 투석합니다. 90분 후, 투석 카세트를 DTT가 포함된 미리 냉각시킨 투석 완충액 0.5 L가 담긴 두 번째 비커로 옮겨 투석합니다. 4 °C에서 가볍게 교반하며 90분 동안 용해물을 투석한 후, 높은 단백질 농도로 인해 추출물이 결정화되었을 수 있습니다.

다음으로, 카세트를 주입할 때 사용한 포트가 아닌 다른 포트에 새 시린지를 삽입하여 투석 카세트로부터 투석된 핵 단백질 용액을 수집합니다. 투석된 핵 단백질 용액을 제거할 때 뿌옇게 보이는 결정들이 포함되도록 합니다. 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에 20 µL씩 분주하고 드라이아이스로 급속 냉동시킨 후, 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다.

동봉된 문서에 기술된 대로 단백질 농도를 결정하고 품질 관리를 수행하십시오. 분자 비콘 분석을 수행하려면, 1 mM DTT가 포함된 기본 절제 수선 반응 버퍼를 사용하여 세포 용해물을 단백질 농도 2 µg/µL가 되도록 해동 및 희석하십시오. 분자 비콘은 기본 절제 수선 반응 버퍼를 사용하여 200 µM로 희석하십시오. 정량적 실시간 PCR 기기는 일반적으로 형광 측정기로 사용되지 않으므로, 37 °C에서 최소 180 사이클 동안 20초마다 데이터를 수집하도록 정량적 실시간 PCR 기기의 실행 방법을 변경하십시오.

그 후, 정규화를 위한 데이터를 얻기 위해 분자 비콘(molecular beacon)의 최대 형광 상태에서 20초 간격으로 15회 반복합니다. 반응 부피를 25 µL로 설정하십시오. 그런 다음 Applied Biosystems 소프트웨어를 사용하여 기기에서 실험 유형을 표준 곡선(standard curve)으로 선택하고 플레이트 설계를 설정한 뒤, 플레이트 레이아웃을 완성합니다.

예시가 이 표에 나와 있으며, 이는 동봉된 문서에서도 확인할 수 있습니다. 표준 곡선으로 선택된 웰에는 아무것도 추가하지 마십시오. 기본 절제 복구 반응 버퍼, DTT, 2 µg/µL 농도의 세포 용해물 및 실험에 사용되는 모든 분자 비콘을 얼음 위에 둡니다.

그런 다음 DTT를 기본 절제 수복 반응 버퍼에 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가합니다. DTT가 포함된 기본 절제 수복 반응 버퍼 15µL를 얼음 위에 놓인 호환 가능한 광학 qRT-PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 다음으로, 플레이트 배치도에 따라 비콘을 적절한 웰에 분주합니다.

용해물과 분자 비콘 또는 대조군의 각 조합은 3회 반복 측정해야 합니다. 마지막으로, 희석된 핵 용해물을 적절한 웰에 웰당 5 µL씩 피펫팅합니다. 모든 분자 비콘 시약을 차갑게 유지하고, 용해물을 플레이트에 넣는 과정을 마지막 단계로 수행하는 것이 중요합니다.

용해물에는 활성 단백질이 포함되어 있으며, 반응 혼합물에 파이펫으로 옮겨지는 즉시 분자 비콘(molecular beacons)을 수선하기 시작한다는 점을 기억하십시오. 따라서 측정을 시작하기 전까지 발생하는 비콘 수선량을 최소화하기 위해 모든 시약을 차갑게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 모든 성분을 첨가한 후, 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 가볍게 두드려 혼합하십시오.

그 후 원심분리기로 10초 동안 빠르게 원심분리하여 튜브나 플레이트 바닥에 용액을 모읍니다. 원심분리가 끝나면 플레이트를 정량 실시간 PCR 기기에 넣고 분석을 시작합니다. 분석 완료 후 raw 데이터를 가급적 Excel 형식으로 내보내고, 필요한 계산을 마친 뒤 첨부 문서의 지침에 따라 데이터를 분석합니다. LN 4 28 세포 및 LN 4 28 MPG로 지정된 MPG 과발현 세포주에서 유래한 핵 추출물의 품질과 DNA 복구 활성을 평가하기 위해, 정규화된 형광 데이터를 시간(초)에 따른 free FAM 백분율로 산점도에 표시하고 해당 오차 막대를 함께 나타냅니다. 본 영상에서 설명한 분석은 양성 대조군으로 APE 1 기질 tetra furin을 포함하는 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 수행되었습니다.

이 그림에서 알 수 있듯이, 두 세포주 모두 가파른 기울기로 나타나는 강력한 APE1 활성과 MPG 기질 제거에 특이적인 DNA 글리코실라제 활성을 가지고 있습니다. HX로 표시된 하이포잔틴은 두 세포주의 핵 용해물에서 측정되었습니다. 각 용해물은 기본 절제 복구 대조군 분자 비콘 또는 염기 절제 복구 HX 분자 비콘을 사용하여 분석되었으며, 대조군 비콘인 LN 4 28은 녹색으로, 하이포 비콘인 LN 4 28 MPG는 보라색으로 표시되었습니다.

LN 4 28은 파란색으로, LN 4 28 MPG는 주황색으로 표시되었습니다. 결과는 A의 평균 형광 단위와 B의 정규화된 형광으로 보고되었습니다. 각 세포에서 HX 복구를 나타내는 시간 의존적 형광 증가가 발생했습니다.

예상대로 용해물이 HX 분자 비콘과 함께 배양되었습니다. 주황색 추적으로 표시된 LN 4 28 MPG 세포주는 모세포인 LN 4 28 세포주보다 형광 축적 속도가 훨씬 더 빨랐으며, 이는 수선 속도가 훨씬 더 높음을 나타냅니다. 모세포인 LN 4 28 세포주는 MPG 단백질이 최소량으로 존재합니다. 따라서 특정 수선 단백질에 의한 특정 DNA 손상의 수선 속도를 비특이적 DNA 절단의 배경 수준을 최소화하면서 세포 추출물로부터 실시간으로 측정할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 분자 비콘(molecular beacons)을 설계하는 방법과 정제된 단백질 또는 세포 용해물을 사용하여 실시간 DNA 복구 속도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 분석과 관련하여, 양성 및 음성 대조군 비콘의 포함 여부와 같은 대조군 반응을 통해 다이내믹 레인지(dynamic range)와 배경값을 평가하는 것이 필수적입니다. 웰(well) 간의 변동성을 고려하여, 개별 웰의 데이터를 입력값으로 정규화하는 것이 유용합니다.

이들은 융해 온도에서의 더 세밀한 단계에 의해 결정됩니다. 이러한 점과 락 다이(rock die)와 같은 다른 염료의 포함은 피펫팅 오차나 검출기 간의 차이로 인해 발생하는 고유한 변동성을 보정해 줍니다. 이 기법을 통해 우리는 개별 염기 절제 복구 성분이 전체적인 복구 활성과 용량에 미치는 영향을 규명할 수 있었습니다.

이는 기존의 방법으로는 검출할 수 없었을 미세한 변화까지 찾아낼 수 있을 만큼 민감합니다.