Name: 병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 배우세요 분자 비콘을 활용한 세포 핵 추출물의 DNA 절단 복구 활성을 실시간으로 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 암 생물학 및 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

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RWS이 작품은 피츠버그 재단과 국립 연구소 건강 (NIH) [; CA148629 ES019498 GM087798]에서 교부금에 의해 지원되었다. UPCI Lentiviral 시설에 대한 지원은 국립 보건원에서 암 센터 지원 그랜트에 의해 RWS에게 제공한 [P30 CA047904]. 지원은 또한 피츠버그 대학 약리학 계열 및 DS에 대한 화학 생물학에 의해 제공되었다. 지원은 또한 이력서에 ESTRO에 의해 제공되었다.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS는 Trevigen 주식 저자의 다른 관심사 아무런 충돌이 없다는 것을 선언에 대한 과학적인 컨설턴트이다.

수많은 분자와 helicase 활동 6의 DNA 중합 효소 활동 7,8, DNA ligase 활동 9, telomerase 활동 10, DNA photolyase 활동 11 DNA를 /을 포함하여 효소 활동을 감지하고 quantifying에 대한 용어는 &#39;분자 비컨&#39;를 사용하여 600 인용 이상있다 많은 사람 중에서 하이브리드 12, RNA. 위에 나열된 DNA의 복구 활동의 측정을위한 분자 비콘의 사용 이외에, 우리와 다른 BER 활동 1,2,13-15의 분석에 대해 이러한 프로브의 유틸리티를 증명하고있다. 우리가 여기에서 설명하는 실시간 BER 활동 분석은 단일 수정된베이스를 통합하고 병변 반대 자료의 다른 병변 또는 변경에 대한 BER 속도의 양적 평가 수 있도록합니다. 응용 프로그램은 분자 기계론의 연구에서 억제제 화면...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 어부 </td><td> P217-500 </td><td> 분자 학년 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 어부 </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> 글리세린 </td><td> 어부 </td><td> BP229-1 </td><td> 분자 학년 </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 어부 </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15,630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-소금 </td><td> 시그마 </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> 수산화 칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM 필터 </tD&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer 투석 제품 </td><td> 찌르다 </td><td> 66,373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> 어부 </td><td> 309,659 </td><td></td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> 어부 </td><td> 305,196 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-408-129 </td><td> 검정 </td></tr><tr><td> 15 ML 팔콘 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 352,097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBus​​ter 단백질 추출 키트 </td><td> Calbiochem </td><td> 71,183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14,190 </td><td></td></tr><tr><td> 분자 비콘 </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad 단백질 분석 염료 재에이전트 농축 </td><td> BioRad </td><td> 고양이 # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

우리는 기본 절단 수리 (BER) 분자 비콘을 사용하여 DNA를 glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 기판 (비콘)은 6 Carboxyfluorescein (6 식구들) 5&#39;end과 oligonucleotide의 3 &#39;끝까지 복합 Dabcyl 잔기에 복합 잔기와 하나의 기본 병변을 포함 deoxyoligonucleotide 구성되어 있습니다. BER 분자 신호의 길이는 43 기지이며, 순서는 줄기 1,2의 루프와 15 기본 쌍 13 세포핵과 줄기 루프 구조의 형성을 촉진하도록 설계되었습니다. 이 구성에 접혀 때 6 식구들 잔기는 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 3,4 통해 비 형광등 방식으로 Dabcyl에 의해 침묵하고 있습니다. 병변은 6 식구들 잔기를 포함하는 나머지 다섯베이스 oligonucleotide는 줄기에서 발표되는 등 그 다음의 기본 병변 제거 및 스트랜드 절단에 위치하고 있습니다. 풀어DNA 수리의 수준에 비례이다 형광의 증가 끄는 (Dabcyl) 결과에서 차 초연. 복수를 수집하여 형광 값 읽기, BER 활동의 실시간 평가는 가능합니다. 표준 정량 실시간 PCR 악기의 사용은 많은 샘플의 동시 분석이 가능합니다. 이러한 BER 분자 비콘의 디자인은 하나의 기본 병변으로 운동 분석, BER의 부량 및 억제제 검증 의무가 있으며 조직과 종양 세포 lysates의 DNA를 복구 활동의 부량 또는 단백질 정제와 적응이다. 이러한 분자 비콘을 사용하여 종양 lysates이나 조직 aspirates의 BER 활동의 분석은 기능적인 biomarker 측정에 적용할 수 있습니다. 또한, 이러한 양적 분석을 사용하여 단백질을 정제와 BER 활동의 분석 BER 억제제의 발견 및 검증을위한 신속한 높은 처리량 방법을 제공합니다.

우리는 DNA glycosylase 및 세포 핵 lysates의 에이피 endonuclease 활동의 양적, 실시간 측정을위한 방법을 설명합니다. 분석은 운동 분석 의무의 DNA 복구 활동의 속도를 얻을 조직과 종양의 lysates 또는 정화 단백질과 DNA를 복구 활동의 부량에 대한 적응이다.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

우리는 염기 ...를 사용하여 세포 핵 용해물 내 DNA 글리코실레이스 및 AP 엔도뉴클레아제 활성을 실시간으로 정량 측정하는 방법을 설명합니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 수선 후 형광을 발하는 분자 비콘을 사용하여 DNA 수선 속도와 세포 핵 추출물을 실시간으로 측정하는 것입니다. 염기 절제 수선 분자 비콘은 단일 염기 손상을 포함하는 스템-루프 구조의 데옥시 올리고뉴클레오타이드로 구성되며, 접혔을 때 5' 말단에는 6-carboxyfluorescein 작용기가, 3' 말단에는 Dabcyl 작용기가 결합되어 있습니다. 6-FAM 작용기는 푀르스터 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 Dabcyl에 의해 비형광 상태로 소광됩니다.DNA 복구 활성을 평가하기 위해, 복구 효소가 포함된 세포 핵 추출물과 비콘을 함께 배양합니다. DNA 글리코실라제(DNA Glycosylate)가 비콘의 DNA 손상 부위를 인식하여 제거합니다. 그 결과 생성된 ABA 사이트는 AP 엔도뉴클레아제 1(AP endonuclease one) 또는 ape one의 기질이 됩니다. APE one은 이를 인식하여 ABA 사이트의 DNA 백본을 절단하며, 이를 통해 6-fam이 포함된 DNA가 헤어핀 구조로부터 자유롭게 해리될 수 있게 합니다.소광제(quencher)로부터의 분리는 DNA 복구 수준에 비례하는 형광 증가를 가져오며, 이는 정량적 실시간 PCR 기기를 사용하여 실시간으로 측정할 수 있습니다. DNA 손상을 복구하는 능력은 모든 세포와 유기체에 있어 매우 중요합니다. 수많은 세포 내 DNA 복구 경로 중에서 염기 절제 복구(base excision repair)는 산화적 또는 화학적 손상으로 인해 발생할 수 있는 손상된 염기를 표적으로 하며, 염기 절제 복구에 영향을 줄 수 있는 개별 세포 요소의 역할을 밝히는 것이 저희 실험실 연구의 주요 목표 중 하나입니다.따라서 DNA 복구 활성을 정확하고 민감하게 측정하는 것이 본 연구실의 관심사가 되었습니다. 본 분석법은 이러한 데이터를 제공할 수 있습니다. 32 PN 표지 및 겔 전기영동 분석과 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 방사성 표지 기질을 사용하지 않으며, DNA 복구 속도를 실시간으로 측정할 수 있고, 동적 범위가 매우 넓다는 점입니다.또한, 이 접근 방식은 여러 가지 서로 다른 형광체 및/또는 염기 손상을 이용하여 기질 특이성을 결정하는 데 활용될 수 있습니다. 당사는 본 분석법이 다양한 설정에서 정량성이 높고 매우 민감하다는 것을 입증하였습니다. 이 염기 절제 수복 분자 비콘 분석법은 반응 속도론적 분석에 적합합니다.이 분석법의 높은 민감도와 특이성 덕분에 염기 절단 복구의 정확한 정량이 가능하며, 따라서 복구 억제제 스크리닝이나 검증에 유용합니다. 또한, 기능적 바이오마커 측정을 위해 조직 및 종양 세포 용해물의 DNA 복구 활성을 측정하는 데에도 적용할 수 있습니다. 본 분석법에 사용할 분자 비콘을 설계할 때, 여기에 표시된 것과 같이 길이가 43base인 다음의 DNA 올리고뉴클레오타이드를 고려하십시오.원활하게 작동합니다. DNA 서열은 고유할 필요는 없으나, 헤어핀 구조 형성이 가능해야 합니다. 여기에 표시된 것처럼 굴곡진 형태일 때, uracil 또는 tetra hydro furin과 같은 특정 염기 손상을 삽입함으로써 특이성을 확보할 수 있습니다.5' 말단에서 6개 염기 떨어진 X 위치의 GC 함량은 최소 32%여야 하며, 5' 말단에는 GB 염기가 위치해서는 안 됩니다. 5' 말단에는 6-carboxy fluorescein 또는 6-FAM을 접합하고, 3' 말단은 dab sil로 변형해야 합니다. 이는 DNA 수선 단백질의 기질이 되어 glycosyl release의 결합과 활성을 보장하게 됩니다.병변의 위치는 헤어핀 구조 및 DNA 끝단으로부터 충분한 공간을 확보할 수 있도록 선택되었습니다. 줄기(stem) 또는 헤어핀 이중가닥의 길이는 최소 15 base pair여야 합니다. 권장되는 루프 길이는 13 base입니다.대조군 분자 비콘은 DNA 손상이 포함되어 있지 않다는 점을 제외하고 실험군 분자 비콘과 동일해야 합니다. 따라서 이는 DNA 복구 효소에 의해 인식되지 않아야 합니다. 분자 비콘이 준비되면, 가열되기 전까지 비콘이 형광을 발하지 않는지 확인하기 위해 품질 평가를 수행해야 합니다.최적의 용융 온도를 결정하기 위해, 추출 과정의 모든 단계는 얼음 위 또는 4°C에서 수행해야 합니다. 단백질 안정성을 확보하기 위해, 다음 항목들을 미리 냉각하여 실험 준비를 합니다: 샘플당 1L 비커 2개, 투석 버퍼, 투석 챔버, 원심분리기 튜브, 주사기 및 바늘.15 milliliter 원추형 튜브에 라벨을 붙여 얼음 위에 둡니다. 세포에서 배양액을 흡입하여 제거한 다음, 7.5 milliliters의 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 각 디쉬에 5 milliliters의 차가운 PBS를 넣고 셀 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어 모읍니다.세포를 냉각된 15 mL 원심 분리관으로 옮긴 후, 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고, 유사한 튜브에 들어있는 기지의 액체 부피와 비교하여 세포 침전물 부피(packed cell volume)를 추정합니다. 튜브를 1분 더 원심 분리한 다음, 피펫을 사용하여 남아있는 PBS를 제거합니다.농축된 세포 부피 50 µL당 150 µL의 nuke buster extraction reagent one을 사용하여 세포 펠렛을 현탁합니다. 그다음 현탁된 세포를 미리 냉각시킨 1.5 mL 튜브로 옮기고 고속으로 15초 동안 볼텍싱합니다. 볼텍싱 후 튜브를 얼음 위에서 5분 동안 배양하고, 다시 15초 동안 볼텍싱한 뒤 4 °C에서 13,000 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 세포질 분획이 포함된 상층액을 제거하여 버립니다. 농축된 세포 부피 50 µL당 100 x protease inhibitor cocktail 1 µL, 100 mM DTT 1 µL 및 nuke buster extraction reagent two 75 µL의 혼합액으로 펠렛을 재현탁합니다.고속으로 15초 동안 세포를 볼텍싱합니다. 얼음 위에서 5분간 배양한 후, 다시 고속으로 15초 동안 볼텍싱하고 4°C에서 13,000 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 핵 단백질이 포함된 상층액을 시린지를 사용하여 7,000 분자량 컷오프의 슬라이드 투석 카세트로 옮깁니다.다음으로, 미리 냉각시킨 투석 완충액 500 mL에 1 M DTT 500 µL를 첨가하고, 4 °C에서 가볍게 교반하며 90분 동안 용해물을 투석합니다. 90분 후, 투석 카세트를 DTT가 포함된 미리 냉각시킨 투석 완충액 0.5 L가 담긴 두 번째 비커로 옮겨 투석합니다. 4 °C에서 가볍게 교반하며 90분 동안 용해물을 투석한 후, 높은 단백질 농도로 인해 추출물이 결정화되었을 수 있습니다.다음으로, 카세트를 주입할 때 사용한 포트가 아닌 다른 포트에 새 시린지를 삽입하여 투석 카세트로부터 투석된 핵 단백질 용액을 수집합니다. 투석된 핵 단백질 용액을 제거할 때 뿌옇게 보이는 결정들이 포함되도록 합니다. 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에 20 µL씩 분주하고 드라이아이스로 급속 냉동시킨 후, 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다.동봉된 문서에 기술된 대로 단백질 농도를 결정하고 품질 관리를 수행하십시오. 분자 비콘 분석을 수행하려면, 1 mM DTT가 포함된 기본 절제 수선 반응 버퍼를 사용하여 세포 용해물을 단백질 농도 2 µg/µL가 되도록 해동 및 희석하십시오. 분자 비콘은 기본 절제 수선 반응 버퍼를 사용하여 200 µM로 희석하십시오. 정량적 실시간 PCR 기기는 일반적으로 형광 측정기로 사용되지 않으므로, 37 °C에서 최소 180 사이클 동안 20초마다 데이터를 수집하도록 정량적 실시간 PCR 기기의 실행 방법을 변경하십시오.그 후, 정규화를 위한 데이터를 얻기 위해 분자 비콘(molecular beacon)의 최대 형광 상태에서 20초 간격으로 15회 반복합니다. 반응 부피를 25 µL로 설정하십시오. 그런 다음 Applied Biosystems 소프트웨어를 사용하여 기기에서 실험 유형을 표준 곡선(standard curve)으로 선택하고 플레이트 설계를 설정한 뒤, 플레이트 레이아웃을 완성합니다.예시가 이 표에 나와 있으며, 이는 동봉된 문서에서도 확인할 수 있습니다. 표준 곡선으로 선택된 웰에는 아무것도 추가하지 마십시오. 기본 절제 복구 반응 버퍼, DTT, 2 µg/µL 농도의 세포 용해물 및 실험에 사용되는 모든 분자 비콘을 얼음 위에 둡니다.그런 다음 DTT를 기본 절제 수복 반응 버퍼에 최종 농도가 1mM이 되도록 첨가합니다. DTT가 포함된 기본 절제 수복 반응 버퍼 15µL를 얼음 위에 놓인 호환 가능한 광학 qRT-PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 다음으로, 플레이트 배치도에 따라 비콘을 적절한 웰에 분주합니다.용해물과 분자 비콘 또는 대조군의 각 조합은 3회 반복 측정해야 합니다. 마지막으로, 희석된 핵 용해물을 적절한 웰에 웰당 5 µL씩 피펫팅합니다. 모든 분자 비콘 시약을 차갑게 유지하고, 용해물을 플레이트에 넣는 과정을 마지막 단계로 수행하는 것이 중요합니다.용해물에는 활성 단백질이 포함되어 있으며, 반응 혼합물에 파이펫으로 옮겨지는 즉시 분자 비콘(molecular beacons)을 수선하기 시작한다는 점을 기억하십시오. 따라서 측정을 시작하기 전까지 발생하는 비콘 수선량을 최소화하기 위해 모든 시약을 차갑게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 모든 성분을 첨가한 후, 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 가볍게 두드려 혼합하십시오.그 후 원심분리기로 10초 동안 빠르게 원심분리하여 튜브나 플레이트 바닥에 용액을 모읍니다. 원심분리가 끝나면 플레이트를 정량 실시간 PCR 기기에 넣고 분석을 시작합니다. 분석 완료 후 raw 데이터를 가급적 Excel 형식으로 내보내고, 필요한 계산을 마친 뒤 첨부 문서의 지침에 따라 데이터를 분석합니다. LN 4 28 세포 및 LN 4 28 MPG로 지정된 MPG 과발현 세포주에서 유래한 핵 추출물의 품질과 DNA 복구 활성을 평가하기 위해, 정규화된 형광 데이터를 시간(초)에 따른 free FAM 백분율로 산점도에 표시하고 해당 오차 막대를 함께 나타냅니다. 본 영상에서 설명한 분석은 양성 대조군으로 APE 1 기질 tetra furin을 포함하는 분자 비콘(molecular beacon)을 사용하여 수행되었습니다.이 그림에서 알 수 있듯이, 두 세포주 모두 가파른 기울기로 나타나는 강력한 APE1 활성과 MPG 기질 제거에 특이적인 DNA 글리코실라제 활성을 가지고 있습니다. HX로 표시된 하이포잔틴은 두 세포주의 핵 용해물에서 측정되었습니다. 각 용해물은 기본 절제 복구 대조군 분자 비콘 또는 염기 절제 복구 HX 분자 비콘을 사용하여 분석되었으며, 대조군 비콘인 LN 4 28은 녹색으로, 하이포 비콘인 LN 4 28 MPG는 보라색으로 표시되었습니다.LN 4 28은 파란색으로, LN 4 28 MPG는 주황색으로 표시되었습니다. 결과는 A의 평균 형광 단위와 B의 정규화된 형광으로 보고되었습니다. 각 세포에서 HX 복구를 나타내는 시간 의존적 형광 증가가 발생했습니다.예상대로 용해물이 HX 분자 비콘과 함께 배양되었습니다. 주황색 추적으로 표시된 LN 4 28 MPG 세포주는 모세포인 LN 4 28 세포주보다 형광 축적 속도가 훨씬 더 빨랐으며, 이는 수선 속도가 훨씬 더 높음을 나타냅니다. 모세포인 LN 4 28 세포주는 MPG 단백질이 최소량으로 존재합니다. 따라서 특정 수선 단백질에 의한 특정 DNA 손상의 수선 속도를 비특이적 DNA 절단의 배경 수준을 최소화하면서 세포 추출물로부터 실시간으로 측정할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 분자 비콘(molecular beacons)을 설계하는 방법과 정제된 단백질 또는 세포 용해물을 사용하여 실시간 DNA 복구 속도를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 분석과 관련하여, 양성 및 음성 대조군 비콘의 포함 여부와 같은 대조군 반응을 통해 다이내믹 레인지(dynamic range)와 배경값을 평가하는 것이 필수적입니다. 웰(well) 간의 변동성을 고려하여, 개별 웰의 데이터를 입력값으로 정규화하는 것이 유용합니다.이들은 융해 온도에서의 더 세밀한 단계에 의해 결정됩니다. 이러한 점과 락 다이(rock die)와 같은 다른 염료의 포함은 피펫팅 오차나 검출기 간의 차이로 인해 발생하는 고유한 변동성을 보정해 줍니다. 이 기법을 통해 우리는 개별 염기 절제 복구 성분이 전체적인 복구 활성과 용량에 미치는 영향을 규명할 수 있었습니다.이는 기존의 방법으로는 검출할 수 없었을 미세한 변화까지 찾아낼 수 있을 만큼 민감합니다.

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

여기에서는 뉴클레오티드 절제 복구 시스템을 예로 들어 단일 분자 AFM 이미징을 통한 다양한 DNA 병변 인식 접근 방식에 대한 연구를 시연합니다. DNA 및 단백질 시료 준비 절차와 AFM 실험을 위한 실험 및 분석 세부 사항에 대해 설명합니다.

핵 포스 현미경 검사에 의한 DNA 절편 검사에서의 DNA 병변 인식 연구

여기에서는 유전 독성 스트레스에 노출 된 현탁 세포 배양 물에서 ATM과 p53 사이의 직접적인 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하고 시각화하기 위해 현장에서의 근접 연결 분석 (PLA)이 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

Proximity Ligation Assay를 이용한 현탁 세포 배양에서의 DNA 손상 유발 단백질 복합체의 검출 및 가시화

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

이 프로토콜의 목표는 플라스 미드 DNA에 정의 된 DNA-단백질 crosslinks의 수리 계량. Lesioned 플라스 미드는 받는 사람 포유류 세포 선 및 여러 시간 포인트 후 transfection에 수확 하는 저 분자 무게에 페. DNA 복구 속도 스트랜드 특정 뇌관 연장 정량 뒤를 사용 하 여 정량.

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

D-루프 포획(DLC) 및 D-루프 확장(DLE) 분석은 정량적 PCR과 함께 근접 결찰 원리를 활용하여 사카로마이세스 세레비시아에서 유도성 이중 가닥 절단 부위에서 D-루프 형성, D-루프 확장 및 생성물 형성을 정량화합니다.

사카로마이세스 세레비시아에서 근접 결찰 및 정량적 PCR을 통한 상동 재조합 중간체의 검출

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

배우세요 분자 비콘을 활용한 세포 핵 추출물의 DNA 절단 복구 활성을 실시간으로 정량 분석하는 방법입니다. 이 기술은 암 생물학 및 치료제 개발 연구에 활용됩니다.

병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

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