병변 특정 분자 비콘을 활용 세포 Lysates의 기본 절단 복구 활동의 양적, 실시간 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 DNA 복구 및 세포 핵 추출물이 복구되면 형광을 발하는 분자 비콘을 사용하여 실시간으로 DNA 복구 및 세포 핵 추출물의 속도를 측정하는 것입니다. 염기성 절제 복구 분자 비콘은 5개의 프라임 말단에 6개의 곡선 옥시 플루오레세인 부분이 접합되고 접혔을 때 3개의 프라임 말단에 접합되는 딜 모티가 있는 단일 염기 병변을 포함하는 줄기 루프 구조의 데옥시 올리고뉴클레오티드로 구성됩니다. six fam moty는 산림 관리인의 공명 에너지 전달을 통해 비형광 방식으로 dab sil에 의해 담금질됩니다.

DNA 복구 활성을 평가하기 위해 비콘은 복구 효소를 포함하는 세포 핵 추출물과 함께 배양됩니다. DNA Glycosylate가 인식되어 비콘의 DNA 병변을 제거합니다. 생성된 ABA 부위는 AP 엔도뉴클레아제 1 또는 원숭이 1에 대한 기질입니다.인식 시 APE one은 ABA 부위에서 DNA 골격을 절단하여 6개의 fam을 포함하는 DNA가 헤어핀에서 자유롭게 해리될 수 있도록 합니다.

소광제에서 분리되면 DNA 복구 수준에 비례하는 형광이 증가하며 정량적 Real-Time PCR 기계를 사용하여 실시간으로 평가할 수 있습니다. DNA 손상을 복구하는 능력은 모든 세포와 모든 유기체에 매우 중요합니다. 수많은 세포 DNA 복구 경로 중에서 염기 절제 복구 대상, 산화 또는 화학적 모욕으로 인해 발생할 수 있는 손상된 염기염기는 염기 절제 복구에 영향을 미칠 수 있는 개별 세포 요소의 역할을 설명하는 것이 당사 실험실 연구의 주요 목표 중 하나입니다.

따라서 DNA 복구 활성을 정확하고 민감하게 측정하는 것이 우리 실험실의 관심사가 되었습니다. 이 분석은 이러한 데이터를 제공할 수 있습니다. 32 PN 라벨링 및 겔 전기영동에 의한 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 당사의 기술이 방사성 표지된 기판을 사용하지 않고 dary repair rate를 실시간으로 측정할 수 있으며 매우 넓은 동적 범위를 갖는다는 것입니다.

또한, 이 접근법은 기질 특이성을 결정하기 위해 여러 가지 다른 플루오로 4 및/또는 염기 병변을 활용할 수 있습니다. 우리는 이 분석이 매우 정량적이며 다양한 환경에서 매우 민감하다는 것을 보여주었습니다. 이 염기 절제 복구 분자 비콘 분석은 역학 분석에 적용할 수 있습니다.

이 분석법의 높은 감도와 특이성으로 정확한 염기 절제 복구 정량화가 가능하므로 복구 억제제 스크리닝 또는 검증에 유용합니다. 또한 기능적 바이오마커 측정을 위해 dary repair activity와 조직 및 종양 세포 용해물을 측정하는 데 적용할 수 있습니다. 이 분석에 사용할 분자 비콘을 설계할 때 여기에 표시된 것처럼 길이가 43개 염기인 다음 DNA 올리고뉴클레오티드를 고려하십시오.

잘 작동하십시오. DNA 염기서열은 고유하지 않지만 헤어핀 구조를 형성할 수 있어야 합니다. 여기에 나타난 바와 같이 무릎을 꿇었을 때, 우라실 또는 테트라 하이드로 푸린과 같은 특정 기저 병변을 삽입함으로써 특이성을 얻을 수 있습니다.

5 프라임 엔드에서 6 염기 X 위치에서 GC 함량은 32% 이상이어야 하며 GB 염기는 5 프라임 엔드에 배치되어서는 안 됩니다. 6 개의 카르복시 플루 오레 세인 또는 6 개의 팜은 5 개의 프라임 말단에 접합되어야하며 3 개의 프라임 말단은 댑 실로 수정되어야합니다. 이것은 글리코실 방출의 결합과 활성을 보장하기 위해 DNA 복구 단백질의 기질이 될 것입니다.

병변의 위치는 헤어핀 구조와 DNA의 끝에서 충분한 공간을 제공하기 위해 선택되었습니다. 줄기 또는 헤어핀 듀플렉스의 길이는 최소 15개의 염기 쌍이어야 합니다. 권장 루프 길이는 13베이스입니다.

대조군 분자 비콘은 DNA 병변을 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 실험용 분자 비콘과 동일해야 합니다. 따라서 DNA 복구 효소에 의해 인식되어서는 안 됩니다. 분자 비콘이 준비되면 가열될 때까지 비콘이 형광을 발하지 않도록 품질 평가를 수행해야 합니다.

또한 최적의 용융 온도를 결정하기 위해 추출 절차의 모든 단계는 얼음 위 또는 섭씨 4도에서 수행해야 합니다. 단백질 안정성을 보장하려면 사전 냉각을 통해 실험을 준비하십시오. 시료당 1리터 비커 2개, 투석 완충액, 마이크로 원심분리기, 튜브, 주사기 및 바늘.

15ml 원뿔형 튜브에 라벨을 붙이고 얼음 위에 놓습니다. 세포에서 성장 배지를 흡입한 다음 두 번째 세척 후 7.5ml의 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 각 접시에 5ml의 차가운 PBS를 넣고 세포 리프터를 사용하여 플레이트에서 세포를 긁어냅니다.

세포를 냉각된 15ml 원추형 튜브로 옮긴 다음 섭씨 4도에서 500배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 스핀 후 상층액을 제거하고 유사한 튜브에 있는 알려진 액체 부피와 비교하여 충전된 세포 부피를 추정합니다. 튜브를 1분 더 원심분리한 다음 피펫 소생술로 남아 있는 PBS를 제거합니다.

150마이크로리터의 핵 버스터 추출 시약에 세포 펠릿을 현탁시키며, 포장된 세포 부피 50마이크로리터당 하나씩 사용합니다. 그런 다음 재현탁된 세포를 미리 냉각된 1.5ml 튜브로 옮기고 고속으로 15초 동안 와류를 일으킵니다. 와류 후에, 5 분 동안 얼음에 관을 배양하십시오, 그 후에 또 다른 15 초 동안 와류 및 13, 섭씨 4도에 5 분 동안 G 000 번 원심분리기.

스핀 후 세포질 분획을 포함하는 상층액을 제거하고 버립니다. Resus는 1 마이크로 리터의 Resus 현탁액 100 x 프로테아제 억제제 칵테일, 1 마이크로 리터의 100 밀리 몰 DTT 및 75 마이크로 리터의 핵 버스터 추출의 혼합물로 펠렛을 현탁시킵니다. 포장된 세포 부피 50마이크로리터당 2개의 시약.

Vortex의 세포를 15초 동안 고속으로 움직입니다. 5 분 동안 얼음 위에 다시 배화 13, 섭씨 4 도에서 5 분 동안 G 000 번 고속 원심 분리기에서 15 초 동안 와류. 회전급강하 다음 주사기는 핵 단백질을 포함하는 상등액을 7, 000의 분자량 커트오프를 가진 활주 투석 카세트에 옮기기 위하여 주사통을 이용한다.

다음으로, 500마이크로리터의 1몰 DTT를 500ml의 사전 냉장 투석 완충액에 첨가하고 부드럽게 저어주면서 섭씨 4도에서 90분 동안 용해물을 투석합니다. 90분 후, 투석 카세트를 DTT가 포함된 0.5리터의 사전 냉각 투석 버퍼가 들어 있는 두 번째 비커로 옮기고 투석합니다. 투석 후 섭씨 4도에서 부드럽게 저어 90 분 동안 용해하면 단백질 농도가 높아 추출물이 결정화되었을 수 있습니다.

다음으로, 카세트를 주입하는 데 사용된 포트가 아닌 다른 포트에 새 주사기를 삽입하고 투석 카세트에서 투석된 핵 단백질 용액을 수집합니다. 투석된 핵 단백질 용액을 제거할 때 흐릿해 보이는 결정을 포함시키십시오. 샘플을 마이크로 원심분리 튜브에 20마이크로리터씩 드라이 아이스에서 급속 동결한 다음 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

단백질의 농도를 측정하고 동봉된 문서에 설명된 대로 품질 관리를 수행합니다. 분자 비콘 분석을 수행하기 위해 DTT 1밀리몰을 함유한 염기성 시이온 복구 반응 완충액을 사용하여 세포 용해물을 단백질 마이크로리터당 2마이크로그램으로 용해하고, 염기성 절제 복구 반응 완충액을 사용하여 분자 비콘을 200마이크로몰로 희석합니다. 정량적 Real-Time PCR 기계는 일반적으로 형광측정기로 사용되지 않으므로 정량적 Real-Time PCR 기계의 실행 방법을 변경하여 섭씨 37도에서 최소 180주기 동안 20초마다 데이터를 수집합니다.

그런 다음 분자 표지의 최대 형광에서 15 사이클 동안 20 초마다 정규화를위한 데이터를 얻습니다. 반응 부피를 25마이크로리터로 설정합니다. 그런 다음 실험 유형으로 선택된 표준 곡선으로 적용된 바이오시스템 소프트웨어를 사용하여 기기에서 플레이트 설계를 설정하고 플레이트 레이아웃을 완성합니다.

이 표에는 예제가 나와 있으며, 함께 제공되는 문서에서도 찾을 수 있습니다. 표준 곡선으로 선택한 웰에 아무 것도 추가하지 마십시오. 염기성 절제 복구 반응 완충액 DTT 세포 용해물을 마이크로리터당 2마이크로그램의 농도로 놓고 얼음 실험에 사용되는 모든 분자 비콘을 놓습니다.

그런 다음 DTT를 염기성 절제 복구 반응 완충액에 추가하여 최종 농도 1밀리몰 피펫이 되도록 합니다. DTT가 포함된 15마이크로리터의 염기성 절제 복구 반응 완충액을 얼음 위의 호환 가능한 광학 Q-R-T-P-C-R 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 다음으로, 플레이트 레이아웃에 따라 비콘을 적절한 웰에 피펫으로 넣습니다.

용해물과 분자 비콘 또는 대조군의 각 조합은 삼중으로 분석해야 합니다. 마지막으로, 희석된 핵 용해물의 웰당 5마이크로리터를 적절한 웰에 피펫팅합니다. 모든 분자 비콘 시약을 차갑게 유지하고 마지막 단계로 용해물을 플레이트에 피펫으로 넣는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

용해물에는 활성 단백질이 포함되어 있으며 반응 혼합물에 피펫으로 삽입되자마자 분자 비콘을 복구하기 시작한다는 점을 기억하십시오. 따라서 측정을 시작하기 전에 발생하는 비콘 수리량을 최소화하기 위해 모든 시약을 차갑게 유지하는 것이 매우 중요합니다. 모든 것이 추가되면 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 부드럽게 두드려 혼합합니다.

그런 다음 원심분리기로 10초 동안 빠르게 회전하여 스핀 후 튜브 또는 플레이트 바닥에서 용액을 수집하고, 플레이트를 정량적 realtime PCR 기계에 삽입하고 완료 후 분석을 시작하고, 원시 데이터를 가급적이면 Excel 형식으로 내보내고, 필요한 계산이 완료되면 관련 문서의 지침에 따라 데이터를 분석합니다. 정규화된 형광 데이터를 해당 오류와 함께 산점도에서 시간 대비 자유 fam 백분율(초)로 플롯하여 LN 4 28 세포 및 LN 4 28 MPG로 지정된 MPG 과발현 세포주에서 핵 추출물의 DNA 복구 활성 및 품질을 평가합니다. 이 비디오에 설명된 분석은 APE 단일 기질 테트라 퓨린을 양성 대조군으로 포함하는 분자 비콘을 사용하여 수행되었습니다.

이 그림에서 볼 수 있듯이 두 세포주 모두 MPG 기질 제거에 특이적인 가파른 경사, DNA 글리코세이트 활성에서 알 수 있듯이 강력한 APE 1 활성을 가지고 있습니다. HX로 표시된 하이포하이포잔틴(Hypo hypoxanthine)은 두 세포주에서 핵 용해물에서 측정되었습니다. 각 용해물은 대조군 비콘에 대한 염기성 절제 복구 제어 분자 비콘 또는 염기 절제 복구 HX 분자 비콘을 사용하여 분석되었으며, 제어 비콘 LN 4 28은 녹색으로 표시되고 LN 4 28 MPG는 하이포 비콘에 대해 자주색으로 표시됩니다.

LN 4 28은 파란색으로, LN 4 28 MPG는 주황색으로 표시됩니다. 결과는 평균 형광 단위인 A와 정규화된 형광 단위인 B로 보고됩니다. HX 복구를 나타내는 형광의 시간 의존적 증가는 각 세포에서 발생했습니다.

Lysate는 예상대로 HX 분자 비콘으로 배양되었습니다. 주황색 흔적으로 표시된 LN 4 28 MPG 세포주는 최소한의 MPG 단백질을 가진 부모 LN 4 28 세포주보다 형광의 더 빠른 축적에 의해 나타난 바와 같이 훨씬 더 높은 복구 속도를 가졌습니다. 따라서 특정 복구 단백질에 의한 특정 DNA 병변의 복구 속도는 비특이적 DNA 절단의 최소 배경 수준으로 세포 추출물에서 실시간으로 측정할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 정제된 단백질 또는 세포 용해물을 사용하여 분자 비콘을 설계하고 실시간 DNA 복구율을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 분석과 관련하여, dynamic range 및 background values를 평가하는 것은 positive 및 negative control beacons의 유무에 관계없이 control reactions를 포함하여 수행하는 것이 필수적입니다. well에서 well로의 변동성을 고려할 때 개별 well의 데이터를 입력 값으로 정규화하는 것이 유용합니다.

그것들은 용융 온도에서 더 미세한 단계에 의해 결정됩니다. 이와 암석 다이와 같은 다른 염료의 포함은 파이펫팅 오류 또는 검출기의 차이에 내재된 변동성을 설명합니다. 이 기술을 통해 개별 기반 절제 수복 구성 요소가 전체 수선 활동 및 용량에 미치는 영향을 설명할 수 있었습니다.

기존 방법으로는 감지할 수 없었던 작은 변화를 마스킹할 수 있을 만큼 민감합니다.