Name: 온칩 내피 염증성 Phenotyping (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-21T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 학습하세요 온칩 내피 염증성 Phenotyping 기법으로 전단응력이 인간 대동맥 내피세포의 염증 반응 및 단핵세포 부착에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 심혈관 질환 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 스콧 I. 사이먼과 앤서니 G. Passerini에 NIH / NHLBI 부여 R01 HL082689에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양 및 기판 준비 <ol><li> 선반을 사용하여 100 X 20mm의 조직 배양 접시 (BD 팔콘)에서 3 인치 원형 기판을 자르고. 70 % 에탄올의 침수에 의해 기판을 소독. 상온에서 1 시간 4 ML 타입 - 나 콜라겐 (100 μg / ml) 쇼핑과 배양 접시와 코트의 장소는 다음 네 ML 1 X PBS와 린스. </li><li> 기판에 직접 한 ML을 적용하여 6.5x10 5 셀 / ML 및 종자에서 인간의 대동맥 내피 세포 (HAEC, 통로 4-6)을 일시 중지합니다. 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 장소와 세포가 1 시간의 기판에 충실하실 수 있습니다. </li><li> 셀 1X 항생제 - antimycotic 솔루션을 보완 내피 성장 중간 2 (EGM-2) 9 ML을 추가합니다. 세포가 90 % confluency 도달할 때까지 매 이일 미디어를 변경합니다. </li><li> 10% FBS와 항생제 1X-antimycotic 솔루션을 보완 RPMI 1640 배지에서 THP-1 세포를 유지합니다. 그들이 1 밀도에 도달 통과 세포0 6 셀 / ML. </li></ol> 2. 세포 전단 프로토콜 세포는 맞춤형 콘 및 플레이트 셀 전단 장치 (CSD)에서 조건됩니다. 장치 세부 사항 및 설계 사양은 표 1과 그림 4에 설명되어 있습니다. <ol><li> CSD를 준비합니다. 에탄올과 챔버 주택 소독과 멸균 PBS로 린스. ° C와 수준이 원추가 세포 단일층에 직각인지 확인하기 위해 37로 주택을 가열. 주택의 바닥에서 세포와 기판을 조립하고 원하는 높이로 원추형으로 설정합니다. </li><li> Leibovitz-15 (L-15) CO 2의 부재에 적절한 산도를 유지하기 위해 전단 매체로서 내피 BulletKit으로 보완 매체를 사용하십시오. , 염증을 자극 전단 매체에 종양 괴사 인자-α (TNF-α, 0.5 NG / ML)를 추가하고 입구 포트에 연결된 주사기를 통해 장치에서 6 ML 주사, 공기를 소개하지 돌보는하려면챔버에 거품. </li><li> 높은 진도 꾸준한 전단 응력에서 전단 세포 (HSS, 15 다인 / ㎝ 2) 4 시간 또는 oscillatory 전단 응력 (OSS, 0 ± 5 다인 / ㎝ 2, 1 Hz에서). 원하는 SS는 정확하게 이전에 설명한대로 마이크로 스테핑 모터로 제어되는 세포, 상기 원추형 회전에 의해 달성되는 6 표면의 벽, SS (τ W)에 의해 approximated있다. : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="등식 1" /> μ는 매체의 점도이고, ω는 원추의 각속도이며, α는 원추 각도 (0.5 °)입니다. 기판과 원뿔 정렬은 0.05 정밀 측량을 통한 °와 20에서 설정한 간격의 높이 ± 10 μm의 τ w에서 원주와 레이디얼 편차를 최소화하기 위해 깊이 게이지를 사용하여 이내로 조정됩니다. 장치는 층류 특성을 보장하기 위해 검증되었습니다. 광고 제거장치에서 ells 및 단핵구 유착의 분석을 위해 준비합니다. </li></ol> 3. PDMS Microfluidic 상공 회의소의 제작 <ol><li> 응용 프로그램에 따라 원하는 microfluidic 채널 번호와 채널 높이 마스터 몰드를 구합니다. 이 프로토콜에서 사용되는 구체적인 설계의 특성은 5000 DPI에서 1 간단히는 채널 네트워크 (오토 데스크 발명가) CAD 소프트웨어를 사용하여 설계되었습니다. 이들을 만들기위한 방법은 이미 잘 문학에 설명되어 있습니다. 표 1에서 상세하고 인쇄됩니다 투명성에. 부정적인 포토 레지스트 (SU8은) 100 μm의의 두께로 실리콘 웨이퍼에 소용된다. 투명성은 중첩 및 자외선에 노출됩니다. 비 polymerized 포토 레지스트는 긍정적인 복제 마스터를 생성하기 위해 제거됩니다. </li><li> 실리콘은 무게는 보트 무게로 에이전트 10시 1분 치료와 PDMS 솔루션 믹스 실리콘 기반을 만들고 5 ML serological pipet으로 저어합니다. 벽면을 다쳤어요하​​지 않도록주의이 솔루션에 플라스틱 부스러기를 추가하지 않도록 배 무게 때문에. </li><li> 100x15mm 배양 접시에있는 마스터 웨이퍼를 넣은 그릇에 PDMS 용액을 붓는다. </li><li> 접시를 커버하고 거품을 제거하는 15 분 동안 진공 용기에 넣습니다. 15 분 배양 접시를 꺼내 부드럽게 표면을 통해 공기를 불어하여 ​​여분의 거품을 제거한 후. </li><li> 70에서 1 시간 동안 오븐에서 페트리 접시를 놓습니다 ° C. 접시를 제거하고 날카로운 칼날을 사용하여 microfluidic 챔버를 했네요. </li></ol> 4. 현미경에 대한 장치의 조립 <ol><li> 거꾸로 현미경으로 광원의 전원을 켜고 37로 히터를 설정할 ° C를 10 ML의 주사기에 튜브를 부착하고 아무런 거품이 없다는 등의 증류수로 채운다. 한 다인 / ㎝ 2의 벽에 SS를 유도하기 위해 주사기 펌프 및 설정 유량에 주사기를 놓습니다. 채널의 중심선을 따라 생성된 벽면 전단 응력은 (τ W) 표준을 사용하여 approximated있다병렬 플레이트 흐름 챔버를위한 방정식 : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="등식이" /> μ는 체적 유량은 Q 매체의 점도이고, H는 채널의 높이이며, w는 채널 폭입니다. 참고 : 채널 유한 너비 때문에 실제 τ w는 w는 채널에 따라 같이 달라집니다 화면 비율 및 성능은 측면 벽에 가까운 25 %로 피해야합니다. 1,7 </li><li> 물에 PDMS 챔버를 삽입하고 각 채널에서 공기를 제거하는 100μl micropipette을 사용합니다. 챔버는 밸브가 해제로 설정되어 있는지 확인 만들기 위해 진공 어댑터를 연결합니다. </li><li> 목표 이상의 HAEC의 단일층과 배양 접시를 놓습니다. 페트리 접시 위에 PDMS 챔버를 삽입하고 기포가 장치와 단일층 사이에 형성 없다는 것을 확보하면서 조심스럽게 HAEC 단일층에 설정합니다. 진공이 켜져 있고 챔버에 단단히 부착되도록 밸브를 켭니다. </리&gt; <li> 19 게이지 바늘은 금속의 왼쪽에만 5mm가있다는 것을 같은 무딘 잘라. 버퍼와 플라스틱 저수지를 입력하고 PDMS 챔버 입구에 넣어. 사용되는 채널의 적절한 번호를 반복합니다. 주사기 펌프에서 PDMS 채널 출구로 튜브를 연결합니다. </li></ol> 5. 전단 응력 이하 단핵구 접착 분석 <ol><li> 2x10 6 셀 / HBSS + 칼슘 2 + / MG 2 + + 0.1 %의 HSA에 ML에서 THP-1 세포를 일시 중지합니다. 상온에서 15 분 동안 stromal 파생된 요소-1 (SDF-1, 50 μg / ml) 쇼핑과 잠복기에 의해 활성화 THP-1 세포. </li><li> 흐름을 확립하기 위해 주사기 펌프를 켜고 다음 기포를 도입하지 않고 저수지에 세포 현탁액의 50 μl를 추가합니다. 일단 흐름이 완전히 개발, 데이터 수집을 시작합니다. </li><li> 솔루션은 낮게 잡으면 저수지에 버퍼를 추가, 적절한 유속에서 5 분 동안 실행합니다. 흐름 스트림에 어떤 언바운드 세포를 씻어하기 채널로 버퍼를 흐르는 계속합니다. </li></ol> 6. 데이터 수집 및 분석 <ol><li> 사이드 가까운 즉시 입학 후 또는 출구 포트를 이전하거나 25 % 기록하지 않도록 돌보는 채널에 3 개소에서 채널의 세로 축을 따라 완전히 발달 흐름을 따라 2 분에 대해 3 프레임 / 초에서 디지털 이미지 시퀀스를 취득 벽. </li><li> 단일층 같은 초점 평면에서 자신의 위상 밝은 모습을 파악하여 현장 체포 당 세포의 수를 세어보세요. </li><li> 기업 셀 체포 움직임에 의해 정의되고 &lt;10 s에 ½ 세포 직경. 3 랜덤 필드 / 채널 이상 평균 데이터 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계량. </li></ol> 7. 대표 결과 혈관 내피가 균일하게 전신 염증에 기여 agonists에 노출되고 있지만, 죽상 경화증은 내피 기능의 공간적 이질 고발, 동맥의 흐름 변동의 사이트에서 우선적으로 개발 초점 질병 8. </suP와 같은 TNF-α 등&gt; 순환 염증 중재자는 신진 대사 스트레스가 인간의 혈청에서 상승하고 장애 내피 기능과 상관 관계. 9, 10 TNF-α는 세포 유착 분자의 상향 조절 (달았을 포함 EC에 잘 특성화 응답을 유도하고 ; 예 VCAM-1, ICAM-1, E-selectin)과 순환, 초기 atherosclerotic 병변의 특징에서 모집 monocytes 11 혈류 역학은 내피 염증성 표현형의 중요한 조절기는 것을 12 하이 크기의 전단 응력이 chemokines (HSS..; 예를 들어 15 dynes / ㎝ 2) 또는 타악기 전단 응력 (PSS, 예 : 15 ± 5 dynes / ㎝ 2) 동맥에서 TNF-α 유발 반응을 다운 규제 죽상 경화증에 대한 저항의 사이트와 연관된. 반대로, 낮은 크기의 전단 응력 (LSS; 예 2 dynes / ㎝ 2) 또는 oscillatory 전단, 생체내에 감염될 사이트의 특성 ​​(OSS 예 : 0 ± 5 dynes / cm 2), cytoki 증명했다NE-유도 염증. 13, 14 우리 microfluidic PDMS 장치는 내피 기능과 병리의 규정에 유체 요소로 대사 스트레스가 중첩 관련된 가설을 테스트하는 기계론의 연구 수행을위한 플랫폼을 제공합니다. 접근 방식의 유틸리티와 다기능는 크게 다음과 같은 대표적인 결과를 통해 보여주고있다. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="그림 1" /> 1 그림. 전단 응력은 differentially TNF-α 염증 내피 monolayers에 THP-1 세포 접착력을 modulates.이 데이터는 위의 동영상에서 설명 설명한 세부적인 프로토콜을 사용하여 획득했다. HAEC의 monolayers 동시에 염증성 시토킨 TNF-α (0.5 NG / ML, VCAM-1까지 규제를위한 ~ EC 50)과 HSS (15 dynes / ㎝ 2) 또는 OSS (0 ± 5 dynes 중의 낮은 복용량에 노출되었다 descri 등 4 시간에 대한 사용자 지정 CSD의 / ㎝ 2, 1 Hz에서)자세한 프로토콜의 침대. THP-1 세포 체포 PDMS 흐름 챔버의 전단 유동 하에서 계량되었다. 인간 monocytes의 표현형을 모방한 것이었 이러한 세포 라인의 재현성 및 사용의 용이성을 위해 선정되었습니다. HSS 감쇠 염증 반응은 감소 THP-1 세포 체포 결과, OSS에 비해. 데이터는 학생의 T-테스트에 의해 분석되었으며 말은 ± 3 독립적인 실험 SEM을로 표현됩니다. DeVerse 외로부터 허가를 적응 5. 다음 데이터가 출판 작업에서 예제를 사용하여 우리의 접근 방법의 다양성을 보여줍니다. 해당되는 위의 프로토콜의 출발이 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 시토킨 유도된 VCAM-1 표현과 전단 응력 구배에 단핵구 모집의 변조. ) HAEC의 monolayers는 플로 아래에 4 시간을 위해 TNF-α (0.3 NG / ML)로 자극했다Hele-쏘 플로우 이론을 바탕으로 설계된 VMMC의 w 15 채널의 중심선을 따라 SS 친위대 크기의 선형 감소는 2 차원 침체 흐름의 합리화에 맞춰 챔버 측벽을 설계하고 끝을 형성함으로써 달성되었다 채널의 ISO-잠재적인 라인과 일치합니다. 입구 (X)에서 축 거리에서이 채널의 중심선을 따라 생성된 벽면 전단 응력은 (τ W)에 의해 주어진다 : <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="등식 3" /> μ는 체적 유량은 Q 매체의 점도이고, H는 채널 높이, W 1 채널 입구 폭이며, L은 전체 채널의 길이입니다. Q가 16 일부터 SS 친위대 진도에서 그라디언트를 생성하는 선정되었습니다 outle에 dynes / 정체 지점에서 0으로 입구에서 cm 2 &quot;&quot;단지 근위티. B)-C) VCAM-1 표현은 양자 도트에 복합 및 unstimulated 정적 제어의 비율이 평균 형광 강도 (MFI)로 제시 항체를 사용하여 immunofluorescence 현미경에 의해 원위치로 측정되었다. SS는 unstimulated HAEC (회색 삼각형)에서 낮은 VCAM-1의 기저 레벨을 조절하지 않았다. 그러나, VCAM-1 표현)은 ~ 2 dynes / ㎝ 2 시에 피킹 및 전단 크기는&gt; 5 dynes / ㎝ 2 (검은색 사각형). D에서 TNF-α의 기준으로 반환하거나 아래, LSS의 크기는에서 TNF-α에 상대적으로 증가 Monocytes (10 6 / ML)가)에서와 같이 preconditioned monolayers 이상의 병렬 플로우 채널에서 5 분 동안 두 dynes / ㎝ 2 시에 perfused되었다. 내피에 단핵구 모집은 양적 주어진 전단 응력 크기에서 VCAM-1 표현과 상호. 특히, monolaye에서 훌륭한 공간 해상도로 VCAM-1 표현과 단핵구 모집을 알아내기 수있는 능력R은 별도의 실험에서 전단 중 몇 이산 값을 적용하여 평가되지 않을 SS 친위대 크기의 좁은 범위에서 상당한 변화를 발표했다. 데이터는 TNF-α의 * P &lt;0.05 정적인 조건 하에서 반복 측정 ANOVA와 뉴만 - Keuls posttest에 의해 평가의 차이에 의해 분석되었다. 데이터는 의미있다 ± SEM을 3-6 독립적인 실험에서. Tsou 외 2.의 허가와 적응 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 트리 글리세 라이드 풍부한 lipoproteins (TGRL)는 기증자 혈청 트리 글리세 라이드 수준과 VCAM-1 표현에 비례 시토킨 유도된 염증을 조절. HAEC의 monolayers는 TGRL (10 MG / DL과 동시에 4 시간 동안 TNF-α (0.3 NG / ML)로 자극했다 ApoB)는 정적 문화에 고지방 음식을 먹은 후엔 인간 주제에 격리.) VCAM-1 표현은 유동세포계측법에 의해 정지 EC에서 별도로 측정되었다그리고 단핵구 유착은 세부적인 프로토콜에 설명된대로 VMMC을 사용하여 계량. 데이터는 TNF-α의 % 변화로 제공됩니다. 단핵구 체포는 기증자 혈청 트리 글리세 라이드의 수준과 직접적으로 증가했다. B) 프로 염증성 기증자의 하위 집합에 대한 단핵구 체포가 VCAM-1 차단 항체의 면전에서 abrogated되었다 내피 VCAM-1 표현에 정비례에서 변경될. 의의가 결합하여 학생의 T-테스트에 의해 결정되었다 3-5 독립적인 실험에서 ± SEM을 의미합니다. 왕 외로부터 허가를 적응 4.

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우리는 캠 표현과 단핵구 유착의 실시간 영상을 통해 내피 염증성 표현형의 온 칩 평가를위한 microfluidic PDMS 장치의 사용을 설명합니다. 우리의 접근 방식의 가장 큰 장점은 atherogenic 혈관에 전단 응력을 미러링 정의된 유체 조건에서식이 lipids 및 크린 시토킨 등의 염증 중재자에 노출된 세포에서 내피 기능 장애와 관련된 결과를 계량하는 능력에있다. VMMC는 시약 또는 제한된 공급이있을 수 있습니다 재료의 소량의 사용을 촉진하고 저렴한 사용자 정의 및 높은 처리량 의무가되는 추가된 장점이 있습니다. microfluidic 장치의 사용은 가위로 교양 EC의 반응을 조사하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다 macroscale 접근법에 대한 대안을 나타냅니다. 이러한 CA는 각 병렬 플레이트 흐름 챔버, 원통형 튜브, 그리고 원추 앤 판 viscometers를 포함꾸준한, 판상 Poiseuille 흐름 조건 (16 년 검토) 순례...

<table border="1"><tbody><tr><td> 아이템 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 100 X 20mm 배양 접시 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,003 </td></tr><tr><td> 에탄올 95% </td><td> EMD 화학 </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - 이력서 </td></tr><tr><td> 나는 쥐 꼬리 파생 콜라겐을 입력합니다 </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> 인간의 대동맥 내피 세포 </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> 항생제 - Antimycotic 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> 내피 BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> 내피 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 미디어-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ML의 주사기 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 309,604 </td></tr><tr><td> 폴리 우레탄 튜브 </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 미디어 </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머베이스 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 경화 에이전트 </td><td> 다우 코닝 </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 포토 레지스트 마스터 웨이퍼 </td><td> UC 데이비스 팬 연구실 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 이클립스 TE200 거꾸로 현미경 </td><td> 니콘 </td><td> 이클립스 TE200 </td></tr><tr><td> 주사기 펌프 </td><td> 하버드 장치 </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 게이지 피하 바늘 </td><td> 켄달 </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 Monocytic 세포주 </td><td> ATCC </td><td> 티비-202 </td></tr><tr><td> HBSS 칼슘 2 + / MG 2 (행크스는 생리 식염수를 버퍼) + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> 종양 괴사 요인 알파 (TNF-α) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromal 유래 팩터 - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 350 NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10-040 - 이력서 </td></tr><tr><td> 알부민 혈청 인간 (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> 표 2. 특정 시약 및 장비.

온칩 내피 염증성 phenotyping

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis은 내피 기능 장애의 결과로 조직의 염증의 상승된 상태에 기여하는 대사 이상에 의해 potentiated됩니다. 그러나 위험 개인의 수준을 의미하는 내피의 초기 기능 변경은 직접 가이드 치료 전략을 돕기 위해 임상적으로 평가되지 않습니다. 또한, 지역 혈류 역학에 의한 염증의 규정은 죽상 경화증의 비 임의의 공간적 분포에 기여하고 있지만 메커니즘은 생체내에 윤곽을 그리다하기가 어렵습니다. 우리는 정확한 유량 조건 하에서 인간 내피 세포 (EC)와 monocytes의 염증성 이벤트의 정량적 분석 신진 대사 섭동에 실험실 - 온 - 칩 기반의 접근 방식을 설명합니다. 소프트 리소그래피의 표준 방식은 교양 EC의 monolayers에 직접 바인딩되는 혈관 모방 microfluidic 챔버 (VMMC)를 microfabricate하는 데 사용됩니다. 1이 디바이스 시약 작은 볼륨 동안 사용의 이점을 가지고잘 정의된 전단 필드에 노출 EC의 세포막에서 염증 이벤트에 직접 이미징을위한 플랫폼을 제공합니다. 우리는 성공적으로 인간의 대동맥 EC (HAEC)에서 시토킨-2 지질-3, 4, 분노 유발 5 염증을 조사하기 위해 이러한 장치를 적용했습니다. 여기 분석 monocytic 셀 (THP-1) 압연 및 차동 전단 특성 아래 조건과 염증성 시토킨 TNF-α에 의해 활성화됩니다 HAEC monolayers의 체포에 VMMC의 사용을 문서화. 이러한 연구는 신진 대사 위험 요인 아래 atherosusceptibility으로 기계론의 통찰력을 제공하고 있습니다.

석판술으로 새겨져와 PDMS에서 가공 Microfluidic 흐름 여왕님 EC 장애와 염증과 관련된 기능적 결과를 알아내기 위해 적용됩니다. 대표 실험에서는 차등 전단 응력의 능력 시토킨 활성화 EC monolayers에 monocytic 세포 접착을 조절하기 위해이 입증되었습니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

죽상동맥경화증은 전신 염증 상태를 심화시키는 대사 이상에 의해 촉진되며, 이는 내피...

본 영상의 목적은 혈관 내피세포의 염증 상태를 특성화하기 위한 랩온어칩(lab on a chip) 기술을 시연하는 것입니다. 먼저, 인간 대동맥 내피세포를 조직 배양 기질 위에서 합류(confluence)될 때까지 배양한 다음, Conan 플레이트 전단 장치에 삽입합니다. 세포를 전염증성 사이토카인인 TNF alpha로 처리함과 동시에, 기질 위의 콘 회전을 정밀하게 제어하여 4시간 동안 서로 다른 전단 응력 조건에 노출시킵니다. 전단 응력은 사이토카인에 대한 잘 알려진 염증 반응을 조절합니다.여기에는 VCAM-1 및 ICAM-1과 같은 접착 분자의 상향 조절이 포함됩니다. 기질을 현미경 스테이지로 옮긴 후, APDMS 미세유체 장치를 단층 위에 직접 진공 밀봉하여 유로를 생성합니다. 활성화된 단핵구인 THP-1 세포를 전처치된 hEC 위로 흐르게 하면, 세포 접착 분자의 발현 수준에 비례하여 세포가 결합하게 됩니다.혈관 내피세포의 염증 상태는 강력하게 부착된 THP-1 세포의 총 수를 정량화하여 결정합니다. 안녕하세요, 저는 She D Diverse이고, 저는 Greg Foster입니다. 그리고 저는 Keith Bailey입니다.우리는 캘리포니아 대학교 데이비스 캠퍼스 생체 의공학과의 Pastor 교수와 Simon 교수의 연구실에 있습니다. 오늘은 혈관 내피 기능 장애와 염증을 정량적으로 조사하기 위한 랩온어칩(lab-on-a-chip) 기반 접근법의 활용 방법을 설명하겠습니다. 이러한 도구들은 대사성 스트레스와 유체역학적 요인의 중첩, 그리고 내피 염증 표현형의 조절 및 죽상동맥경화증에 대한 민감성과 관련된 연구를 수행할 수 있는 플랫폼을 제공합니다.따라서 당사는 이 장치를 혈관 모사 미세유체 챔버 또는 vmmc라고 부릅니다. 이 장치를 통해 죽상경화성 혈관과 유사한 조건에서 혈관 내피 세포와 단핵구의 염증성 결과를 정량화할 수 있습니다. VMMC를 사용하면 공급량이 제한적일 수 있는 소량의 시약이나 재료를 효율적으로 사용할 수 있습니다.또한 이를 다양한 맞춤형 레이아웃과 기하학적 구조로 제작할 수 있어 매우 광범위한 응용 분야에 적합합니다. 오늘은 랩온어칩(lab on a chip) 방식을 이용한 대표적인 실험을 시연하겠습니다. 인간 혈관 내피 세포 단일층을 잘 정의된 전단 응력 하에서 사이토카인 활성화에 노출시킬 것입니다.우리는 내피세포 활성화의 기능적 리드아웃으로서 단층으로 모집되는 인간 단핵세포의 양을 실시간으로 정량화하기 위한 VMC의 사용법을 시연할 것입니다. 선반을 사용하여 100mm 조직 배양 접시로부터 3인치 원형 기판을 가공합니다. 3인치 기판을 증류수로 세척한 후, 70% ethanol에 담가 멸균합니다. 멸균된 기판을 100mm 페트리 접시에 넣고 건조시킵니다.그 다음, 100 µg/mL 농도의 1형 콜라겐과 함께 상온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS로 세척합니다. 인간 대동맥 내피세포(HA)를 650,000 cells/mL 농도로 현탁합니다. 1 mL의 세포 현탁액을 건조된 콜라겐 코팅 기판 위에 방울 형태로 떨어뜨린 후, 고르게 펴 바릅니다.그 후, 분주된 기질을 37 °C, 5% CO2 인큐베이터에 넣어 기질 표면에 부착되도록 합니다. 1시간 후, 9 mL의 EGM-2 성장 배지를 첨가하고 세포가 단층으로 성장하도록 하며, 약 90%의 합류도(confluency)에 도달하면 이후의 전단 실험에 사용할 수 있습니다. 혈관 모사 미세유체 챔버는 원하는 채널 기하학적 구조가 포함된 마스터 폼 위에 PDMS를 부어 제작합니다.실리콘 베이스를 플라스틱 웨이 보트에 부은 후, 무게 대비 10:1 비율로 실리콘 경화제를 첨가합니다. 그 다음 PDMS 겔을 잘 혼합하는데, 이때 웨이 보트의 측면을 긁어 플라스틱 칩이 혼합물에 들어가지 않도록 주의합니다. 포토레지스트 마스터를 헥산으로 세척하여 VMMC 성형을 준비합니다.그 다음 PDMS 혼합물을 마스터 몰드 위에 붓고 진공 챔버에 넣습니다. 챔버 내에서 15분 후 PDMS 혼합물로부터 공기가 제거되어 표면으로 떠오릅니다.몰드를 챔버에서 제거하고 PDMS 표면에 공기를 부드럽게 불어 넣어 몰드에 남아 있는 기포를 제거합니다. 그 다음 몰드를 덮어 37 °C 오븐에 1시간 동안 넣어 PDMS를 경화시킵니다. 응고된 PDMS 젤을 오븐에서 꺼내고 소형 메스를 사용하여 챔버 주변으로 원형 절개를 합니다.마스터 몰드가 손상될 수 있으므로, 포토레지스트 물질과 접촉하지 않도록 이 과정을 점진적으로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 19게이지 루어락 니들을 사용하여 각 채널의 몰드 펀치 입구 및 출구 포트로부터 마이크로유체 챔버를 절개하십시오. 또한 채널과 떨어진 위치에 진공 튜브를 위한 구멍을 뚫으십시오.VMMC 준비가 완료되었습니다. 6 mL의 L 15 배지에 염증성 사이토카인 TNF alpha를 피펫팅하여 최종 농도가 0.5 ng/mL가 되도록 합니다. L 15 배지는 5% CO2가 없는 환경에서도 pH 완충 능력이 있기 때문에 여기서 전단 유체로 사용됩니다.그 후 배지를 멸균된 10 milliliter 주사기로 흡입하여 전단 장치에 주입합니다. 이어서, 에탄올로 멸균하고 수평을 맞춘 뒤 원뿔 틈새 높이를 설정한 세포 전단 장치로 밀집된 단일층을 옮깁니다. 기질을 페트리 접시에서 분리하여 유리 게이지 블록 위에 놓은 후, 원뿔이 세포 바로 위에 위치하도록 하우징 챔버 바닥 중앙에 조심스럽게 삽입합니다.기판은 게이지 블록 주변의 스테인리스 스틸 나사를 균일하게 조여 고정합니다. 그 다음, 공기 방울이 유입되지 않도록 주의하며 전단 매질을 챔버에 채웁니다. 이어서 컴퓨터를 사용하여 원하는 전단 응력 프로그램을 입력하고 마이크로 서보 모터를 작동시킵니다.여기서는 0 ± 5 dyn/cm²의 진동 전단력을 이용합니다. 4시간 후, 전단 프로그램을 중단합니다. 게이지 블록을 제거하고 기판을 조심스럽게 페트리 접시에 다시 넣습니다.이제 세포가 단핵구 부착 분석을 위한 준비가 되었습니다. 전단력 가함 직후, HA 단층을 현미경 스테이션으로 운반하여 VMMC를 조립합니다. VMMC를 진공 호스에 연결하고 탈이온수에 담가 채널 내부에 갇혀 있는 기포를 제거합니다.진공 밸브가 꺼진 상태에서 챔버를 단층 세포층 위에 조심스럽게 누른 다음 진공 밸브를 켭니다. 이때 챔버의 채널 내에 기포가 갇히지 않도록 하는 것이 매우 중요합니다. 이제 19 Gauge lure Lock 바늘의 팁을 잘라 만든 리저버에 칼슘과 마그네슘이 포함된 HBSS 80 µL를 피펫팅합니다. 리저버의 상단을 세게 눌러 팁 밖으로 용액을 밀어낸 후, 이를 VMMC의 유입구 포트에 삽입합니다.전체 장치를 현미경 스테이지 위에 놓고 현미경 카메라와 비디오 모니터를 켭니다. 10 milliliter 유리 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 다음으로, 주사기 튜브를 VMMC의 배출구 포트에 연결합니다.유속은 채널 내에 1 dine/cm²의 전단 응력을 유도하도록 설정하며, 시린지가 리저버로부터 채널을 통해 유체를 끌어오는 리필 모드로 작동시킵니다. SDF-1로 자극된 T 세포는 2 million cells/mL 농도로 부유시킵니다. 흐름이 활성화된 후 2분 이내에 50 µL의 세포 부유액을 리저버에 추가합니다.다시 한번, 유량이 완전히 발달했을 때 기포가 유입되지 않도록 주의합니다. 비디오는 초당 3프레임으로 캡처하며, 데이터는 Image J 소프트웨어를 사용하여 산출합니다. 부착성 THP-1 세포는 10초 동안 세포 직경의 1/2 이하로 이동하는 것으로 정의합니다.여기에서 우리는 TNF alpha로 자극하고 15 dynes/cm²의 일정한 고전단 응력 또는 0 ± 5 dynes/cm²의 진동 전단 응력 조건 하에 둔 ha 단층에 THP-1이 부착되는 데이터를 보여줍니다. 진동 전단 응력 조건의 ha 단층은 고전단 응력을 경험한 단층에 비해 TP-1 세포 모집이 3배 더 높게 나타났습니다. 오늘 우리는 죽상동맥경화증의 기저가 되는 초기 염증 반응에 대한 중요한 통찰을 제공하기 위해 결합하여 사용할 수 있는 맞춤형 인비트로(in vitro) 기술의 활용법을 제시합니다. 구체적으로, 우리는 명확하게 정의된 유체역학적 조건 하에서 염증성 자극에 노출된 세포 및 내피 기능 장애와 관련된 결과물을 정량화합니다.VMM CS를 사용하면 내피세포와 백혈구의 부착 상호작용의 기저에 있는 특정 기전을 조사할 수 있습니다. 또한 이러한 장치는 유연하고 비용이 저렴하다는 장점이 있으며, 인체 유래 혈청 성분과 같이 공급이 제한적일 수 있는 재료의 사용을 용이하게 합니다. 이 장치를 적용한 본 연구에는 내피세포에서 사이토카인, 지질 및 rage로 유도된 염증에 대한 조사가 포함되었습니다.우리는 또한 여러 백혈구 유형뿐만 아니라 전혈에서 부착 메커니즘을 조사하는 온칩 분석법을 개발했습니다. 궁극적으로, 우리는 이 기술이 염증 매개 심혈관 질환의 개인별 위험도를 평가하기 위한 ex vivo 접근법으로 이어질 것으로 기대합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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심사 분석 실험 소설 내 피 레 귤 레이 터 염증 반응에 관여 하

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Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

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Lensfree 광학 tomography은 &lt;1 μm의의 공간적 해상도를 제공하는 입체 현미경 기법이다 × &lt;1 μm의 × 15~1백밀리미터의 큰 이미지 볼륨여 각각 X, Y 및 Z 크기에서 &lt;3...

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전기 세포 기판 임피던스 내피 증식, 장벽 기능의 정량화에 대한 감지 및 운동성

학습하세요 온칩 내피 염증성 Phenotyping 기법으로 전단응력이 인간 대동맥 내피세포의 염증 반응 및 단핵세포 부착에 미치는 영향을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 심혈관 질환 메커니즘 연구에 활용됩니다.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

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