조직 공학을위한 Electrospun의 Fibres의 Postproduction 처리

이 절차의 목적은 멸균이 가능하며, 임상 조직 공학에 적합한 두께와 기계적 강도를 갖춘 전기 방사 생분해성 지지체를 제작하는 것입니다. 이를 위해 먼저 생분해성 고분자를 전기 방사하여 무작위 또는 정렬된 방향, 혹은 순차적 층 구조의 1차 구조체를 형성합니다. 두 번째 단계는 여러 층을 겹치고 멸균 처리함으로써 지지체에 방사 후 변형 공정을 적용하는 것입니다.

다음으로 세포를 스캐폴드에 도입하고, 배양 중 및 배양 후의 성능을 평가합니다. 마지막 단계는 세포를 이식에 대비시키기 위해 체내에서 겪게 될 생리적 스트레스를 모방한 운동 요법을 실시하는 것입니다. 최종적으로, 동적 장력에 반응하여 세포가 생성하는 세포외 기질을 측정함으로써 운동에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있습니다.

이 기술은 다용도로 활용 가능하며 유연하여, 필요한 응용 분야에 맞춰 특성이 특별히 수정된 매우 다양한 스캐폴드를 제작할 수 있습니다. 예를 들어, 심한 화상을 입은 환자의 광범위한 피부 손실 대체나 암 또는 외상 후 손상된 구강 점막의 복구와 같이 조직 재생이 필요한 까다로운 질환을 치료하도록 스캐폴드를 설계할 수 있습니다. 이 영상에서는 동적 스트레스의 표지자로 세포의 지속적인 생성을 보여주지만, 운동 또는 비운동 세포를 사용하여 다양한 세포외 기질 단백질을 고려하거나 세포 생물학의 다른 많은 측면을 평가할 수도 있습니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 전기 방사 과정이 많은 변수의 영향을 받기 때문에 재현성 있는 스캐폴드를 얻는 데 어려움을 겪습니다. 방사 후 전기 방사 스캐폴드의 처리 과정에 대한 시각적 시연은 매우 중요하지만, 이에 대해 논의되는 경우는 드뭅니다.

임상에서 이 기술을 성공적으로 적용하기 위해서는 해당 공정에 대한 지식이 필수적입니다. 먼저 회전 맨드릴 수집기를 반짝이는 면이 바깥쪽을 향하도록 알루미늄 호일로 감싸는 것으로 시작하십시오. 그런 다음, 분석 대상 폴리머 5 mL가 충전된 5 mL 주사기 4개를 준비합니다.

여기서는 폴리락틱산을 시린지 펌프에 사용합니다. 유량을 시린지당 40 µL/min로 설정하고, 바늘 끝에서 맨드릴까지의 작업 거리를 17 cm로 설정합니다. 다음으로, 시린지 바늘에 +17,000 V를 인가하여 적절한 거리에서 알루미늄 호일이 코팅된 맨드릴 위로 전기 방사하여 정렬된 섬유를 얻습니다.

무작위 섬유를 얻기 위해 매니얼을 1000 RPM으로 회전시킵니다. 매니얼을 200 RPM으로 회전시킵니다. 전기 방사된 PHBV Lotus 두 번째 폴리머 스캐폴드는 건조제가 포함된 밀폐 용기 내의 알루미늄 호일 위에 4 °C에서 최소 4개월 동안 보관할 수 있습니다.

여기에서도 마찬가지입니다. PHBV 위에 PLA 층을 형성한 다음, 해당 폴리머 방사(spin)를 위한 매개변수와 일반적인 조건을 사용했습니다. 다시 한번 설명하자면, 이러한 적층 공정을 통해 스캐폴드의 이중층을 구축하여 히터를 이용한 다층 스캐폴드 제작을 위한 이층 구조를 형성합니다.

PLGA 시트 4장을 서로 겹쳐 놓은 다음, 증기 어닐링(vapor annealing)을 통해 다층 스캐폴드를 제작하기 위해 60 °C에서 3시간 동안 가열하여 어닐링합니다. 적절한 크기의 용기에 10 mL의 DCM을 붓습니다. 그 다음, PLGA 시트 4장을 서로 겹쳐서 DCM 상단 2 cm 높이에 매달아 둡니다.

마지막으로, 전기 방사를 통해 무균 지지체를 제작하기 위해 용기를 실온에서 1시간 동안 밀봉합니다. 배양을 통해 멸균된 의료용 폴리머를 DCM에 용해시킨 후, 멸균된 맨드릴에 감은 멸균 호일 위에 폴리머 용액을 전기 방사합니다. 그 다음, 멸균된 라미나 플로우 후드 내에서 항생제가 없는 성장 배지로 지지체를 적절한 기간 동안 배양하여, 실험적 에탄올 소독에 따른 시료의 멸균 상태를 확인합니다.

스캐폴드를 에탄올 및 증류수 용액에 15분 동안 담가 둡니다. 과초산 살균을 위해 스캐폴드를 과초산 및 PBS 용액에 3시간 동안 침지시킵니다.

감마 멸균을 위해 상온에서 세슘 선원을 사용하여 스캐폴드에 3 kGy의 선량을 조사한 후, 스캐폴드를 5 mm x 20 mm 크기의 직사각형으로 절단합니다. 이어서 마이크로미터를 사용하여 스캐폴드의 두께를 측정합니다. 그런 다음 절단된 직사각형 조각들을 Bose ElectroForce 3100 장비에 배치합니다.

기기가 도출한 응력-변형률 곡선인 하중 대 변위 그래프로부터 영률(young's modulus)과 탄성률을 계산하십시오. 세포를 파종하기 전, 형광 염료로 세포를 표지하는 것으로 시작합니다. 그 다음, 합류 상태의 인간 진피 섬유아세포를 trypsin 및 EDTA가 포함된 용액에서 37 °C로 5분 동안 배양하십시오.

그런 다음 분리된 세포를 실온에서 150 ×g로 10분 동안 원심 분리하고, 펠릿을 5 mL의 DMEM에 다시 현탁합니다. 세포 수를 센 후, 파종을 위해 세포 농도를 조절하고 세포를 스캐폴드에 파종합니다. 이제 형광 현미경으로 라벨링된 스캐폴드의 표면을 촬영하여 세포의 침투 정도를 조사합니다. 스캐폴드 더 깊은 곳까지 확인하려면 다광자 공초점 현미경을 사용할 수 있습니다.

이를 통해 세포 포함 여부와 상관없이 대부분의 스캐폴드 내부로 약 200 micron 정도 침투시킬 수 있습니다. 그 다음, 세포를 접종한 스캐폴드를 배양한 후, 37 °C에서 20분 동안 1 mL의 PBS 내 포름알데히드로 시료를 고정합니다. 고정 후, 1 mL의 PBS로 시료를 3회 세척하고, 각 시료를 200 µL의 엘라스틴 일차 항체와 함께 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

시료를 1 mL의 PBS로 3회 더 세척한 후, DPI가 포함된 PBS 내의 2차 항체 용액에서 30분 동안 배양합니다. 마지막으로 시료를 PBS로 최종 세척한 후, DPI의 경우 365 nm 여기 및 460 nm 방출, 2차 항체의 경우 480 nm 여기 및 533 nm 방출 파장을 사용하여 형광 현미경으로 시료를 촬영합니다. 먼저 유량 조절 장치와 벌룬을 오토클레이브로 멸균한 다음, 클린룸 내의 라미나 플로우 후드에서 전기 방사를 위한 위치에 장치를 배치하고 포장을 제거합니다.

다음으로, PBS가 채워진 50 milliliter 주사기를 3방향 콕의 분기 관에 연결하고, 풍선이 팽팽해질 때까지 PBS를 주입하여 팽창시킵니다. 이제 원하는 폴리머를 풍선 위에 전기 방사합니다. 일반적인 방사 조건과 10 centimeters의 작동 거리에서, 습식 섬유는 풍선 표면에 충분히 접착되어 이후에 떨어지지 않습니다.

스캐폴드가 건조되면 풍선을 멸균 용기에 넣고 세포 배양에 적합한 층류 정화 작업대(lamina flow hood)로 운반합니다. 세포에 생체역학적 컨디셔닝을 가하기 위해 팽창된 풍선 위의 스캐폴드에서 세포를 배양하는 것이 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 가능한 한 많은 세포를 스캐폴드에 부착시키기 위해 세포 용액으로 풍선을 반복해서 적셔주는 것이 필수적입니다.

이 과정은 약 20분 정도 소요됩니다. 후드 내에서 용기로부터 벌룬을 제거하여 여기에서 사용된 페트리 접시와 같은 멸균된 표면에 놓습니다. 그 다음, 세포를 벌룬 표면에 고르게 분산시키기 위해 20분 동안 20초마다 코팅된 벌룬 위에 세포 현탁액을 피펫으로 분주합니다. 이후 벌룬을 다시 배양 용기에 넣고 해당 세포 유형에 적합한 예열된 배지를 추가합니다.

마지막으로, 팽창 장치를 시린지 펌프에 연결하고 필요에 따라 벌룬을 팽창 및 수축시켜 이축 신장을 유도합니다. 컴퓨터 제어 시린지 펌프를 사용하면 더 복잡한 신장 체계를 구현할 수 있습니다. 전기 방사는 무작위 및 정렬된 구조의 스캐폴드를 제작하는 데 활용될 수 있습니다.

이 과정은 반복 가능하며 섬유가 균일합니다. 예를 들어, 알루미늄 호일을 90도 회전시켜 정렬된 섬유 세트를 전기 방사한 후, 즉시 그 위에 두 번째 정렬된 섬유 세트를 전기 방사함으로써 수직 섬유를 제작할 수 있습니다. 다양한 종류의 폴리머를 전기 방사할 수 있으며, P-L-A-P-H-B-V-P-C-L 및 PLGA의 사례에서 볼 수 있듯이 특성이 상당히 다양할 수 있습니다. P-L-A-P-C-L과 PLGA 모두 마이크로 섬유 형태의 균일한 스캐폴드라는 점에 유의하십시오.

PHBV는 5~20 µm 크기의 비드들을 연결하는 나노 섬유가 진주 목걸이 형태로 방사됩니다. 본 실험에서는 먼저 PHBV를 사용하여 스캐폴드를 방사한 후, 주사기에 PLA를 채워 PHBV 스캐폴드 위에 방사하였습니다. 이 이미지들은 대표적인 단일 PHBV 및 PLA 층을 보여줍니다.

이 이미지는 조밀한 나노 섬유 모양의 넥리스(necklace) 구조를 가진 PHBV 층과 더 개방된 마이크로 섬유 구조의 PLA 층으로 구성된 A-P-H-B-V-P-L-A 이중층의 단면이 어떤 모습인지 보여주며, 세 가지 스캐폴드 유형 모두 세포 부착과 증식을 촉진합니다. 더 두꺼운 스캐폴드가 필요한 경우, 다음 몇 가지 이미지에서 보여주는 것처럼 증기 및 가열 니링(kneeling) 공정을 이용하여 스캐폴드 층들을 서로 융합시킬 수 있습니다. 니링 처리된 스캐폴드 층은 층분리가 일어나지 않으며, 층 사이의 접합부를 찾기가 매우 어렵습니다.

이 이미지는 약 150 µm의 초기 섬유성 스캐폴드들이 함께 배치된 증기 및 니들링(kneeled) PLA 스캐폴드의 단면을 보여줍니다. 그 후 DCM 증기를 사용하여 최대 500 µm에 이르는 훨씬 더 두꺼운 스캐폴드를 제작하였습니다. 이 이미지는 이전 이미지보다 약 2배 더 높은 배율로 관찰한 증기 닐(vapor nil) 이중층의 동일한 단면을 보여줍니다. 이 이미지에서 스캐폴드가 어떻게 훨씬 더 두꺼운 섬유층과 히터에 의해 생성된 얇은 섬유층이 분산되어 구성되어 있는지 관찰하십시오. 얇은 섬유층과 두꺼운 섬유층을 함께 니들링하여 복잡한 기계적 특성을 가진 스캐폴드를 생성합니다.

다시 한번, 이 이미지는 동일한 히터 니클드 스캐폴드를 네 가지 배율로 보여줍니다. 층상 막을 통한 이전 배율에서는 각 막에 서로 다른 세포 유형을 배양하여 서로 섞이지 않게 할 수 있으며, 이는 두 가지 서로 다른 형광 세포 추적 염색약으로 염색된 인간 진피 섬유아세포 이미지에서 입증되었습니다. 첫 번째 이미지는 electros bun PLA 상의 섬유아세포입니다.

세포를 고정하고 염색하였습니다. 여기서는 염색된 섬유아세포를 전계방사된 PHBV 위에 파종하였습니다. 본 실험에서 섬유아세포는 생존 염색약인 Cell Tracker Green으로 사전 염색되었습니다. 세포들이 이층막의 PLA 쪽에 위치하고 있음에 유의하십시오.

이 이미지는 하단 PHBV 표면에 적색으로 염색된 섬유아세포와 상단 PLA 표면에 녹색으로 염색된 섬유아세포가 있는 이층 구조의 대표적인 단면입니다. 이 이미지에서 섬유아세포는 A-P-H-B-V 표면에서 성장하는 동안 cell tracker red로 사전 염색되었습니다. 따라서 생체 형광 염료를 사용하면 세포가 계속 성장하는 동안 스캐폴드 상의 세포 분포를 관찰할 수 있는 편리한 방법론을 제공합니다.

멸균 방법은 스캐폴드와 이후의 세포 배양에 영향을 미칩니다. 이 선 그래프는 과초산, 감마선 조사 및 에탄올이 PLGA 스캐폴드의 극한 인장 강도와 영률에 미치는 영향을 보여줍니다.

각 멸균 방법은 스캐폴드의 극한 인장 강도와 탄성을 변화시킵니다. 이러한 스캐폴드 상에서 세포를 배양하면 극한 인장 응력은 더욱 감소하지만, 탄성은 증가합니다. 이 막대 그래프는 멸균 방법이 개별 스캐폴드의 섬유 직경에 미치는 영향을 보여줍니다.

감마선 조사는 섬유 직경에 유의미한 영향을 미치지 않는 반면, 과초산과 에탄올은 섬유 직경을 약 50% 감소시킵니다. 따라서 멸균된 스캐폴드를 얻는 가장 좋은 방법은 무균 조건에서 이를 제작하는 것입니다. 마지막 일련의 이미지들은 동적 신장 과정 동안 세포가 생존력을 유지하며 엘라스틴 생산량 또한 증가시킴을 보여줍니다. 대사 지표인 MTT로 검출된, 성장하는 세포에 의해 생성된 진한 파란색의 발현에 주목하십시오.

여기서 풍선 위에서 배양되어 이축 신장에 노출된 파란색 세포들은 녹색 염색으로 표시된 것처럼 엘라스틴 섬유를 형성하였습니다. 이는 동일한 풍선 스캐폴드에서 정적 조건으로 유지되었을 때 동일한 세포들에서 엘라스틴이 결핍된 것과 뚜렷하게 대조됩니다. 이 과정 이후, 스캐폴드 내 세포들의 정적 배양 및 유체 흐름과 같은 다른 방법들을 수행하여 세포가 서로 다른 배양 조건에 어떻게 반응하는지 조사할 수 있습니다.

팽창 가능한 벌룬 위의 스캐폴드에서 세포를 배양하는 기술의 개발은 조직 공학 분야의 연구자들이 조직 공학 구조물 내 세포의 동적 조건화 효과를 탐구할 수 있는 길을 열어주었기에 매우 유용함이 입증되었습니다. 고전압 전원 공급 장치, 용매, 레이저 및 인간 세포를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 이 실험 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 교육을 받고 주의 사항을 준수해야 한다는 점을 잊지 마십시오.