단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

다음 실험의 전반적인 목적은 박테리아가 액체 매체에서 쉽게 분리될 수 있도록 박테리아에 부착 특성을 부여하는 것입니다. 이는 먼저 복잡한 유전자 조절을 우회하고 끈적한 폴리머를 쉽고 대량으로 생산할 수 있도록 합성 컬리를 설계함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 폴리스티렌에서 부착 박테리아를 시각화하고 정량화하여 합성 장치의 효율성을 빠르게 추정할 수 있습니다.

다음으로, 부착 박테리아를 컨포칼 현미경으로 유리에 시각화합니다. 생물막을 직접 관찰하고 그 구조에 대한 정보를 얻기 위해 접착력, 백분율 측정 및 현미경 관찰을 기반으로 합성 장치를 품고 있는 균주에서 부착력이 크게 증가했음을 보여주는 결과를 얻습니다. 기존 클로닝과 같은 기존 방법에 비해 합성 생물학 접근 방식의 주요 장점은 적절한 신호를 가진 절대적으로 명확한 필수 유전자만 품고 있는 구조를 매우 빠르게 얻을 수 있다는 것입니다.

이 방법은 방사성 폐기물에서 금속이 적재된 박테리아를 제거하는 문제를 해결하는 것과 같은 생물 복원 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 유전적 조절 신호 및 데이터베이스 처리에 대한 기본 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪습니다. 시각적 시연은 바이오 필름의 정량화 및 시각화에 초점을 맞출 것인데, 이 두 단계는 바이오프레임의 취약성으로 인해 배우기가 매우 어렵기 때문입니다.

합성 카론을 설계하는 첫 번째 단계는 곱슬 유전자의 유전적 조직을 결정하고 내인성, 전사 및 번역 신호를 국소화하는 것입니다. 이는 REON DB 또는 eco gene과 같은 특수 데이터베이스를 사용하여 수행됩니다. 다음 단계는 곱슬 합성에 절대적으로 필요한 5개의 유전자인 CSGB 및 CSGA를 선택하고 섬유 단량체를 코딩하고 C-S-G-E-C-S-G-F 및 CSGG는 컬링 분비 복합체를 암호화하고, 더 빠른 형식의 데이터 관리로 데이터베이스에서 선택한 염기서열을 추출하고, C-S-G-G-F-E 클러스터가 대장균 게놈에서 안티센스이므로 클론 관리자 소프트웨어를 사용하여 인실리코 사전 분석을 수행하는 것입니다.

이 시퀀스는 역 보수 시퀀스로 변환해야 합니다. 클론 관리자 도구 작업 프로세스 분자 반전 분자를 사용하고 함수 ligate를 사용하여 C-S-G-E-F-G 시퀀스를 C-S-G-B-A 뒤에 붙여넣습니다. 다음으로, C-S-G-B-A-E-F-G iCal 염기서열 앞에 적절한 프로모터 PRCN을 추가합니다.

RCN 궤적은 니켈 및 코발트 해독을 담당하는 FLX 펌프 RCNA와 동족 금속 조절기 RCNR을 인코딩합니다. 코발트나 니켈이 없는 경우, 억제인자 RCNR은 DNA의 RCNR 상자에 결합하여 다운스트림 유전자의 완전한 전사 활성화를 방해합니다. 코발트 또는 니켈의 세포 내 농도가 상승하면 코발트 또는 니켈이 RCNR 단백질에 결합하면 억제 물질이 프로모터에 고정되는 것을 방지하고 선택된 5개의 곱슬 유전자를 프로모터의 통제 하에 둠으로써 P-R-C-N-A의 전사 활성이 증가합니다.

PRCN 곱슬은 코발트와 니켈이 있는 상태에서 과잉 생산될 것으로 예측됩니다. 그 후, CS gba의 첫 번째 A TG, DNA 서열 및 C-S-G-E-F-G 서열 앞에 완벽한 리보솜 결합 부위 또는 RBS를 추가하여 전사 신호를 최적화합니다. I GM 표준에 맞으려면 장치 측면에 ECO R one 및 X-bar one에 대한 제한 사이트를 포함하는 표준 바이오 브릭 접두사와 추가 조립을 용이하게 하기 위해 SPE 1 및 PST one에 대한 제한 사이트를 포함하는 접미사가 있어야 합니다.

바이오 브릭 부품 자체에는 ECO R one, PST one SPE one 및 X-bar R one 인식 사이트가 포함될 수 없습니다. 따라서, 이러한 부위는 장치의 인실리코 제한 분석에서 하나의 PST, CSGA 서열에서 하나의 사이트, RCNR 서열에서 하나의 사이트 및 CSGE 유전자에서 하나의 ECO R 하나를 나타내는 장치의 조용한 돌연변이 변화에 의해 제거되었습니다. 이 부위는 조용한 돌연변이에 의해 변형되었습니다.

합성 opor의 설계가 완료되면 클론 관리자 소프트웨어를 사용하여 번역 시뮬레이션을 실행합니다. 염기서열 정렬 프로그램 블래스트를 사용하여 야생형 곱슬 단백질과 합성물에 의해 인코딩된 단백질 간의 완벽한 상동성을 확인하여 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 대해 이 절차를 시작하고 2밀리리터의 M 63, 0.2% 포도당이 있는 최소 배지에 각 웰에 10-6개의 세포를 하룻밤 사이에 박테리아 배양의 6개 세포에 접종합니다. 섭씨 30도에서 18-48시간 동안 24웰 플레이트의 각 열을 흔들지 않고 박테리아를 성장시키면 양식이 표시됩니다.

필요할 때 적절한 양의 코발트와 항생제를 첨가합니다. 처음 세 줄은 세 번의 반복을 평균하여 A 부착 박테리아를 정량화하는 데 사용됩니다. 마지막 남은 줄은 18 내지 48시간 후에 크리스털 바이올렛 염색으로 생물막을 시각화하고, 24웰 플레이트의 처음 3열에서 각 웰의 플랑크톤 세포를 포함하는 수피네이트를 회수하고, 수피네이트를 용혈관으로 옮기는 데 사용됩니다.

M 63 배지 1ml로 각 웰을 조심스럽게 헹구고 초기 supinate로 용혈 튜브의 세척물을 당깁니다. 이 수영장은 S라는 이름의 수영 세포라고 하며, 마이크로플레이트의 우물 바닥은 부착 세포로 덮여 있습니다. 생물막을 복구하려면 각각에 M 63 1ml를 첨가하십시오.

피펫 팁으로 잘 긁어낸 다음 위아래로 피펫을 만들고 생물막 분획을 새 용혈 튜브로 옮깁니다. 15초 동안 튜브를 소용돌이치십시오. 용혈관에서 생물막 분획을 수집합니다.

이 풀은 B라는 표면 부착 세포를 나타내며 용혈관에서 96웰 플레이트로 200마이크로리터의 supinate 및 biofilm 분획을 전달합니다. 광학 밀도에서 부착된 표면과 수영하는 박테리아의 수를 600나노미터로 추정합니다. 각 양식의 순응도(Percent)는 공식 B 곱하기 100을 3 곱하기 B.To S로 나눈 값을 사용하여 계산하고, 웰 플레이트는 24개의 웰 플레이트의 마지막 행에 대해서만 바이오필름을 시각화하여 해당 웰에서 플랑크톤 세포를 버립니다.

각 웰에 M 63 1ml를 첨가하여 플레이트 바닥에 형성된 생물막을 헹굽니다. 1 시간 후에 80 섭씨 온도에 1 시간 동안 덮개가 덮이지 않은 판을 말리고, 물로 광대하게 세척한 후에 각 우물에 2를 위한 20%crystal violet의 100 마이크로리터를 추가하십시오. 이 프로토콜에는 형광 섀시가 필요합니다.

합성 곱슬을 지닌 플라스미드에 적합한 숙주는 대장균 SCC 1 균주이며, 이는 모 균주 MG 1 16 55와 관찰할 수 있는 차이 없이 녹색 형광 단백질을 구성적으로 발현합니다. 합성 컬리를 함유한 퍽 57 플라스미드로 숙주 균주를 변형시켜 S 23 균주를 얻습니다. 대조군 플라스미드 퍽 18로 숙주 균주를 변형시켜 대조 균주를 얻습니다.

S 24는 섭씨 30도에서 S 23 및 S 24 균주의 하룻밤 전 배양에서 성장합니다. 다음 날 포도당과 암피실린이 보충된 M 63 배지에서 페트리 접시에 M 63 배지 20ml를 첨가한 다음 페트리 접시에 M 63 15ml에 100마이크로리터의 사전 배양액을 접종합니다. 적절한 농도의 코발트를 추가하고 코발트가 없는 네거티브 컨트롤을 잊지 마십시오.

각 페트리 접시에 3개의 직사각형 유리 덮개 슬립을 도입하십시오. 접시를 흔들지 않고 섭씨 30도에서 밤새 부화시킵니다. 박테리아는 다음 날에 형광 현미경 아래에서 직접 시각화할 수 있습니다.

샘플의 건조를 피하는 것이 중요하므로 다음 단계를 신중하지만 신속하게 수행해야 합니다. 페트리 접시에서 각 덮개 슬립을 제거하고 조심스럽게 배수하십시오. 컨포칼 관찰을 위해 70% 에탄올을 적신 작은 면봉으로 얼굴 아래쪽을 조심스럽게 닦아내고 모든 박테리아 잔류물을 닦아냅니다.

커버 슬립을 바이오필름으로 덮인 윗면이 위로 향하게 하여 유리 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 생물막은 유리에 고정된 더 큰 커버 슬립으로 덮입니다. 바니시로 미끄러집니다.

이제 생물막이 아래쪽 면에 오도록 설정을 반전합니다. 이 실험에서 컨포칼 레이저 현미경 아래에 설정을 놓습니다. Zeiss LSM five 10 meta 컨포칼 레이저 현미경은 CT 마이크로 플랫폼 내에서 사용됩니다.

40회 오일 이멀젼 대물렌즈를 선택합니다. 다음 설정을 사용하여 4 88 나노 미터에서 GFP를 여기시키고 500-600 나노 미터 범위의 박테리아 형광을 수집합니다. 40회 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득합니다.

레이저 스캐닝 공초점 모드에서. 고체 표면에서 성장 매체와의 계면까지 생물막의 전체 3차원 구조를 스캔합니다. 1 미크론의 단계를 사용합니다.

MAUS 소프트웨어로 3차원 투영을 수행하고, 통계적 세로 단면을 따라 평균 C 값을 분석하여 생물막 두께를 결정합니다. 생물막의 정량화, 바이오 부피는 컨포칼 Z 스택에서 추출할 수 있습니다. 금속에 반응하여 곱슬머리를 과도하게 생산하도록 설계된 대장균의 부착 능력은 간단한 방법으로 평가할 수 있습니다.

예를 들어, 24개의 잘 연마된 Irene 플레이트에 대한 크리스털 바이올렛 염색을 통해 보라색 강도의 차이에서 알 수 있듯이 각 웰 바닥의 생물막 형성을 빠르게 시각화할 수 있습니다. 야생형 균주는 엔지니어링 균주보다 부착성이 적은 것으로 보입니다. 정량적 방법은 야생형의 폴리스티렌과 다양한 농도의 코발트를 함유한 공학적 균주에 대한 접착 비율을 측정하는 것입니다.

이 그래프에 제시된 결과는 코발트가 없을 때 엔지니어링된 균주의 순응도가 야생형 균주보다 1.5배 더 높다는 것을 보여줍니다. 또한, 코발트 농도가 증가하는 매체에서 코발트 농도가 25마이크로몰 또는 50마이크로몰의 코발트 농도가 각각 30% 및 40%에 도달하는 접착력 향상 비율이 관찰되었습니다. 순응 능력은 또한 유리 슬라이드에서 자란 GFP 태그가 지정된 박테리아와 현미경 검사를 사용하여 비교할 수 있으며, 검은색 배경에서 녹색 박테리아를 에피 형광 현미경으로 관찰하면 엔지니어링된 균주가 생물막을 형성하는 반면 야생 트리페 균주는 화살표로 표시된 미세 군집만 형성한다는 것을 알 수 있습니다.

컨포칼 현미경 분석은 생물막 3차원 구조에 대한 전체적인 보기를 제공합니다. 평면도 재구성은 패널 A에 표시되고 측면 보기 재구성은 패널 B에 표시되며, 결과는 엔지니어링된 균주가 야생형보다 더 부착성이 있고 밀도가 높고 두꺼운 생물막을 형성한다는 것을 확인합니다. 이 절차를 시도하는 동안 예를 들어 방사성 폐수와 관련하여 변형된 대장균 또는 점진주치개미의 생물학적 매개체 가능성을 탐색하기 위해 작업 설계를 다시 확인하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 클론 관리자 소프트웨어를 사용하여 합성 개방을 설계하는 방법과 박테리아 균주의 발화를 신속하게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 합성 유전자 및 유전자 변형 유기체를 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그들은 현행법에 따라 수행되어야 하며 이 절차를 수행하는 동안 변형된 박테리아를 오토클레이빙하는 것과 같은 예방 조치를 항상 취해야 합니다.