Name: 단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 학습하세요 합성 컬리 오페론을 설계하여 대장균의 점착성을 향상시키는 방법을. 공학 박테리아의 분리 및 생물막 형성 정량화 기술을 탐색하세요.

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우리는 리옹 인사 - 엔터프라이즈 네트워크의 iGEM 팀 (Viviane Chansavang, 마틸다 Dumond, 알렉산더 Duprey, 멜라니 Geffroy, Clémence Gonthier, 마고 Jaulin, 아루 레이 하겐, Goki 리, 토마스 Poinsot, 베릴 Royer - 버트 란드, 줄리 Soula, 마이클 Vonzy의 다른 회원들에게 감사 , 피에르 이브 Zundel, Soufiane Bouhmadi, 올리비에 Brette, 게일 Chambonnier, 로라 Izard, Aurianne Kroiss, 필립 Lejeune, 아그네스 Rodrigue, 아르노 Rondelet, Sylvie Reverchon와 발레리 Desjardin)의 재정적 인 지원을위한 후원자 (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation 인사, 엔터프라이즈 네트워크 - 리옹 (Lyon)과 Biosciences 인사 - 리옹 (Lyon)의 부), 중요한이 원고의 읽기, 스트레인 선물 박사 CC의 Sze를위한 F. Wisniewski - 염료. 작살 줄에 달린 부표 B.는 박사 학위를받은 지역 론 알프에서 교제.

1. Curli 오페론의 Biobrick 설계 및 합성 <ol><li> 유전자 조직을 결정하고 curli 유전자의 내생 전사와 병진 신호를 현지화. 이러한 정보는 해당 RegulonDB 또는 EcoGene B 등의 전문 데이터베이스에 수집 및 관련 출판물의주의 독서를 통해 완료됩니다. 데이터 관리 및 silico의 preanalysis의는 복제 관리자 소프트웨어를 C로 수행되었다. </li><li> 관련 코딩 시퀀스를 선택합니다. curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curlin 분비물 복잡한 인코딩)를위한 다섯 절대적으로 필요한 유전자의 집합은 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. FASTA 형식의 데이터베이스에서 선택한 시퀀스를 추출합니다. csgGFE 클러스터는 E.의 안티센스이기 때문에 대장균의 게놈은 그 역 보수 counterp에이 시퀀스를 변환&gt; 프로세스 분자&gt; 분자를 반전 복제 관리자 도구 작업을 사용하여 예술. 기능 &quot;Ligate&quot;(클론&gt; Ligate)을 사용하여 csgBA 뒤에 csgEFG 순서를 붙여 넣습니다. </li><li> 해당 발기인을 추가합니다. 발기인 P RCN의 통제하에 다섯 선택한 curli 유전자를 배치함으로써 curli는 코발트와 니켈의 존재에 이상 생산 될 것으로 예상하고 있습니다. RCN 궤적은 니켈과 공동 해독 (rcnA)와 같은 종류의 금속 - 레귤레이터 (rcnR)에 대한 책임 유출 펌프를 인코딩합니다. RcnR는 rcnA의 표현과 니켈 및 공동 19에 대한 응답으로 자신의 유전자를 제어합니다. rcnR의 CDS를 포함 RCN 순서는 전체 RCN intergenic 지역 플러스 rcnA의 41 첫번째 세포핵은 csgBAEFG 괴물 같은 순서 (전체 구조의 순서가 보조 데이터로 제공됩니다 그림 1)의 placedin 프런트했다. </li><li> 전사를 최적화신호. 완벽한 ribosome 구속력이 사이트 (또는 완벽 RBS = AAGGAGGTATATA)은 csgBA의 DNA 시퀀스의 첫 번째 ATG 앞에 추가되었습니다. 두 번째 완벽한 RBS는 csgEFG 순서의 앞에 추가되었습니다. csgB 및 csgF 및 csgG 유전자에 대한 내생 RBS가 보존되었습니다. </li><li> iGEM ​​표준을 맞추려면 장치는 에코 RI에 대한 제한 사이트, 태평양 표준시 I (접두사)와 SPE I 및 Xba I (접미사)를 포함, 표준 BioBrick 접두사와 접미사으로 둘러싸인해야합니다. 장치 D의 각 끝 부분에 해당 시퀀스를 붙여 넣습니다. </li><li> 모든 에코 RI, 태평양 표준시 I, SPE I 및 장치 Xba I 인식 사이트를 제거합니다. 자세한 조립 공정을 촉진하기 위해 BioBrick 부분 자체는 이러한 제한 사이트 중 하나를 포함 할 수 없습니다. 장치의 silico 제한 분석에서 한 PST 나는 csgA 순서에서 사이트 rcnR 순서에서 한 PST I 사이트를 공개csgE 유전자의 하나 에코 RI 사이트입니다. 이 사이트는 각각 장치 순서 (보충 자료)의 위치 80 (Mut1), 1340 (Mut2) 및 1830 (Mut3)를에 위치하고 있으며, 침묵 돌연변이에 의해 다음과 같이 수정되었습니다. Mut1 PST I 사이트는 CGTCTG에서 변경 CTGCAG Mut2 PST I 사이트는 CAGCAG에서 변경 CTGCAG GAATT에서 변경 Mut3 에코 RI 사이트 GAATTC </li><li> 복제 관리자 소프트웨어 (운영&gt; 프로세스 분자&gt; 번역 분자)를 사용하여 번역 시뮬레이션을 통해 실행합니다. 야생 유형 curli 단백질과 합성 오페론으로 인코딩 된 단백질 사이의 완벽한 호몰 로지을 확인하기 위해 순서 정렬 프로그램 BLAST를 사용하십시오. </li><li> 합성 오페론를 주문하십시오. 상업 유전자 합성 서비스는 전 세계적으로 수많은 기업에서 사용할 수 있습니다, 우리의 파트너 Genecust (룩셈부르크)였습니다. 인공 오페론 (3,165 BP) 4 μg은 몇 주 후 접수 및 pUC57 (pIG2)에 삽입되었다. </li></ol>2. 폴리스티렌에 점착성의 박테리아를 시각화하고 정량화 <ol><li> M63 최소한의 매체 (포도당 0.2 %)의 2 ML과 24 잘 폴리스티렌 판의 각 우물을 입력하고 야간 문화의 106 세포 각 우물을 예방. 흔들림없이 18-48 시간에 30 ° C에서 박테리아를 성장. 각 열 (4 우물)는 양상을 나타냅니다. 필요할 때 적절한 코발트의 양 (25-100 ㎜)과 항생제 (암피실린 100 μg.L -1)을 추가합니다. 24 잘 접시의 3 첫번째 행 3 반복 평균하여 점착성의 세균을 수량화하는 데 사용됩니다, 마지막 행 왼쪽은 biofilm을 시각화하는 데 사용됩니다. </li><li> 24 잘 플레이트의 3 첫번째 행 : 각 잘 들어, planktonic 세포를 포함하는 표면에 뜨는을 복구합니다. </li><li> 조심스럽게 한 M63의 ML과 수영장 2.2에서 얻은 초기 표면에 뜨는있는 한 ML 세척)과 잘 각각 씻어. 이 수영장은 수영장 세포 (= S)로 언급됩니다. </li><li> 한 ML O에서 biofilm을 복구스크랩와 등을 아래로 pipetting하여 F M63 (= B). 와동 15 초. 각 양상에 해당하는 준수 비율을 제공하는 600 나노 미터 (OD600)에서 광학 밀도의 표면 부착 수영 박테리아의 수를 추정합니다. </li><li> 준수의 비율은 수식을 사용하여 계산됩니다 Bx100 / (3xS + B). </li><li> 만 24 잘 접시의 마지막 행의 경우 : planktonic 전지를 폐기하십시오. </li><li> M63 접시의 바닥에 개발 한 biofilm의 1 ML을 씻어. </li><li> 80 1 시간에 열려있는 판을 건조 ° C. </li><li> 잘 표면 첨부 박테리아를 시각화하는 물과 다양한 세차 다음 각에서 2 분 동안 20 % 크리스탈 바이올렛 100 μl를 추가합니다. 세 독립 assays (접시)는 재현성을 보장하기 위해 수행해야합니다. </li></ol> 3. 현미경으로 유리에 점착성의 박테리아를 시각화 <ol><li> 형광 섀시를 얻을. E. 어떤 constitutivel 대장균 SCC1 전자 스트레인y는 MG1655 20 플라스미드 베어링 합성 curli 오페론에 적합한 호스트 부모 부담로부터 관찰 할 수있는 차이가 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하고 있습니다. </li><li> S23 부담을 얻기 위해 pIG2 플라스미드 (에코 RI / PST I pUC57 플라스미드의 사이트에 삽입 = 합성 curli 오페론)을 SCC1을 변환 할 수 있습니다. 제어 변종에게 S24 21 얻을 수 플라스미드 제어 (pUC18)에 SCC1을 변환 할 수 있습니다. </li><li> S23과 컨트롤의 밤 precultures (S24) 30의 변종 ° M63 포도당을 보충 매체 (0.2 %) 및 암피실린 (100 μg.L -1)에서 C를 성장. </li><li> precultures 100 μl와 페트리 접시에서 동일한 매체 15 ML의 예방. 코발트 (예 : 25 μM)의 적절한 농도를 추가하고 코발트없이 부정적인 컨트롤을 잊지 마세요. 각 페트리 접시 3 사각 유리 coverslip을 소개합니다. 떨지 않고 30 ° C에서 하루 아침에 품다. </li><li> 아프로 coverslip을 제거페트리 접시와주의 깊게 배수 m. 모든 박테리아 잔류 물을 닦아으로 70 °의 에탄올를 임신 작은면 물건을 낮은 얼굴을 조심스럽게 닦아주십시오. 공 촛점 관찰은 coverslip의 추가 고정 할 수 있도록 몇 밀리미터에 두 상부 끝을 청소하십시오. </li><li> 점착성의 박테리아는 형광 현미경으로 직접하지만 신속하게 시각화하지만, 조심스럽게 샘플의 건조 방지 할 수 있습니다. </li><li> 공 촛점 관찰를 들어, 얼굴을 배치 biofilm이 적용 위쪽 얼굴을 유리 슬라이드에 coverslip을 입금. biofilm 그런 다음 광택이있는 유리 슬라이드에 고정되어있는 큰 coverslip,로 덮여 있습니다. biofilm 이제 낮은 얼굴에 수 있도록 설정을 반전. </li><li> 공 촛점 레이저 현미경으로 설치를 놓습니다. 오른쪽 Axioplan2 LSM510 (Zeiss) 공 촛점 레이저 현미경은 Platim 플랫폼 F에서 사용되었다. </li><li> 설정합니다. 일으키다 488 nm의에서 GFP 및 범위의 세균 형광 500-600 nm의 수집<html> . 공 촛점 모드를 스캔 레이저의 이미지를 획득을위한 40x 기름 침지 목표를 사용합니다. 1 μm의 단계를 사용하여 고체 표면에서 성장 매체와 인터페이스에 biofilms의 전체 입체 구조를 검사합니다. </li><li> IMARIS 소프트웨어 (Bitplane, 스위스 취리히)의 입체 투영을 수행합니다. 통계 세로 섹션을 따라 평균 Z 값의 분석에 의해 biofilm의 두께를 결정합니다. 다른 곳에서 22에 설명 된대로 biofilm의 biovolumes의 정량화는 공 촛점 Z-스택에서 추출 할 수 있습니다. </li></ol> RegulonDB는 전사 단위, 발기인 및 시그마 유형, 유전자 및 ribosome 바인딩 사이트, 터미네이터, 특정 전사 규제 당국의 구속 사이트뿐만 아니라, 규제 문구로 자신의 조직에 오페론의 구조 및 분해에 대한 기계론의 정보를 제공합니다.동부 표준시 = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp B EcoGene 데이터베이스는 E.에 대한 최신 정보가 포함되어 있습니다 대장균 K-12 게놈과 광범위한 유전자 참고 문헌을 포함하여 프로테옴 시퀀스. 주요 EcoGene의 초점은 번역 시작 사이트의 재평가되었습니다. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> C <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d 개 <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> 춘 차우 Sze, 난 양은 기술 대학, 싱가포르의 전자 선물. F Platim 현미경 플랫폼 UMS3444 BioSciences 모이는 - 리옹 수드.

<ol><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+sensor+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li>
<li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li>
<li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li>
<li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains%3A+role+of+flagella%2C+curli+and+colanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li>
<li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Zn%28II%29%2C+Cu%28II%29%2C+and+Fe%28II%29+ions+to+Alzheimer%27s+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li>
<li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li>
<li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li>
<li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li>
<li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpxR%2FOmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li>
<li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li>
<li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li>
<li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li>
<li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site%3A+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li>
<li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li>
<li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere%3A+new+perspectives+for+studying+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li>
<li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandini%2C+P+%22Biological+Adhesives%22">Biological Adhesives</a>. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).</li>
<li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li>
<li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li>
<li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JE+%22Experiments+in+molecular+genetics%22">Experiments in molecular genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).</li>
</ol>

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중요 단계 이 합성 생물학의 접근에서 가장 중요한 단계는 유전자 디자인입니다. 합성 유전자 디자인은 효율적인 시스템 생산을 보장 할 수 세심한 할 수 있습니다. 핵 유출의 바이오 정화, 자신의 분비 시스템에 관련된 단백질을 인코딩 섬유 단량체 세 유전자를 인코딩 두 유전자는 소설 응용 프로그램을위한 새로운 기능 단위를 만들려면 강력한 금속 inducible 발기인으로 조립되었습니다. 계획 및 예측,이 장치는 매체에 코발트의 양을 증가에 의해 강화하는 향상된 높은 curli 생산,로 연결됩니다. 선택한 발기인 (P rcnA)에 해당 전사 신호, 그리고 효율적인 병진 신호 모두의 존재의 이러한 성공 결과는 curli 유전자의 각 세트 (csgBA 및 csgEFG) (그림 3 참조) 앞에 추가되었습니다. 또한, multicopy 플라스미드, 관심과 함께 작업 할 때<html> 발기인 컨트롤에 관련된 레귤레이터...

비 생물 적 지원 세균 준수는 bioremediation, biocatalysis 또는 미생물 연료 전지에서 중요한 역할을 담당하고 있습니다. Bioremediation 공정은 유기 물질을 저하하거나 금속 분포 (고정, 휘발) 또는 분화를 수정 미생물의 용량을 사용합니다. 이러한 유익한 활동은 산업 및 국내 폐기물의 오염 물을 치료하기 위해 개발 된 인공 시스템에서도 수중 및 지상 생태계에서 관찰하지만 수 있습니다. 미생물 활동의 강도와 품질뿐만 아니라 미생물의 라이프 스타일 (자유 부동 또는 biofilm에 포함)에, physico - 화학 요소에 따라 달라집니다. biofilm 형성은 다양한 메커니즘에 의해 biocides에 대한 저항력을 증진 신진 대사와 연결되어 있습니다. 이러한 현상 따라서 대부분의 bioremediation 프로세스에 권장됩니다. 또한, biofilm 형성을 제어 할 수 엔지니어링 대장균 세포가 성공적으로 적용되었습니다biochips 2-3에서 전체 셀 센서를 고정. 금속의 높은 농도에 대한 미생물의 적응은 셀에 금속을 집중 할 수 다양한 세포 외 기질 구성 요소에 같은 흡착과 같은 메커니즘, 유출 펌프의 작동 또는 특정 이동 통신 사업자를 통해 발생합니다. 유전 공학을 통해이 박테리아 활동을 증폭하는 것은 특히 Raghu 외 의해 설명 된대로 약한 수량에 높은 독성 금속의 경우, 실험실 규모의 금속 오염의 효율적이고 저렴한 치료를 할 수 있습니다. 2,008 4. 세균 개선이 경우에는 이온 교환 수지를 사용하여 클래식 화학 공정에 비해 경쟁력과 비용을 절약 방법을 나타냅니다. 저자는 E. 설명 대장균 섀시는 유 전적으로 여러 사본을 변형하여 다음의 플라스미드 수 있도록 과잉을 유출 펌프 인코딩 유전자 rcnA을 패고, 그리고에 의해 코발트 이해와 첫 보존을위한 설계코발트에 대한 우대 이해와 전송이 있습니다. 이러한 긴장은 방사능이 유출 치료 이온 교환 수지에 대한 효율적인 대안으로 보이지만 핵심 해결되지 않은 문제는 프로세스 (4)의 말에 오염 된 세균의 회복입니다. 우리 연구의 목적은 유리 또는 플라스틱과 같은 비 생물 적 지원에 대항 할 수있는 맞춤 디자인 스트레인 할 수 엔지니어링하는 것이했습니다. adhesins 및 그람 박테리아에서 확인 자기편 fimbriae의 전체 세트 사이, 우리는 curli 생산을 허용하는 시스템을 설계하기로 결정했습니다. Curli는 E.에서 돌출 얇은 (2-5 나노 미터 직경)와 매우 aggregative 아밀로이드 섬유 아르 비 결정과 불용성 매트릭스 5-7로 대장균 및 살모넬라 균의 표면. Curli도 비 생물 적 표면과 biofilms 8 개발의 식민지에 참여하고 있습니다. Curli 최근 수은 이온에게 9 바인딩 게재되었습니다. Amyloids은 실제로 높은 가지고하는 것으로 알려져 있습니다이러한 잘라 내기 : 2 금속 이온에 대한 친화력 +, 아연 2 +와 철 3 + 10. 이 속성은 더 이상 금속 오염 유출 물들의 정화를 개선 할 수 있습니다. CSG 클러스터는 curli 섬유의 생산을 책임지고 두 divergently 베꼈 operons (그림 1)의 형성되어 있습니다. csgB, csgA 및 csgC 유전자는 두 curli의 subunits, CsgA 및 CsgB을 인코딩 감각의 오페론를 구성합니다. CsgC는 curli의 biogenesis 시스템 내에서 산화 환원 활동에 참여하고 기공 동작 11 CsgG에 영향을 보인다. 그러나, curli - 생산 박테리아의 대부분의 csgC의 부재는 해당 단백질이 curli의 biogenesis 제어 만 secundary 수준을 제공했음을 나타냅니다. 시스템을 단순화하기 위해, 우리는 유전자의 최소 수와 작동하도록 선택되었습니다. csgDEFG는 규정 및 운송에 필수적인 단백질을 operonencodesCsgA와 CsgB의 세포 표면에. CsgD는 csgBAC 오페론의 전사 활성이며, curli의 fimbriae 및 셀룰로오스 12 다른 biofilm 구성 요소의 생산을 제어하여과 억제 편모 생산 13의 biofilm 형성의 제어에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. CsgE, CsgF과 CsgG는 주요 curli subunit 단백질 CsgA은 수용성 단백질로 분비되는 통해 외부 - 막에 curli 특정 분비 장치를 구성합니다. CsgA의 중합은 막에 바인딩 nucleator 단백질 CsgB (14에서 검토)에 생체에 따라 달라집니다. 여러 두 구성 요소 시스템을 포함하는 복잡한 규제 경로는 curli 유전자 발현 15-16을 제어하는 표시되었습니다. 이러한 복잡한 규정은 박테리아가 환경 단서에 대한 응답으로 curli 생산을 통해 두꺼운 biofilms를 형성 할 수 있지만, 산업용 애플리케이션을위한 제어하기가 어렵습니다. 메트로폴리스의 회복을 촉진하기산업 과정에서 박테리아를 알이 - 박제, 고체 지원 세균 고정은 참으로 잘 정의 된 매개 변수 (들)에 의해 제어해야합니다. curli의 점착성의 속성들은 아밀로이드 자연 17에 연결되어 bioremediation 프로세스를 개선하는 데 사용할 수 있지만, 간단하고 쉽게 제어 장치가 만들어 져야한다. 이 일곱 유전자 18 사이, 5 세트가 절대적으로 curli 합성 (csgB 및 csgA 인코딩 섬유 단량체)와 수출 (csgE csgF와 csgG, curli 분비물 복잡한 인코딩)에 대한 유전자 필요는 합성 오페론을 구성하는 선정되었다. curli의 &quot;자연&quot;규정, 설계 및 합성 된 강력하고 코발트 - overinducible 발기인 (그림 2)의 통제하에이 5 CSG ​​유전자를 포함하는 합성 오페론을 탈출 할 수 있습니다. curli 인코딩 지역의 단계별 분석 및 기능 SYN에 대한 설계 절차thetic 오페론이 설명되어 있습니다. 폴리스티렌과 유리에 세균 준수를 시각화하고 정량화하는 방법에는 다음 두 가지 방법이 설명되어 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> 합성 P RCN이 포함 된 3,165 BP EcoRI / PstI 조각과 pUC57 (pMB1 오라, 2710 BP) - csgBAEFG 오페론을, 앰프 연구 </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> 앰프 R, (pMB1 오라, 2686 BP) Multicopy 플라스미드 </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP 태그 MG1655, CC Sze의 선물) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> 시그마 </td><td></td><td> 0,1 M 주식 솔루션은 실온에서 보관 </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> Nunc </td><td> 55,429 </td><td> 폴리스티렌 24 잘 접시 </td></tr></tbody></table>

단일 합성 curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

여기에 설명 된 방법은 E. 디자인을 변경해에 구성 강하고 금속 overinducible 발기인의 통제하에 curli 유전자의 최소 수를 조립하여, 그리고 세균 준수의 결과 이득을 시각화하고 정량화에 대장균을 준수 속성. 이 방법은 적절한 엔지니어링 추상화의 원리 및 합성 생물학의 표준화 및 BBa_K540000 Biobrick의 결과 (가장 새로운 Biobrick 장치, 설계, iGEM 2011) 적용됩니다. 첫 번째 단계는 야생 타입 스트레인의 준수 능력을 증가에 따라서 금속에 대한 응답으로 curli의 과잉에 전념 합성 오페론의 디자인으로 구성합니다. 원래 curli 오페론은 전사와 병진 신호를 최적화하고 curli의 &quot;자연&quot;규정을 탈출하기 위해 silico에 바뀌 었습니다. 이 방법은 성공 curli 생산의 현재 이해를 테스트 할 수있었습니다. MoreoveR은, 간단한 금속 규제​​ 발기인으로 내생 복잡한 발기인 (10 개 이상의 전사 규제가 확인)를 전환하여 curli 규정을 단순화하는 것은 제어 할보다 쉽게​​ 준수합니다. 두 번째 단계는 간단한 방법의 구현으로 준수 능력의 질적 및 양적 평가를 포함하고 있습니다. 이러한 방법은 biofilm 형성에 관여 생물학적 구조에 관계없이 자기편 박테리아의 큰 범위에 적용됩니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 준수 테스트 크리스탈 바이올렛 염색 후 세균 biofilm의 빠른 사전 시각화를 제공합니다. 이 질적 시험은 준수의 비율을 정량화하여 날카롭게 할 수 있습니다. 이러한 방법은 매우 간단하지만, 좋은 반복성과 재현성을 모두 이전 한 설명으로 만 크리스탈 바이올렛 염색보다 더 정확합니다. 형광 또는 레이저 믿어으로 유리 슬라이드에 GFP 태그 박테리아의 시각화ocal 현미경은 현상을 직접 관찰하여 24 잘 판 테스트를 얻은 결과를 강화 할 수 있습니다.

E.의 야생 타입 CSG 시퀀스의 silico 특수 효과의 전사와 병진 신호의 최적화와 관련된 대장균 K12는 단일 합성 curli 오페론 P RCN-CSG는 그림 3 (보조 데이터의 전체 순서)에 표시된 설계 할 수있다. 프로토콜 2 프로토콜 3 curli 생산과 관련된 준수를 시각화하고 정량화하는 데 사용되었습니다. 24 잘 폴리스티렌 판에 크리스탈 바이올렛 염색 (protocole 2) 각도의 하단에 biofilm 형성을 사용하면 빠르게 보여 질과 보라색 색상 강도의 차이에 의해 그림과 같이 야생 형 스트레인 엔지니어링 부담보다 자기편 것 같습니다 수 있습니다 (그림 4A). 이 질적 접근 방식은 준수의 비율은 엔지니어링 변형 (그림 4B)에서 1.5 배 높은 것으로 나타 정량 측정에 의해 강화된다. quantita의 또한, 정확성<html> tive 접근 방법은 코발...

합성 오페론 인코딩 모두 분비 장치와 curli 섬유의 구조 단량체의 디자인이 설명되어 있습니다. 이 amyloids와 자기편 고분자의 과잉은의 준수 측정 게인을 할 수 있습니다<em&gt; E. 대장균</em&gt; 섀시<sup&gt; 1</sup&gt;. 준수를 시각화하고 정량화하기 쉬운 방법이 설명되어 있습니다.

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

본 연구에서 기술하는 방법은 최소한의 curli 유전자 집합을 ...의 제어 하에 조립함으로써 E. coli의 부착 특성을 재설계하는 것으로 구성됩니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 박테리아에 부착 성질을 부여하여 액체 배지로부터의 분리를 용이하게 하는 것입니다. 이는 먼저 복잡한 유전적 조절을 우회하고 끈적이는 폴리머의 쉽고 대량 생산이 가능하도록 합성 curli를 설계함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 폴리스티렌 상에서 부착 박테리아를 시각화하고 정량화하며, 이를 통해 합성 장치의 효율성을 빠르게 추정할 수 있습니다.다음으로, 공초점 현미경을 통해 유리에 부착된 박테리아를 시각화합니다. 바이오필름을 직접 관찰하고 그 구조에 대한 정보를 얻기 위해, 부착력 및 백분율 측정과 현미경 관찰 모두에서 합성 장치를 보유한 균주의 부착력이 유의미하게 증가했음을 보여주는 결과를 얻습니다. 기존의 일반적인 클로닝과 같은 방법 대비 합성 생물학적 접근 방식의 주요 장점은, 적절한 신호를 포함하여 절대적으로 필요한 유전자만을 보유한 컨스트럭트를 매우 빠르게 얻을 수 있다는 것입니다.이 방법은 방사성 폐기물에서 금속이 함유된 박테리아를 제거하는 과제와 같이 생물학적 복원 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람들은 유전적 조절 신호 및 데이터베이스 처리에 관한 기초 지식이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 시각적 시연은 바이오필름의 정량화와 시각화에 중점을 둘 것인데, 이는 바이오프레임의 취약성으로 인해 이 두 단계를 학습하기가 매우 어렵기 때문입니다.합성 카론(carron)을 설계하기 위한 첫 번째 단계는 curly 유전자의 유전적 구성을 결정하고, 이들의 내재적 전사 및 번역 신호를 국소화하는 것입니다. 이는 REON DB 또는 eco gene과 같은 전문 데이터베이스를 사용하여 수행됩니다. 다음 단계는 curly 합성에 절대적으로 필요한 5가지 유전자를 선택하는 것입니다. CSGB와 CSGA는 섬유 단량체를 코딩하며, C-S-G-E-C-S-G-F 및 CSGG는 curling 분비 복합체를 코딩합니다. 선택한 서열을 데이터베이스에서 FASTA 형식으로 추출하여 데이터 관리를 수행하고, C-S-G-G-F-E 클러스터가 E. coli 게놈에서 안티센스(antisense) 방향이므로 clone manager 소프트웨어를 사용하여 in silico 사전 분석을 수행합니다.이 서열은 상보적 역서열로 변환되어야 합니다. 클론 매니저 도구의 operations process molecule invert molecule 기능을 사용하십시오. ligate 기능을 사용하여 C-S-G-E-F-G 서열을 C-S-G-B-A 뒤에 붙여넣으십시오. 다음으로, C-S-G-B-A-E-F-G iCal 서열 앞에 적절한 프로모터 PRCN을 추가하십시오.RCN 유전좌위는 니켈 및 코발트 해독을 담당하는 FLX 펌프 RCNA와 그에 상응하는 금속 조절자인 RCNR을 인코딩합니다. 코발트나 니켈이 없을 때, 억제제 RCNR은 DNA의 RCNR 박스에 결합하여 하위 유전자의 완전한 전사 활성화를 방지합니다. 세포 내 코발트나 니켈 농도가 상승하면, 코발트 또는 니켈이 RCNR 단백질에 결합하여 억제제가 프로모터에 고정되는 것을 방지하며, 선택된 5개의 curly 유전자를 프로모터의 제어 하에 둠으로써 P-R-C-N-A의 전사 활성이 증가합니다.PRCN curly는 코발트와 니켈이 존재할 때 과잉 생산될 것으로 예측됩니다. 이어서 CS gba DNA 서열의 첫 번째 ATG 앞에 완벽한 리보솜 결합 부위(RBS)를 추가하고, C-S-G-E-F-G 서열 앞에 두 번째 완벽한 RBS를 추가하여 전사 신호를 최적화하십시오. iGEM 표준에 맞추기 위해, 해당 장치는 Eco RI 및 Xba I 제한 효소 부위를 포함하는 표준 바이오브릭 접두사와, 추가 조립을 용이하게 하기 위해 Spe I 및 Pst I 제한 효소 부위를 포함하는 접미사로 둘러싸여 있어야 합니다.바이오 브릭(bio brick) 부품 자체에는 EcoRI, PstI, SpeI 및 XbaI 인식 부위가 포함되어서는 안 됩니다. 따라서, 실리코(in silico) 제한 효소 분석을 통해 장치 내 CSGA 서열에서 PstI 부위 1개, RCNR 서열에서 PstI 부위 1개, 그리고 CSGE 유전자에서 EcoRI 부위 1개가 발견되었으며, 이러한 부위들은 침묵 돌연변이(silent mutation)를 통해 제거되었습니다.합성 오페론(synthetic operon)의 설계가 완료되면, 클론 매니저 소프트웨어를 사용하여 번역 시뮬레이션을 수행하십시오. 서열 정렬 프로그램인 blast를 사용하여 야생형 curly 단백질과 합성 오페론에 의해 인코딩된 단백질 사이의 완벽한 상동성을 확인하십시오. 2% glucose가 함유된 M 63 최소 배지 2 mL를 사용하여 24웰 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 대해 이 절차를 시작하십시오. 각 웰에 하룻밤 동안 배양한 박테리아 배양액 10⁶ cells를 접종하십시오. 박테리아를 30 °C에서 흔들지 않고 18~48시간 동안 배양하십시오. 24웰 플레이트의 각 열은 하나의 모달리티(modality)를 나타냅니다.필요에 따라 적절한 양의 코발트와 항생제를 첨가합니다. 처음 세 줄은 3회 반복 실험의 평균값을 통해 부착 박테리아 A의 양을 정량화하는 데 사용됩니다. 마지막 왼쪽 줄은 18~48시간 후 크리스탈 바이올렛 염색을 통해 바이오필름을 시각화하는 데 사용하며, 24-well 플레이트의 처음 세 줄에 있는 각 웰에서 부유 세포가 포함된 상층액을 회수하여 이를 용혈관으로 옮깁니다.각 웰을 1 mL의 M 63 배지로 조심스럽게 헹군 후, 초기 상층액과 함께 용혈관으로 세척액을 흡입합니다. 이 모아진 액체를 부유 세포라 하며 S라고 명명합니다. 마이크로플레이트 웰 바닥에는 부착 세포가 덮여 있습니다. 바이오필름을 회수하려면 각 웰에 1 mL의 M 63을 추가합니다.피펫 팁으로 긁어낸 후, 피펫팅을 통해 섞어 바이오필름 분획을 새로운 용혈 튜브로 옮깁니다. 튜브를 15초 동안 볼텍싱합니다. 용혈 튜브에 바이오필름 분획을 수집합니다.이 풀은 B로 명명된 표면 부착 세포를 나타냅니다. 용혈관의 상층액과 바이오필름 분획 200 µL를 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 600 nm에서의 광학 밀도를 통해 표면 부착 박테리아와 부유 박테리아의 수를 추정합니다. 각 양식의 부착 백분율은 B × 100 / (3 × S + B) 공식을 사용하여 계산합니다. 24-웰 플레이트의 마지막 행에 대해서만 바이오필름을 시각화하려면 해당 웰에서 플랑크톤 세포를 제거합니다.플레이트 바닥에 형성된 바이오필름을 세척하기 위해 각 웰에 M 63 1 mL를 추가합니다. 덮개를 열어둔 상태로 플레이트를 80 °C에서 1시간 동안 건조한 후, 각 웰에 20% crystal violet 100 µL를 추가하고 물로 충분히 세척합니다. 이 프로토콜에는 형광 섀시가 필요합니다.합성 curli를 포함하는 플라스미드에 적합한 숙주는 E. coli SCC1 균주이며, 이 균주는 모균주인 MG 1655와 관찰 가능한 차이 없이 녹색 형광 단백질을 지속적으로 발현합니다. 합성 curli를 포함하는 pUC57 플라스미드를 숙주 균주에 형질전환하여 S23 균주를 얻습니다. 숙주 균주를 대조군 플라스미드 pUC18로 형질전환하여 대조군 균주를 얻습니다.S 23 및 S 24 균주의 야간 배양 전배양액을 30 °C에서 배양합니다. 다음 날, 포도당과 앰피실린이 첨가된 M 63 배지 20 mL를 페트리 접시에 넣은 후, 100 µL의 전배양액을 사용하여 페트리 접시 내의 M 63 배지 15 mL에 접종합니다. 적절한 농도의 코발트를 첨가하고, 코발트가 없는 음성 대조군을 반드시 포함하십시오.각 페트리 접시에 직사각형 유리 커버슬립 3개를 넣습니다. 접시를 30 °C에서 흔들지 않고 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 형광 현미경을 통해 박테리아를 직접 관찰할 수 있습니다.시료가 마르는 것을 방지하는 것이 중요하므로, 다음 단계들은 세심하면서도 빠르게 수행해야 합니다. 페트리 접시에서 각 커버슬립을 제거하고 조심스럽게 액체를 따라냅니다. 공초점 관찰을 위해 70% ethanol을 적신 작은 면봉으로 하단면을 조심스럽게 닦아 모든 박테리아 잔해를 제거합니다.바이오필름이 윗면을 향하도록 커버슬립을 유리 슬라이드 위에 놓습니다. 그 후 바이오필름 위를 더 큰 커버슬립으로 덮고, 바니시를 이용해 유리 슬라이드에 고정합니다.바이오필름이 아래쪽 면에 위치하도록 장치를 뒤집습니다. 이번 실험에서는 장치를 공초점 레이저 현미경 아래에 배치합니다. CT 마이크로 플랫폼 내에서 Zeiss LSM 510 Meta 공초점 레이저 현미경이 사용됩니다.40배 오일 침강 렌즈를 선택하십시오. 488 nm에서 GFP를 여기시키고 500에서 600 nm 범위의 박테리아 형광을 수집하는 다음 설정을 사용하십시오. 이미지 획득을 위해 40배 오일 침강 렌즈를 사용하십시오.레이저 주사 공초점 모드에서, 고체 표면부터 성장 배지와 맞닿은 계면까지 바이오필름의 전체적인 3차원 구조를 스캔합니다. 이때 스캔 간격은 1 µm로 설정합니다.마우스 소프트웨어를 사용하여 3차원 투영을 수행하고, 통계적 종단면을 따라 평균 C 값을 분석하여 바이오필름 두께를 결정합니다. 공초점 Z-스택에서 바이오필름의 정량화 및 생물학적 부피를 추출할 수 있습니다. 금속에 반응하여 curli를 과잉 생산하도록 설계된 e coli의 부착 능력은 간단한 방법으로 평가할 수 있습니다.예를 들어, 24웰 연마 처리된 Irene 플레이트에서 크리스탈 바이올렛 염색을 실시하면 각 웰 바닥의 바이오필름 형성 여부를 보라색 색강도의 차이를 통해 빠르게 시각화할 수 있습니다. 야생형 균주가 엔지니어링된 균주보다 부착력이 낮은 것으로 보입니다. 정량적 방법으로는 다양한 농도의 코발트 조건에서 야생형 및 엔지니어링된 균주의 폴리스티렌 부착률을 측정하는 것이 있습니다.이 그래프에 제시된 결과는 코발트가 없을 때 조작된 균주의 부착률이 야생형 균주보다 1.5배 더 높다는 것을 보여줍니다. 또한, 코발트 농도가 증가함에 따라 부착력이 유의미하게 강화되는 것이 관찰되었으며, 25 µM 또는 50 µM의 코발트 농도를 포함하는 배지에서 조작된 세포의 부착률은 각각 30%와 40%에 도달했습니다. 부착 능력은 유리 슬라이드에서 배양한 GFP 태그 박테리아를 이용한 현미경 관찰을 통해 비교할 수도 있는데, 검은색 배경에서 녹색 박테리아를 관찰한 에피 형광 현미경 결과, 조작된 균주는 바이오필름을 형성하는 반면, 야생형 균주는 화살표로 표시된 것과 같이 미세 군락만을 형성함을 알 수 있습니다.공초점 현미경 분석을 통해 바이오필름 3차원 구조의 전반적인 모습을 확인할 수 있습니다. 상단 뷰 재구성 이미지는 패널 A에, 측면 뷰 재구성 이미지는 패널 B에 나타나 있습니다. 결과는 엔지니어링된 균주가 야생형보다 더 잘 부착되며, 더 조밀하고 두꺼운 바이오필름을 형성한다는 것을 확인시켜 줍니다. 이 절차를 수행할 때는 방사성 폐수 환경에서 변형된 e coli 또는 occus ants의 생물학적 매개 가능성을 탐색하는 것과 같이 실험 설계 내용을 다시 한번 세밀하게 점검하는 것이 중요합니다.이 영상을 시청한 후에는 클론 매니저 소프트웨어를 사용하여 합성 오페론을 설계하는 방법과 박테리아 균주의 발현량을 빠르게 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 합성 유전자 및 유전자 변형 생물을 다루는 것은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 이 절차를 수행하는 동안에는 변형된 박테리아의 오토클레이브 멸균과 같은 예방 조치와 현행 법규에 따라 적절한 관리가 이루어져야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

여기에서는 테트라사이클린 제어 기반 유도 합성 회로를 설계, 구축 및 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기생충 제거 및 사이토카인 발현에 대한 합성 회로의 영향은 제시된 파이프라인을 채널화하여 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 전염병의 합성 회로 기반 치료법을 연구하는 연구자와 관련이 있습니다.

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies(숙주 지향 치료법 발전을 위한 감염의 면역대사회로)

이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

학습하세요 합성 컬리 오페론을 설계하여 대장균의 점착성을 향상시키는 방법을. 공학 박테리아의 분리 및 생물막 형성 정량화 기술을 탐색하세요.

단일 합성 Curli 오페론을 생성하여 공학 점착성의 박테리아를

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