외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

이 절차의 전반적인 목표는 직류 전기장이 있는 상태에서 성체 유래 신경 전구 세포의 이동을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 성체 쥐에서 뇌막하 신경 전구 세포를 분리하고 배양함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 Galvan Axxis 챔버를 준비하고 신경 전구 세포를 챔버로 옮기

마지막 단계는 Galvan Axxis 챔버에 직류 전기장을 적용하고 타임 랩스 이미징을 수행하여 신경 전구체 이동을 관찰하는 것입니다. 궁극적으로, 타임 랩스 이미징 현미경은 신경 전구체의 차별화된 상태와 미분화된 상태의 Galvan 전술 특성을 포착합니다. 이 방법은 신경 전구체 세포 갈반 오아시스에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 신경 복구를 향상시키기 위해 병변 부위에 신경 전구체를 모집하기 위한 마우스 스트로크 모델과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Rob Pilley Post입니다. 이 절차를 시작할 때, NPC는 자유롭게 떠다니는 1차 신경구를 수확할 준비가 될 수 있도록 7일 동안 배양되어야 합니다. 필요한 경우 3개의 정사각형 유리를 배치하여 3개의 Galvan Axxis 챔버를 준비하기 시작합니다.

첫 번째, 하룻밤 사이에 6개의 일반 염산 병에 뚜껑이 미끄러집니다. 다음 날 일찍 마트라 젤을 얼음 위에서 천천히 해동하도록 설정합니다. 4시간이 지나면 방을 짓는 데 사용할 준비가 됩니다.

먼저 다이아몬드 팁 유리 커터를 사용하여 새 사각형에서 6개의 직사각형 유리 스트립을 자릅니다. 첫 번째는 커버 슬립입니다. 산성 세척 된 사각 슬립과 직사각형 슬립을 층류 후드로 옮깁니다.

유리 스트립을 70% 에탄올로 세척한 다음 조직 배양 등급 오토클레이브 물로 세척합니다. 자연 건조하거나 보푸라기가 없는 종이에 말리십시오. 다음으로, 각 정사각형 유리 슬라이드의 한 표면 둘레에 진공 그리스를 바르고 60mm 플라스틱 바닥에 밀봉합니다.

페트리 접시. 직사각형 유리 스트립의 한쪽 면에 진공 그리스를 바르고 사각형의 반대쪽 가장자리에 밀봉합니다. 유리로 슬라이드하여 각 접시의 중앙에 중앙 홈이 있는 사각형을 만듭니다.

이러한 변형된 유리 사각형 또는 챔버를 후드에서 최소 15분 동안 UV 살균합니다. 다음으로 250-300 마이크로 리터의 폴리올 라이신을 챔버의 중앙 골짜기에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 배양이 끝나기 약 15분 전, 2시간 동안 실온에서 챔버를 배양합니다.

2 시간 후에 matri 젤 용액을 준비하고 폴리올 라이신을 흡인하고 1 ml의 오토 클레이브 물로 중앙 홈통을 세척합니다. 그런 다음 250-300 마이크로리터의 Matri 겔 용액을 중앙 트로프에 피펫팅하고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 챔버를 배양합니다. 배양 후 마트리겔 용액을 흡인합니다.

그런 다음 1-2 밀리리터의 SFM으로 중앙 홈통을 부드럽게 씻으십시오. 이제 배양된 세포를 준비하기 위해 100마이크로리터의 E-F-H-S-F-M 또는 F-B-S-S-F-M을 중앙 트로프에 피펫팅합니다. 다음으로, 배양액을 포함하는 신경 구체의 4-5밀리리터를 새로운 60mm 페트리 접시에 피펫팅합니다.

그런 다음 페트리 접시를 5배 관찰 대물렌즈 아래에 있는 계수 현미경의 스테이지에 놓습니다. P 10 피펫을 사용하여 5-8개의 전체 신경구를 각 챔버의 중앙 골짜기로 부드럽게 옮깁니다. 최대 4개까지 가능합니다.

신경구체는 한 번에 전달될 수 있지만 중앙 골에 있는 신경구체와 분리되지 않습니다. 마트리겔 기질을 방해하지 않도록 조심스럽게 펴십시오. 그런 다음 중앙 골짜기에 150마이크로리터의 E-F-H-S-F-M 또는 F-B-S-S-F-M을 추가합니다.

이제 배양, 세포를 가습 된 인큐베이터에서. 배양에서 17시간에서 20시간이 지나면 69시간에서 72시간 후에 차별화되지 않은 NPC를 사용할 수 있습니다. 문화에서는 차별화된 NPC를 사용할 수 있습니다.

회계 현미경에서 살아있는 세포 이미징 이동 분석에 가장 적합한 세포가 있는 챔버를 선택합니다. 세포는 둥글어야 하고, 신경구에서 거의 완전히 분리되어야 하며, 아직 해리되지 않았거나, 후드에서 돌기를 형성하기 막 시작했을 뿐이다. 챔버 커버를 준비합니다.

정사각형 유리 커버 슬립을 70% 에탄올로 씻은 다음 고압증기멸균된 물로 씻고 두 개의 평행한 가장자리에 진공 그리스 스트립을 바릅니다. 이제 챔버를 덮으십시오. 먼저 중앙 물통에서 배양 배지를 흡인 한 다음 덮개를 빠르게 밀봉하고 지붕과 같은 직사각형 벽에 밀어 넣습니다.

다음으로, 모세관 작용을 사용하여 100마이크로리터의 새로운 매체를 중앙 트로프에 로드합니다. 이제 진공 그리스를 사용하여 배양 배지 풀에 대한 테두리를 만듭니다. 라이브 셀 이미징 시스템의 중앙 트로프의 양쪽 끝에 사용할 아그로스 젤 튜브, 은, 염화은 전극 및 2개의 60mm 페트리 접시를 준비했습니다.

배양 배지 저장소로서 챔버를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 환경 내에서 20-30분 동안 방치합니다. 이 시간 동안 두 개의 빈 페트리 접시의 뚜껑과 Galvan Axxis 챔버 페트리 접시의 뚜껑을 Dremel 또는 도구 피펫으로 구멍을 뚫고 중앙 트로프의 양쪽에 1.5-2 밀리리터의 매체를 뚫고 각 빈 페트리 접시에 7-8 밀리리터의 SFM을 추가합니다. 챔버의 중앙 트로프의 양쪽에 하나의 페트리 접시를 놓고 각 접시에 하나의 전극을 놓습니다.

챔버와 페트리 접시 사이의 간격을 연결하여 전기적 연속성을 설정합니다. Agros 젤 브리지를 사용하여 전극을 M 미터가 직렬로 연결된 외부 전원 공급 장치에 연결하여 전류를 측정하고 전원 공급 장치를 켭니다. 부피계를 사용하여 중앙 골짜기를 직접 가로지르는 전기장의 강도를 측정합니다.

필요에 따라 전원 공급 장치의 출력을 조정합니다. 이제 이미징 시스템에서 타임랩스 모듈을 시작합니다. Axio 비전 소프트웨어에서 다차원 획득을 선택하고 보기를 클릭합니다.

채널의 경우 채널 6을 선택하고 타임랩스를 위해 T를 클릭합니다. 타임랩스 간격 설정을 1분으로 설정하고, 설정 전, 후 시점 필드에서 지속 시간을 8시간으로 설정하고, 시점 이전과 이후를 선택합니다. 이제 시작을 클릭하고 분석 완료 후 원하는 시간 동안 실험을 실행하고 IHC 분석을 진행하십시오.

운동학적 분석에 따르면 밀리미터 DCEF당 250밀리볼트의 존재 하에서 미분화 NPC가 이 자기장 강도에서 음극을 향해 고도로 방향성적이고 빠른 갈반 축전류를 나타내며, 98% 이상의 미분화 NPC가 이미징된 전체 6-8시간 동안 이동했습니다. A-D-C-E-F가 없는 경우. 세포의 무작위 이동이 관찰되었습니다.

죽은 세포는 이동하지 않기 때문에 이 기간 동안 생존 가능한 상태로 남아 있음을 시사합니다. A-D-C-E-F의 부재 또는 존재 하에서, 분화된 표현형은 분화된 세포의 A-D-C-E-F 부분 집합의 존재 유무 모두에서 무시할 수 있는 이동을 겪었습니다. DCEF의 방향에 수직으로 정렬되는 경향이 있는 확장된 과정이었지만 눈에 띄는 세포체 전좌는 관찰되지 않았습니다.

면역염색을 통해 NPC가 DC EF 노출 6시간 후에도 신경 전구체 마커 중첩의 긍정적인 발현을 유지했음을 확인했습니다. 성숙한 표현형으로 분화하도록 유도된 NPC를 포함하는 분석에서 대부분의 세포는 DCEF 노출 6시간 후 성숙한 성상세포 마커 신경교섬유산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)을 발현합니다. 이 절차에 따라 유전자 녹아웃 모델을 사용하여 직류 전기장을 세포 운동성으로 변환하는 데 관여하는 세포 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

예를 들어, 선생님.