Name: 전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 전기 없이 PCR 준비 핵산과 면역반응성 단백질을 분리하는 방법입니다. 고아닌티오시아네이트를 이용한 고상 추출 기법으로 현장 연구에 적합한 간편한 프로토콜을 익히세요.

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추출 피펫의 발전을위한 기금은 DRP에게 수여 내부 연구 및 개발 보조금에 의해 일부로 제공되었다.

1. 샘플 용해 <ol><li> 샘플은 액체 형태로되어 있어야합니다. 예제 단단한 경우 예를 들어 음식이나 대변을 위해, 샘플은 식염수 (PBS)를 버퍼와 같은 물이나 인산 등의 액체 매체 중단되어야합니다. </li><li> 1.5 ML 관에서 6M 구아니딘의 Thiocyanate (산도 6.5) 500 μL로 시료 500 μL를 섞습니다. </li><li> 주위 공기를 추방, 추출 피펫의 전구를 낮춰. </li><li> 전구가 천천히 확장을 허용하여, sorbent 자료를 통해, 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요. </li><li> 추출 도구는 그러한 반전 그 sorbent 구슬과 전구로 샘플 유출. </li><li> 추출 피펫 중에 샘플을 추방하지 않도록 조심하는 전구의 예제와 sorbent 구슬을 갈다. </li></ol> 2. 핵산 추출 (그림 1, 패널) <ol><li> 추출 피펫을 (하향 열기) 반전하고 원래 1.5 ML 관에 샘플을 추방. </li> &lt;리&gt; 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중하다고, 적당한 속도로, sorbent를 통해 전달 추출 피펫으로 전체 1 ML 샘플을 당기세요. </li><li> 전구 우울증에 의해 1.5 ML 관에 전체 샘플을 추방. </li><li> 오 패스 총 sorbent 네 개가 배 위에 시료를 통과, 단계 2.2 2.3 반복합니다. </li><li> sorbent 이상의 다섯 번째 패스 후, 단백질 추출 완충액 (15 ML 원뿔 튜브)의 4mL로 전체 1 ML 샘플을 추방, 튜브를 닫습니다, 그리고 나중에 사용하기 위해 별도로 설정합니다. </li><li> 최종 통과시 원래 튜브로 에탄올을 반환, sorbent 세 번 이상의 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 분리된 핵산을 씻으십시오. </li><li> 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 2.6 단계를 반복합니다. </li><li> 눌러 핵산 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. 추출 피펫 U의 일각에서 잔류 에탄올 닦아Kimwipe 노래를. </li><li> sorbent 다섯 번 이상 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8) 250 μL를 전달하여 핵산을 복구합니다. 트리스 버퍼 같은 PBS와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 압축을 푼 핵산이 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. 단백질 추출 (그림 1, 패널 B) <ol><li> 전도에 의한 단계 2.5에서 샘플 및 단백질 추출 버퍼 튜브를 섞어서 새로운 추출 피펫의 sorbent 이상이 5 ML 샘플의 약 2-3 밀리리터를 전달합니다. </li><li> 추출 피펫의 목에 sorbent를 유지하는 데 신중 같은 15mL 원뿔 튜브로 전체 샘플을 추방. </li><li> sorbent 15 배 이상의 샘플을 전달 단계 3.1 및 3.2 반복합니다. </li><li> sorbent 침대 위에 세 번, 그것의 원래 관으로 꺼내기 에탄올을 95 % 에탄올 1 ML를 전달하여 sorbent 및 바운드 단백질을 씻으십시오. </li><li> 두 번째 한 ML, 95 % 에탄올 세척을 사용하여 3.4 단계를 반복합니다. </li><html><li> 눌러 단백질 / sorbent 침대를 건조 추출 피펫 내내 주변 공기를 통과, 15 분 전구를 놓습니다. kimwipe를 사용하여 추출 피펫의 일각에서 잔류 에탄올을 닦아주십시오. </li><li> sorbent 다섯 번 이상의 PBS 250 μL를 전달하여 단백질을 복구할 수 있습니다. PBS 버퍼와 같은 10 밀리미터 트리스 (산도 6.8)와 같은 다른 적절한 수용액으로 대체하실 수 있습니다. 결과 솔루션은 샘플의 단백질 함량을 포함하고 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="그림 1A" /> 1 그림. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="그림 4" /> 4 그림. 컨텐츠 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

이 보고서에 설명된 도구, 화학 및 프로토콜 필드 기반, 포인트의 케어 애플 리케이션에서 활용할 수있는 전기없는, 멀티 macromolecule 추출 시스템의 첫 번째 알려진 예제를 나타냅니다. 두 macromolecule 종류 하류 진단이나 분석 장치의 숫자에 적용할 수 있습니다. 샘플의 단백질 구성 요소 (그림 4) immunoreactive 반면 예를 들어, 분리된 핵산은 PCR 품질 (그림 2 및 3)입니다. 세계의 금욕이나 리소스가 제한된 지역에서 본 추출 시스템의 활용도가 크게 거기 사는 인구에 대한 질병의 부담을 줄일 수 있습니다. 이 추출 시스템은 또한 금욕 또는 원격 위치에서 시료 처리를위한 견고한 아직 신속하고 비용 효과적인 방법을 제공하여 전세계 질병 감시 프로그램을 도울 수 있습니다. 위에 명시된 추출 방법에 대한 하나의 중요한 요소는 그그것은 사용자가 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 크기는 초기 500 μLs (단계 1.2)보다 크거나 적은 경우에, 사용자는 이에 따라 시약의 볼륨을 조정할 수 있습니다. 그것은 절대적인 볼륨을 변경할 수 있습니다 반면 샘플 크기 시약의 용적 비율이 일정하게 유지하여야합니다. 또한, sorbent여 구절의 수가 조정은 또한 사용자의 재량으로 만들 수 있습니다. 큰 샘플 볼륨이 사용되는 예를 들어, 나열된 것보다 sorbent 번 이상 (단계 2.4 &amp; 3.3) 이상의 시료를 통과하는 것은 sorbent 연락 macromolecule 유형 (핵산 또는 단백질)의 가능성을 높일 것입니다. sorbent 채도에 도달할 때까지 단락의 증가는 증가 효율성을 캡처해야합니다. 우리는 추출 도구 및 관련 화학은 단백질 추출 화학이 높은 glycosylated의 회복을 비효율적이라는 것입니다 가장 중요한 그 중 몇 가지 제한 사항을 가진 것으로 나타났습니다단백질. 하류 진단이 glycosylated 단백질을 대상으로하는 경우에이 시스템 식별에 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 핵산이나 단백질 중 하나에 대한 추출 효율의 위턱과 아래턱에 제한은 아직 결정 및 최적화가 복구 효율성을 최대화하기 위해 진행하고있다. 도구의 발전이 현재의 지식 격차를 극복합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 구아니딘의 Thiocyanate </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2 - 프로파놀 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 </td><td> - 4503 </td></tr></tbody></table>

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

이러한 Enterohemorrhagic 대장균 (EHEC), Yersinia pestis의, 또는 prion 기반의 질병 등 전통과 신흥 병원균은 정부, 산업 및 전세계 의료 전문가들을위한 상당한 우려입니다. 예를 들어, 시겔라 결합 EHECs은, 약 325,000 어린이 매년 죽음에 책임이 있으며, 미국에서 일반적인 실험실 기반의 신분은 1 사용할 수없는 개발 도상국 특히 만연한 있습니다. 저렴한 비용의 개발 및 배포는 병원균이나 질병 마커의 신속한 식별 및 / 혹은 진단을 도울 현장 기반, 포인트의 케어 도구가 극적으로 질병의 진행과 환자의 예후를 변경할 수 있습니다. 우리는 전기 또는 관련 실험실 장비이없이 고체 상 추출 (SPE)에 의해 시료로부터 핵산과 단백질을 분리하기위한 도구를 개발했습니다. 격리된 macromolecules는 diagno 사용할 수 있습니다앞으로 실험실 또는 현장 기반 포인트의 케어 플랫폼을 사용하여 두 동생. 중요한 것은,이 방법은 게놈 및 proteomic 분석 확증을 통해 자신감을 제공하고, 핵산 및 해제 분할 시료로부터 단백질 데이터의 직접적인 비교를 제공합니다. 우리 절연 도구는 실리카 기반의 입자 또는 필터를 3으로 바인딩을 통해 chaotropic 소금 용액, 보통 구아니딘의 isothiocyanate에서 핵산을 분리 고체 상 핵산 분리를위한 업계 표준, 붐 기술을 활용합니다. CUBRC의 독점 고체 상 추출 화학은 핵산 분리 네에 따라 폐기물이나 흐름 죽에서,이 경우에는 chaotropic 소금 솔루션에서 단백질을 정화하는 데 사용됩니다. 포장함으로써, 소형 저렴하고 간단한 플랫폼에 화학을 잘 특징, 우리는 VAR하에 수행할 수 핵산 및 단백질 추출을위한 휴대용 시스템을 생성했습니다조건 iety. 분리된 핵산들은 안정이되었고, 단백질 함량은 즉시 개최 손 또는 기타 면역 기반 assays에 의해 분석할 수있는 동안 전원 PCR 증폭에 사용할 수있는 위치로 운반하실 수 있습니다. 분야의 질병 마커의 급속한 신분은 크게 질병 진행의 초기 단계에서 치료의 적절한 과정을 지시하여 환자의 결과를 변경할 수 있습니다. 설명된 도구와 방법은 거의 모든 전염성 요원과 함께 사용하기에 적합하며 동시에 자신의 물류 부담을 줄이면서 사용자에게 멀티 macromolecule 유형 분석의 중복을 제공합니다.

핵산 분리 : 절연 핵산은 PCR amplifiable 및 단백질 오염 무료입니다. 예제 1 : 복구 핵산은 PCR 기반 응용 프로그램에 사용하기 적합합니다. 예를 들어, 그림 2 Enterohemorrhagic E.와 관련된 시가 독소 유전자의 증폭을 보여줍니다 대장균 O157 : 추출 피펫을 사용하여 핵산 / 단백질 추출 과정에서 H7 변형 편집 판단리스트-933 (ATCC # 35150). 시가 독소의 유전자 STX 1 STX 2가 해당 제품 및 기타 Enterohemorrhagic E.에 온화한 람다 같은 박테리오 파지 및 결함 박테리오 파지에서 찾을 수있는 P R업자 5 6 7 8의 통제하에 대장균의 변종. E.의 SOS 반응의 활성화 대장균은 유도 및 / 또는 독소 생산 9 prophage로 안내합니다. 우리는 펭 외 의해 멀티 플렉스 PCR 분석의 수정된 버전을 활용했습니다. 11 문화와 아군 하수 시료 모두에서 STX 1 STX 2 유전자를 식별합니다. 레인은 그림 2에서 A와 B는 처리되지 않은 문화 샘플 (레인)의 PCR 증폭 및 처리 문화 샘플 (레인 B)의 결과를 보여줍니다. 이러한 결과는 거의 동일 의미가 처리되지 않거나 고립된 핵산의 충실도에 대한 손실이 없습니다. 우리는 다음 아군 원시 하수 (차선 D) 또는 아군 하수의 고립 핵산 (차선 E &amp; F)를 증폭. 이러한 데이터는 분리된 핵산은 아군 하수 시료에서 비 절연 핵산 대 더욱 증폭으로 이어진 것으로 나타났습니다. 따라서 자연스럽게 하수도에서 발견 PCR 억제제 중 하나는 고립에 따라 제거되었다는이나 핵산이 분리시 집중되어 있다고 결론. 이 두 가설의 조합도 가능합니다. 자외선 분광법은 다음 고립된 핵산이 비교적 자유로운 것​​을 표시하기 위해 사용되었다 OF 오염 단백질. 그림 3은 두 가지 중에 자외선 스펙트럼을 보여줍니다 대장균 O157 : H7 핵산 extractions, 라벨 절연 및 절연 B, 미리 격리라는 세균성 문화의 정규화된 스펙트럼에 비교 인치 분리된 핵산의 자외선 스펙트럼은 260 nm의 및 1.8 10 다가오고 280 nm의 흡광도 사이의 계산된 비율을 가진, 순수한 핵산의 스펙트럼 유사합니다. 이러한 데이터를 설명하는 기법을 사용하여 복구 핵산 분획이 매우 작은 오염 단백질이있다는 것을 보여줍니다. 단백질 분리 : 핵산 / 단백질 분리 실험에서 발견한 단백질은 immunoreactive 순수 단백질에 electrophoretically 동일합니다. 예제 2 : 분리된 단백질 분획은 RapidChek E.에 적용되었다 대장균 O157 측방 유동 분석 스트립 (SDIX 주식 회사). 컨트롤 E.을 품고 모든 샘플에서 긍정적인 인식을 보여 대장균<html> 하거나 STX 유도 (그림 4, 각각 차선 B와 C)없이 O157. 그림 4의 데이터는 또한 E.을 품고 그 샘플에 대한 긍정적인 결과를 보여 추출 피펫을 사용하여 핵산 그리고 단백질에 대한 처리 된 대장균 O157. 이러한 데이터는 각 시료에서 분리된 단백질은 따라서 긍정적인 반응을 촉발 immunoreactive는 것을 보여줍니다. PCR 증폭은 (같은 예제 1에서 설명) 절연 단백질 분획은 핵산을 오염은없는 걸 보여주 단백질 샘플에서 수행되었다. 이러한 실험 결과는 겔 전기 영동에 의해 모두 부정했다. 따라서, 우리는 샘플의 단백질 함량은 핵산을 오염으로부터 분리되었다고 결론 지. 이러한 결과는, 핵산 및 단백질 함량이 별도 분획화 단계에서 격리되는 핵산 분리 단계 쇼 설명한 기능과 전체에서 촬영된. T &quot;&gt; 예 3 :. 분리된 단백질은 전기 영동 10 적합 그림 5는 coomassie가 추출 피펫 및 관련 사용하여 6M 구아니딘의 isothiocyanate 격리 BSA (그림 5, 레인 &amp; C)와 BSA와 함께 로드된 8 % 아크릴 아미드 겔을 묻다 모습 프로토콜. 고립된 단백질의 전기 영 동적 이동성은 컨트롤 샘플의 그것과 동일합니다. 우리 때문에 추출 과정이 고립된 단백질의 공유 결합 구조를 변경하지 않는다는 결론. <img alt="그림 1A" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> 그림 1, 패널 : 전형적인 핵산 추출 과정의 묘사 샘플은 샘플 튜브에서 6M 구아니딘의 thiocyanate와 함께 섞어 sorbent 다섯 번 이상 전달됩니다.. 마지막 통과 후, 샘플은 단백질 추출 버퍼에 추가됩니다. sorbent 및 바운드 핵산은 에탄올로 두 번 씻어있다. 예제 다음 메니저입니다려다와 sorbent에서 eluted. <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> 그림 1, 패널 B : 전형적인 단백질 추출 절차의 묘사 단계 1, 그림 1은 두 번째 추출 피펫 15 배의 sorbent를 통해 전달되는 패널에서 단백질 분리 버퍼와 혼합 샘플.. 절차의 나머지 핵산 추출 프로토콜의 그것과 동일합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> 그림 2 :. ethidium 브로마이드 스테인드 아가로 오스 겔의 음수 그림은 멀티 플렉스 시가 독소 1과 2 유전자 증폭 실험은 엑스타시를 타서 문화 샘플 (차선 A와 B) 또는 원시 하수 샘플을 사용하여 수행되었다 대장균 O157 : H7 (차선 D, E 및 F). 샘플을 직접 PCR 반응 튜브 (차선 및 D) 또는 샘플에 추가된 것은 절연 proces를 사용하여 처리되었습니다s와 추출 핵산은 PCR 반응 튜브 (샘플 B, E 및 F)에 추가되었습니다. PCR 프로토콜 펭 외 11 시까지 설명한 하나의 수정입니다. 우리의 수정은 다른 모든 프라이머 쌍을 이탈, 오직 STX 1 (낮은 대역)과 STX 2 (상위 대역) 프라이머 쌍에 의해 증폭들을 대상으로. 레인 C는 BioRad에서 1Kb 사다리입니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> 그림 3 : 중에 자외선 분광 결과 대장균 O157 : H7 핵산이 보고된 추출 피펫을 사용하여 격리 격리된 핵산은 절연 및 절연 B로 표시됩니다.. 샘플의 자외선 스펙트럼은 또한 사전 핵산 추출로 테스트되었고 사전 고립 표시됩니다. 스펙트럼은 히타치 U3010 분광 및 관련 소프트웨어 패키지를 사용하여 획득했다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; 그림 4 :. RapidChek 테스트 스트립의 컬러 사진은 그림 2에 사용되는 샘플의 단백질 함량은 추출 피펫을 사용하여 격리 및 측면 흐름 분석에 의한 immuno-반응성 위해 테스트되었습니다. 차선 교류, 세포 배양은 핵산이나 단백질 추출하지 않고 테스트 스트립에 추가되었습니다되어 처리되지 않은 컨트롤입니다. 차선는 엑스타입니다 부정적인 컨트롤과 같은 대장균 BL21 DE3 pLysS, 레인 B와 C 쇼 E. 대장균 O157 : (B) 또는 4 시간 동안 mitomycin C (C)로 치료 경과했습니다 H7. H를 통해 레인 D는 측면 흐름 테스트 스트립으로 추출한 단백질을 추가하는 결과를 보여줍니다. 레인 D와 E는 E.로부터 단백질 추출물을 사용하여 탐지되었다 중 (D)없이 또는 부정적인 컨트롤로 mitomycin C 처리 (E)와 대장균 BL21 DE3 pLysS합니다. E.로부터 단백질을 추출했을 때 FH는 결과를 보여 차선 대장균 O157은 : H7가 사용되었습니다. 단백질은 (F) 치료, 또는 2 시간 (G) 또는 4 시간 (H) Mitomycin C 처리 문화에서 추출되었다.긍정적인 결과는 이중 빨간색 라인을 생산하고 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> 그림 5 :. Coomassie의 스테인드의 사진 SDS-PAGE BSA는 추출 피펫과 기술된 프로토콜을 사용하여 용액으로부터 격리되었다. 울타리와 C는 각각 250 μg / ML 500 μg / ML의 제어 차선입니다. 레인 B와 D는 각각의 컨트롤과 같은 농도를 포함하는 솔루션에서 발견한 BSA를 묘사.

도구 및 화학 순차적으로 전기없이 샘플의 단백질이어서 핵산을 분리 설명되어 있습니다. 도구는 격리 화학은 고체 상 추출 원리에 기초하는 동안 전송 피펫 내에서 개최 sorbent 구성되어 있습니다. 격리된 macromolecules는 immuno 기반 및 PCR 기반 assays에 의해 분석할 수 있습니다.

장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC), 페스트균(Yersinia pestis) 또는 프리온 기반 질환과 같은 전통적 및 신흥 병원체들은 상당한 관심 대상이며...

이 절차의 전반적인 목표는 전기나 실험실 인프라 없이 샘플에서 PCR 준비가 된 핵산과 면역 반응성 단백질을 분리하는 것입니다. 핵산과 단백질의 분리는 샘플을 구아니딘 및 티오시아네이트와 혼합하여 샘플을 용해하고, 혼합물을 추출 피펫의 흡착제 위로 통과시키는 것부터 시작합니다. 흡착제를 다섯 번 통과시킨 후, 최종적으로 혼합물을 단백질 추출 버퍼에 넣고 면역 반응성 단백질 분리를 위해 보관합니다.다음으로, 흡착제에 95% ethanol을 통과시켜 흡착제와 결합된 핵산을 세척합니다. 그 후, 흡착제에 주변 공기를 5분 동안 통과시키는 과정을 여러 번 반복하여 흡착제와 결합된 핵산을 건조시킵니다. PCR 준비용 핵산 분리를 위한 마지막 단계는 250 µL의 tris 또는 이와 유사한 다른 수용액을 사용하여 흡착제로부터 면역 반응성 단백질 분리를 위한 핵산을 용출하는 것입니다.시료와 단백질 추출 버퍼를 혼합한 후, 보조 추출 피펫을 사용하여 혼합물을 흡착제 위로 15회 통과시킵니다. 다음 단계로 95% ethanol을 흡착제 위로 여러 번 통과시켜 단백질이 결합된 흡착제를 세척합니다. 그 후, 5분 동안 주변 공기를 흡착제 위로 통과시켜 흡착제와 결합된 단백질을 건조시킵니다.프로토콜의 마지막 단계는 흡착제로부터 단백질을 용출하는 것입니다. 결과적으로, 이 절차에 사용된 추출 피펫을 통해 전기 장치 없이도 PCR 가능한 핵산과 면역 반응성 단백질을 분리할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Dave Pawlowski입니다.저는 뉴욕 버팔로에 위치한 Kubrick Incorporated의 수석 연구원으로, 오늘은 원심분리기나 볼텍스 또는 기타 추가적인 실험 장비 없이 샘플 용해 전에 단백질과 핵산을 동시에 분리하는 기술을 배워보겠습니다. 샘플 용해 전, 샘플이 액체 상태인지 확인하십시오. 식품이나 대변과 같이 샘플이 고체인 경우, 물 또는 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 액체 배지에 샘플을 현탁시켜야 합니다.1.5 mL 튜브에 샘플 500 µL와 6 M 구아니딘 티오시아네이트 500 µL를 혼합합니다. 다음으로, 추출 피펫의 벌브를 눌러 내부의 공기를 배출합니다. 벌브가 천천히 팽창하도록 하여 흡수제 위로 1 mL의 샘플 전체를 추출 피펫 안으로 끌어당깁니다.흡착 비즈와 샘플이 벌브 쪽으로 쏟아지도록 추출 도구를 뒤집습니다. 벌브 내의 샘플과 함께 흡착 비즈를 분쇄합니다. 이때 샘플이 추출 피펫 밖으로 배출되지 않도록 주의하십시오.추출 피펫을 거꾸로 세워 샘플을 원래의 1.5 milliliter 튜브에 배출하십시오. 1 milliliter 샘플 전체를 추출 피펫으로 빨아들여, 적당한 속도로 흡착제를 통과시킵니다. 흡착제가 추출 피펫의 목 부분에 유지되도록 주의하면서, 벌브를 눌러 샘플 전체를 1.5 milliliter 튜브에 배출하십시오.이 과정을 반복하여 샘플을 흡착제에 네 번 더 통과시켜 총 다섯 번 통과시킵니다. 흡착제를 다섯 번째로 통과시킨 후, 15 mL 원추형 튜브에 담긴 4 mL의 단백질 추출 버퍼 속으로 1 mL 샘플 전체를 배출합니다. 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 튜브를 닫고 나중에 사용할 수 있도록 보관합니다.1 mL의 95% ethanol을 흡착제에 세 번 통과시켜 분리된 핵산을 세척하고, 사용한 ethanol은 원래의 튜브로 되돌립니다. 마지막 통과 후, 새로운 1 mL의 95% ethanol 세척액을 사용하여 세척 과정을 세 번 더 반복합니다. 절차의 다음 단계는 흡착제를 건조시키는 것입니다. 흡착제가 건조된 상태일 때 핵산 회수 효율이 가장 좋습니다.이 단계가 지루할 수 있다는 점을 알고 있습니다. 하지만 권장하는 시간 내에 이 단계를 완료하면 더 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 5분 동안 벌브를 눌렀다 뗍니다.추출 피펫에 주변 공기를 통과시켜 핵산과 흡착제 층을 건조시킨 후, 추출 피펫 팁에 남아 있는 에탄올을 닦아냅니다. Kim wipe를 사용하여 10 millimolar tris 용액 250 microliters를 흡착제 위로 다섯 번 통과시켜 핵산을 회수합니다. tris 완충액은 PBS와 같은 다른 적절한 수성 용액으로 대체할 수 있습니다.결과 용액에는 추출된 핵산이 포함되어 있습니다. 단백질 추출을 먼저 수행하려면, 미리 준비해 둔 단백질 추출 버퍼에 샘플을 넣고 튜브를 뒤집어 섞습니다. 이 5 mL 샘플 중 약 2~3 mL를 새로운 추출 피펫의 흡착제 위로 통과시킵니다. 샘플 전체를 동일한 15 mL 원추형 튜브에 피펫으로 옮겨 담습니다. 이때 추출 피펫 목 부분의 흡착제가 유지되도록 주의하십시오.이 과정을 반복합니다. 샘플을 흡착제 위로 15회 통과시킵니다. 95% Ethanol 1 mL를 흡착제 층에 3회 통과시켜 흡착제와 결합된 단백질을 세척하고, 이때 에탄올은 원래의 튜브에 배출합니다. 이후 두 번째 95% ethanol 세척액 1 mL를 사용하여 3회 더 세척합니다.절차의 다음 단계는 흡착제를 다시 건조시키는 것입니다. 핵산과 마찬가지로, 단백질 회수는 흡착제를 더 오랜 시간 동안 건조했을 때 가장 잘 이루어집니다.추출 피펫 전체에 주변 공기가 통하도록 벌브를 5분 동안 눌렀다 떼기를 반복합니다. 단백질 흡착 베드를 건조시키기 위해 추출 피펫 팁에 남은 에탄올을 닦아냅니다. Kim wipe를 사용하여 250 µL의 PBS를 흡착제 위로 5회 통과시켜 단백질을 회수합니다.PBS 버퍼는 10 millimolar tris, pH 6.8과 같이 적절한 다른 수성 용액으로 대체할 수 있습니다. 결과 용액에는 시료의 단백질 함량이 포함됩니다. entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven strain E DL 9 33과 관련된 shiga toxin 유전자는 추출 피펫을 이용한 핵산 단백질 추출 과정을 통해 증폭되었습니다.시가 독소 유전자인 Shiga toxin one과 shiga toxin two는 PR 프로모터의 제어 하에 있는 온건한 lambda 유사 박테리오파지 및 결함 박테리오파지에서 발견됩니다. e coli의 SOS 반응 활성화는 프로파지의 유도 및 독소 생성을 유발합니다. 이 경우, mitomycin C에 의해 SOS 반응이 유도되었을 때 처리되지 않은 대조군과 비교하여 sugar toxin two 유전자의 증폭이 크게 증가합니다.이는 프로파지의 유도와 파지 게놈의 복제를 시사합니다. 비디오에 설명된 핵산-단백질 분리 실험에서 회수된 단백질은 면역 반응성을 보입니다. 분리된 단백질 분획을 rapid check e coli O 1 57 측방 유동 분석 스트립에 적용하였습니다.대조군은 Shiga toxin 유도 여부와 관계없이 E. coli O157을 보유한 모든 샘플에서 두 개의 붉은 밴드가 나타남으로써 양성 식별 결과를 보여줍니다. 또한, 추출 피펫을 사용하여 핵산과 단백질을 처리한 E. coli O157 보유 샘플에서도 양성 결과가 나타났습니다. 이러한 데이터는 각 샘플에서 분리된 단백질이 면역 활성을 가지고 있어 양성 반응을 유도했음을 보여줍니다.분리된 단백질은 6M gudina isothiocyanate로부터 분리된 BSA가 로딩된 kumasi 염색 8% Acrylamide 젤에서 묘사된 바와 같이 전기영동에 적합합니다. 추출, 피펫팅 및 관련 프로토콜을 사용하면, 분리된 단백질의 전기영동 이동도는 대조군 샘플의 이동도와 동일합니다. 숙달되면 이 기술을 20분 이내에 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청하신 후, 간단한 장치에서 단백질과 핵산을 분리하는 방법에 대해 명확히 이해하셨기를 바랍니다. 저희 영상을 시청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Isotachophoresis (ITP)는 독소 검출에서 샘플 준비에 이르기까지 다양한 애플 리케이션과 강력한 계면 분리 및 preconcentration 기술입니다. 분리와 작은 분자 및 세포 배양 lysate로부터 핵산 정화의 검출 : 우리는 ITP의 물리적 원리와 두 구체적인 예를 들어 응용 프로그램에이 기법을 적용하는 방법론을 검토합니다.

이온의 분리 및 핵산의 정화를위한 온칩 Isotachophoresis

출처: Dembowski, J. A., 외. 연관 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp. (2017). 이 비디오는 클릭 화학 및 자기 비드 정제를 사용하여 세포핵에서 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 과정을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨 수정 뉴클레오타이드를 이용한 바이러스 게놈 표지, 클릭 반응을 통한 비오틴화, 그리고 스트렙타비딘 코팅 자기 비드에의 결합 과정이 포함됩니다. 세척 및 열 용출 후, 정제된 복합체를 수집하고 급속 냉동하여 후속 분석을 위해 보관합니다. Dembowski, J. A., 외.연관된 바이러스 및 세포 단백질 식별을 위한 바이러스 DNA 정제. J. Vis. Exp.. (2017).이 영상은 클릭 화학과 자성 비드 정제를 이용하여 세포 핵으로부터 단백질-바이러스 DNA 복합체를 분리하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜에는 알킨-수식 뉴클레오타이드로 바이러스 게놈을 표지하고, 클릭 반응을 통해 비오틴화한...

바이러스 DNA-단백질 복합체로부터의 단백질 분리

TruTip은 다공성, 모 놀리 식 바인딩 행렬 피펫 팁에 삽입 그것에 간단한 핵산 추출 기술입니다. 따라서, 샘플 준비 형식은 대부분의 액체 취급 장비와 호환되며, 높은 처리량 임상 응용 및 샘플 유형에 여러 매체에 사용할 수 있습니다.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

우리는 16S rRNA의 유전자의 증폭 시퀀싱을 사용하여 세균 지역 사회의 특성에 대한 면봉에서 핵산을 추출하기위한 효율적이고 강력하고 비용 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 여러 종류의 시료에 대한 일반적인 처리 방법을 허용하고 하류 공정 분석들을 수용한다.

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

이 프로토콜의 목표는 구체적으로 태그와 관련 된 바이러스 성 게놈의 단백질의 특성에 대 한 감염 된 세포에서 바이러스 성 DNA를 선택적으로 격리입니다.

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

여기 우리는 이중 가닥 DNA 게놈으로 식물 바이러스를 식별 하는 새로운 접근 방식을 제시. 감염 된 잎에서 DNA와 RNA를 추출 하 고 다음-세대 시퀀싱을 수행 표준 방법을 사용 합니다. Bioinformatic 도구 contigs로 시퀀스를 조립 하 고 contigs 바이러스 게놈을 나타내는 식별 분류학 그룹에 게놈을 할당 합니다.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.

선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성

쿠매시 블리언트 블루 (CBB)의 polyacrylamide 젤의 G - 250로 단백질 얼룩에 대한 짧은 프로토콜은 CBB와 고전적인 얼룩 절차에서와 같이 유기 용제 또는 초산을 사용하지 않고도 설명되어 있습니다.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

배우세요 전기 없이 PCR 준비 핵산과 면역반응성 단백질을 분리하는 방법입니다. 고아닌티오시아네이트를 이용한 고상 추출 기법으로 현장 연구에 적합한 간편한 프로토콜을 익히세요.

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

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