전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

이 절차의 전반적인 목표는 전기나 실험실 기반 시설 없이 샘플에서 PCR 가능 상태의 핵산과 면역 반응성 단백질을 분리하는 것입니다. 핵산과 단백질의 분리는 샘플을 구아니딘 및 티오시아네이트와 혼합하여 샘플을 용해시킨 후, 혼합물을 추출 피펫 내의 흡착제로 통과시키는 것으로 시작됩니다. 흡착제를 통해 다섯 번 통과시킨 후, 마지막 다섯 번째 통과 후에 혼합물을 단백질 추출 버퍼에 넣고 면역 반응성 단백질을 분리하기 위해 그대로 둡니다.

다음으로, 흡착제에 95% ethanol을 통과시켜 흡착제와 결합된 핵산을 세척합니다. 이후 주변 공기를 흡착제에 5분 동안 여러 번 통과시켜 흡착제와 결합된 핵산을 건조합니다. PCR 준비용 핵산 분리의 마지막 단계는 250 µL의 tris 또는 이와 유사한 다른 수용액을 사용하여 흡착제로부터 핵산을 용출함으로써 면역 반응성 단백질을 분리하는 것입니다.

시료와 단백질 추출 버퍼를 혼합한 후, 두 번째 추출 피펫을 사용하여 혼합물을 흡착제에 15회 통과시킵니다. 다음 단계는 95%ethanol을 흡착제에 여러 번 통과시켜 결합된 단백질과 함께 흡착제를 세척하는 것입니다. 그 다음, 5분 동안 주변 공기를 흡착제에 통과시켜 흡착제와 결합된 단백질을 건조시킵니다.

프로토콜의 마지막 단계는 흡착제로부터 단백질을 용출하는 것입니다. 결과적으로, 이 절차에 사용된 추출 피펫을 통해 전기 장치 없이도 PCR 준비가 된 핵산과 면역 반응성 단백질을 분리할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Dave Pawlowski입니다.

저는 뉴욕주 버팔로에 위치한 Kubrick Incorporated의 수석 연구원으로, 오늘은 원심분리기나 볼텍스 믹서 또는 다른 부수적인 실험 장비 없이도 단백질과 핵산을 동시에 분리할 수 있는 기술에 대해 배워보겠습니다. 시료 용해 전, 시료가 액체 상태인지 확인하십시오. 식품이나 대변과 같이 시료가 고체 상태인 경우, 물이나 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline)와 같은 액체 배지에 시료를 현탁시켜야 합니다.

1.5 milliliter 튜브에 시료 500 microliters와 6 molar guine thiocyanate 500 microliters를 혼합합니다. 다음으로, 추출 피펫의 벌브를 눌러 내부의 공기를 배출합니다. 벌브를 천천히 팽창시켜 흡수성 물질 위로 1 milliliter 시료 전체를 추출 피펫 안으로 빨아들입니다.

추출 도구를 뒤집어 흡착 비드와 시료가 벌브(bulb) 안으로 흘러 들어가게 합니다. 벌브 안의 시료와 함께 흡착 비드를 분쇄합니다. 이때 시료가 추출 피펫 밖으로 배출되지 않도록 주의하십시오.

추출 피펫을 뒤집어 샘플을 원래의 1.5 milliliter 튜브에 배출합니다. 1 milliliter 샘플 전체를 추출 피펫으로 빨아들여 적절한 속도로 흡착제를 통과시킵니다. 흡착제가 추출 피펫의 목 부분에 유지되도록 주의하면서, 벌브를 눌러 샘플 전체를 1.5 milliliter 튜브로 배출합니다.

이 과정을 반복하여 샘플을 흡착제 위로 4회 더 통과시켜 총 5회를 수행합니다. 흡착제를 5회 통과시킨 후, 15 mL 원추형 튜브에 담긴 4 mL의 단백질 추출 버퍼 속으로 1 mL 샘플 전체를 배출합니다. 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 튜브를 닫고 나중에 사용할 때까지 보관합니다.

분리된 핵산을 세척하기 위해 95% ethanol 1 mL를 흡착제에 세 번 통과시키고, 사용한 ethanol은 원래의 튜브로 되돌립니다. 마지막 통과 후, 새로운 95% ethanol 1 mL를 사용하여 세척 과정을 세 번 더 반복합니다. 절차의 다음 단계는 흡착제를 건조시키는 것이며, 흡착제가 건조된 상태일 때 핵산 회수율이 가장 높습니다.

이 단계가 번거롭다는 점을 알고 있습니다. 하지만 권장되는 시간 내에 이 단계를 완료하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 5분 동안 벌브를 눌렀다 떼기를 반복하십시오.

추출 피펫 전체에 주변 공기를 통과시켜 핵산과 흡착제 층을 건조시킨 후, 추출 피펫 팁에 남은 잔류 에탄올을 닦아냅니다. Kim wipe를 사용하여 10 millimolar tris 250 microliters를 흡착제 위로 다섯 번 통과시켜 핵산을 회수합니다. tris 완충액은 PBS와 같은 다른 적절한 수성 용액으로 대체할 수 있습니다.

결과 용액에는 추출된 핵산이 포함되어 있습니다. 단백질 추출을 먼저 수행하려면, 미리 준비해 둔 단백질 추출 버퍼에 샘플을 넣고 튜브를 반전시켜 혼합하십시오. 이 5 mL 샘플 중 약 2~3 mL를 새 추출 피펫의 흡착제 위로 통과시킵니다. 흡착제가 추출 피펫의 목 부분에 유지되도록 주의하면서, 샘플 전체를 동일한 15 mL 원추형 튜브에 분주하십시오.

이 과정을 반복합니다. 시료를 흡착제 위로 15회 통과시킵니다. 95% Ethanol 1 mL를 흡착제 층에 세 번 통과시켜 흡착제와 결합된 단백질을 세척하며, 이때 에탄올은 원래의 튜브로 배출합니다. 95% ethanol 1 mL를 추가로 사용하여 세 번 더 세척합니다.

다음 단계는 흡착제를 다시 건조하는 것입니다. 핵산과 마찬가지로, 흡착제가 더 오랜 시간 동안 건조되었을 때 단백질 회수율이 가장 높습니다.

추출 피펫 전체에 주변 공기가 통하도록 벌브를 5분 동안 눌렀다 떼기를 반복합니다. 단백질 흡착제 층을 건조시키기 위해 추출 피펫 끝에 남은 에탄올을 닦아냅니다. 킴와이프(Kim wipe)를 사용하여 PBS 250 µL를 흡착제 위로 5회 통과시켜 단백질을 회수합니다.

PBS 버퍼는 10 millimolar tris, pH 6.8과 같이 적절한 다른 수용액으로 대체할 수 있습니다. 이렇게 얻은 용액은 시료의 단백질 함량을 포함합니다. 추출 피펫을 이용한 핵산 단백질 추출 절차를 통해 entero hemorrhagic e coli oh 1 5 7 H seven strain E DL 9 33과 관련된 shiga toxin 유전자를 증폭시켰습니다.

시가 독소 유전자인 Shiga toxin one과 shiga toxin two는 PR 프로모터의 제어 하에 온건성 lambda 유사 박테리오파지와 결함이 있는 박테리오파지에서 발견됩니다. e coli의 SOS 반응 활성화는 프로파지의 유도 및 독소 생성을 유발합니다. 이 경우, mitomycin C에 의해 SOS 반응이 유도되었을 때, 처리하지 않은 대조군과 비교하여 sugar toxin two 유전자의 증폭이 크게 증가합니다.

이는 프로파지 유도 및 파지 게놈 복제를 시사합니다. 비디오에 설명된 핵산 단백질 분리 실험에서 회수된 단백질은 면역 반응성을 보입니다. 분리된 단백질 분획을 Rapid Check E. coli O157 측방 유동 분석 스트립에 적용하였습니다.

대조군은 Shiga 독소 유도 여부와 관계없이 e coli oh 1 5 7을 보유한 모든 샘플에서 두 개의 붉은 밴드가 나타남으로써 양성 확인 결과를 보여줍니다. 또한, 추출 피펫을 사용하여 핵산과 단백질을 처리한 e coli oh 1 5 7 보유 샘플에서도 양성 결과가 나타났습니다. 이러한 데이터는 각 샘플에서 분리된 단백질이 면역 활성을 가지고 있어 양성 반응을 유도했음을 보여줍니다.

분리된 단백질은 6 M gudina isothiocyanate로 분리한 BSA를 로딩하여 kumasi로 염색한 8% Acrylamide 겔의 결과와 같이 전기영동에 적합합니다. 추출 방법, 피펫 사용 및 관련 프로토콜을 적용했을 때, 분리된 단백질의 전기영동 이동도는 대조군 샘플과 동일합니다. 숙달되면 이 기술을 20분 이내에 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청하신 후, 단순 장치에서 단백질과 핵산을 분리하는 방법에 대해 명확히 이해하셨을 것입니다. 저희 영상을 시청해 주셔서 감사합니다.