아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

이 절차의 목적은 A ICD라고도 하는 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인을 정제하고 원자력 현미경에 의한 A ICD의 열 응집 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 A ICD의 GST 융합을 발현함으로써 달성됩니다. 다음으로, G-S-T-A-I-C-D 단백질을 정제하여 트롬빈으로 절단하여 A ICD에서 GST를 분리하고 GST를 제거합니다.

그런 다음 A ICD의 열 응집이 유도됩니다. 마지막으로, A ICD 응집체는 원자력 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. 궁극적으로, A ICD가 생화학적 및 생물물리학적 분석에 충분한 양의 균질성으로 정제될 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

복잡한 크로마토그래피 단계가 필요한 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 순도가 높고 용해성이 높다는 것입니다. ICD는 표준 시약과 장비를 사용하여 벤치탑에서 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜에 의해 생성된 ICD는 추가적인 생화학적 및 생물물리학적 특성화에 적합합니다.

절차를 시연하는 것은 Amina ti입니다. 제 연구실의 전 박사후 연구원인 Andres Oberer 박사는 재조합 A PP 세포 내 도메인 또는 A ICD를 발현하기 위해 A ICD의 원자력 현미경 이미징을 수행하는 방법을 시연할 것입니다. pgx 41 벡터로 형질전환된 BL 21 세포로 시작하여 GST의 C 말단에 융합된 인간 A ICD를 단일 콜로니로 주입하고 LB 육수 10ml에 암피실린을 접종하고 다음 날 아침 세게 흔들면서 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

1리터 플라스크에 400ml의 LB 암피실린을 5ml의 하룻밤 배양액과 함께 배양합니다. 섭씨 37도에서 600나노미터의 광학 밀도가 0.4에서 0.6에 도달할 때까지 격렬하게 흔들면서 배양합니다. 이것은 일반적으로 G-S-T-A-I-C-D의 발현을 유도하는 데 2-2.5시간이 걸립니다.

0.4 밀리몰의 IPTG를 첨가하고 섭씨 37도에서 5시간 동안 격렬하게 흔들어 배양했습니다. 6, 000 시간 G에서 세포를 섭씨 4도의 15분 동안 원심분리하고 펠릿을 섭씨 영하 80도에 보관합니다. 얼음에 박테리아를 용해, 완충 및 던진 후 펠릿에 완충액 20ml를 추가하고 피펫으로 얼음 위에서 볼텍싱과 양이온의 조합을 철저히 사용합니다.

Reese는 박테리아 펠릿을 현탁시키고 Reese 현탁 박테리아 용해물을 사전 냉각 유화제 또는 프렌치 프레스를 통해 통과시킵니다. 30에, 000 PSI는 유화제를 통해서 lysate를 두번째 통과하고 전 냉각된 50 milliliter 관에 있는 lysate를 모읍니다. 30 분 동안 15의, 000 시간 G 및 4 섭씨 온도의 lysate를 원심 분리하십시오.

supinate를 분리하여 미리 냉각된 50ml 튜브로 옮깁니다. 글루타티온이 발생한 50% 슬러리 500마이크로리터를 첨가합니다. 샘플이 회전하는 동안 섭씨 4도에서 30분 동안 회전합니다.

배양 후 새로운 용출 완충액을 만드십시오. 용해물과 슬러리를 코스 필터가 있는 일회용 5인치 폴리스티렌 크로마토그래피 컬럼에 붓습니다. PBS 3밀리리터로 컬럼을 5회 세척합니다.

컬럼 바닥을 덮고 500마이크로리터의 실온 용리 완충액을 추가합니다. 컬럼 상단의 뚜껑을 덮고 실온에서 5분 동안 회전합니다. 이른 무게를 식힌 1.5ml 마이크로 쓰레기 튜브에 모으십시오.

용리를 두 번 더 반복합니다. 10, 000 분자량 커트오프 투석 막에 있는 용출액을 다음 날 4 섭씨 온도의 4개 리터 PBS에 있는 투석하십시오. 추가로 4리터의 PBS를 섭씨 4도에서 1시간 동안 투석합니다.

투석 카세트에서 단백질을 제거하고 단백질 정량 분석을 수행하여 G-S-T-A-I-C-D의 수율을 측정합니다. 400 밀리리터의 배양액에서 일반적인 정제는 20 밀리그램 이상의 정제 단백질의 수율을 얻을 수 있으며, 농도는 밀리리터당 10-20 밀리그램입니다. 단백질을 200 마이크로 리터로 분취하고 분취 및 섭씨 영하 80도의 동결

GST 해동에서 A ICD를 해방하기 위하여는, 순화된 G-S-T-A-I-C-D의 200 마이크로리터 및 트롬빈의 마이크로리터 당 1 단위의 20 마이크로 방출을 다음 날 37 섭씨 온도에 밤새 배양하고, 20, 000 시간 G에 원심 분리에 의하여 어떤 응집한 물자든지 4 섭씨 온도의 30 분 동안 맑게 하십시오. SUPINATE를 미리 냉각된 마이크로 튜브에 옮겨 GST와 트롬빈을 제거합니다. 50 마이크로 리터의 50 % 글루타티온 아로 슬러리와 50 마이크로 리터, 50 % p 및 wino zaine 아로 슬러리를 각각 추가합니다.

실온에서 5분 동안 교대로 배양합니다. 원심분리기를 짧게 하여 아그로 비드를 침전시키고 supinate를 새 튜브로 제거합니다. 글루타티온으로 GST를 4번 더 추출합니다.

Aros는 정제된 A ICD 5마이크로리터에 대해 단백질 정량 분석을 수행합니다. 400 밀리리터 배양의 일반적인 수율은 밀리리터당 0.2 - 0.5 밀리그램의 농도에서 50 - 100 마이크로그램입니다. PBS에서 갓 제조된 A ICD를 밀리리터당 0.1밀리그램의 농도로 희석한 후, 가열된 셰이커에서 48시간 동안 섭씨 43도, 800RPM에서 샘플을 배양하여 열 응집을 유도했습니다.

샘플을 탈이온수로 20배 희석하고 갓 절단한 물에 2마이크로리터를 더럽힙니다. 운모는 하룻밤 동안 건조제에서 샘플을 건조시켜 응집된 A ICD를 시각화하고, 금괴된 태핑 모드에서 원자력 현미경을 사용합니다. 공칭 팁 반경이 2나노미터인 Micro sharpp 질화물 캔틸레버.

이미징 중 일반적인 태핑 진폭, 캔틸레버의 공진 주파수에서 10-20나노미터. G-S-T-A-I-C-D의 표현 및 상대적 농축이 여기에 나와 있습니다. 용해 후 대부분의 융합 단백질은 용해성 분획에 존재하므로 봉입체에서 추출할 필요가 없습니다.

글루타티온 발생 컬럼에서 암시 된 물질은 순도 95 % 이상입니다. 여기에 나타난 제제에서, 컬럼에서 암시된 단백질의 농도는 밀리리터당 14.5mg이었고, 수율은 22mg이었다. 하룻밤 사이에 200마이크로리터의 트롬빈을 20단위의 트롬빈으로 절단한 결과, 융합 단백질이 거의 100% 절단되었습니다.

사용되는 트롬빈의 양은 kumasi가 감지할 수 없을 정도로 적습니다. 파란색 염색, 트롬빈 제거 및 GST로 인해 일부 재료 손실이 발생했습니다. 그러나, 이 준비에서 밀리리터당 0.35밀리그램의 농도에서 70마이크로그램의 A ICD를 수율로 90% 이상 순수했습니다.

FM에 의해 이미지화된 ICD 응집체는 일반적으로 스테로이드 비정질이며 크기는 50에서 100나노미터입니다. 응집된 물질은 chaperone UBI Quillin 1의 등몰량이 응집 반응에 추가될 때 검출할 수 없습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 EICD를 정제하여 응집체 및 이미지 응집체 베이 A-F-M-E-I-C-D를 이미징하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술로 정제된 것은 광 산란 및 필터 트랩 분석과 같은 다른 방법에 적용하여 EACD 응집에 대한 분자 샤페론의 영향에 관한 질문에 답할 수 있습니다.