Name: 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 학습하세요 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인(AICD)의 대규모 정화 및 열적 집계 유도 방법을 원자력 현미경으로 특성화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 알츠하이머병 연구에 필수적인 생화학 및 구조 생물학 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 cDNA APP에 박​​사 후이 청 (의학 베일러 대학)을 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), 바이오 메디컬 연구에 대한 존 씰리 (Sealy) 브랜드의 기념 기금 (AFO), 그리고 장 C.와 윌리엄 D. 윌리스, 신경 과학 연구 기금의 지원을받는 한 (ESS). JMB는 병진 연구 학술 프로그램의 학자와 텍사스 의료 지점 클로드 E. 페퍼 이전 미국인 독립 센터의 대학의 구성원 (NIH 교부금을 각각 UL1RR029876 및 P30-AG-024832에 의해 지원)입니다.

<html> 1. 재조합 APP 세포 도메인 (AICD)의 표현 <ol><li> 변환 E. 대장균은 벡터 pGEX-4T-1 (GE 헬스 케어)에 복제 인간 AICD (잔류 APP의 649-695, neuronal 이소 형 번호)로 BL21을 변형. 이 벡터는 (GST) 글루타티온-S-transferase의 융합 단백질의 C-말단 잔기로 AICD 표현. 이 벡터는 또한 GST 잔기의 제거를 촉진하기 트롬빈 절단 순서를 인코딩합니다. pGEX-4T-1에 AICD 복제에 대한 자세한 내용은 이전 발행 넷에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 하나의 식민지에서 암피실린 (100 μg / ML)와 LB의 국물 10 ML의 예방과 활발한 흔들림으로 37 ° C에서 하루 아침에 품다. </li><li> 다음날 아침, 밤 문화의 5 ML과 함께 한 리터 플라스크에 400 ML의 LB / 암피실린의 예방. </li><li> 활발한 600 나노 미터에서 광학 밀도까지 흔들어 0.6-0.4에 도달과 함께 37 ° C에서 알을 품다. 이 일반적으로 2-2.5 시간이 소요됩니다. </li></ol>이 시점에서 내용 &quot;&gt;는이 SDS-PAGE (그림 1A, B를 참조)에 의해 정화를 수행 할 수있는 작은 샘플을 (~ 10 μl)을 가져하는 것이 바람직 할 수 있습니다. 각 후속 정화 단계는 분석을 위해 제거 작은 나누어지는이 있어야합니다 SDS-PAGE에 의해. <ol start="5"><li> 이소 프로필 - 베타-D-thiogalactopyranoside (IPTG)의 0.4 MM을 추가하여 GST-AICD의 표현을 유도. 활발한 5 시간에 진동과 함께 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 4에 15 분에 6,000 XG에서 세포를 원심 분리기 ° C. 셀 펠렛은 절차의이 시점에서 몇 달 동안 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. GST-AICD의 정화 <ol><li> 다음과 같이 50 ML의 용해 버퍼를 준비 : 1 ㎜ dithiothreitol, 1mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 0.1 % 트리톤 - X100, 1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 플루오르 화 (PMSF), 전체 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈 응용 과학), 그리고 인산은 염분 버퍼. 얼음에 진정. </li><li> 에 박테리아 펠렛을 (이전 얼어 붙은 경우) 해동얼음. </li></ol> 이 시점에서, 모든 단계 ° C가 proteolysis를 제한 할 4에서 수행하는 것이 중요합니다. 모든 튜브, 버퍼 및 기타 시약은 사전 차가운해야합니다. 프랑스 언론 용해를위한 유화제를 사용하는 경우,이 역시 사전 차가운해야합니다. <ol start="3"><li> 철저하게 용해 버퍼의 20 ML에있는 박테리아 펠렛을 resuspend. 얼음 10 ML의 피펫과 vortexing과 분쇄의 조합은 펠릿의 전체 resuspension을 보장합니다. </li><li> 4 ° C 30,000에서 PSI에 대한 사전 차가운 유화제를 통해 resuspended 박테리아 세포 (예를 들어, Avestin EmulsiFlex-C3) 또는 프랑스어 압력 셀을 전달합니다. 유화제 두 번째 시간을 lysate를 전달합니다. 미리 차가운 50 ML 튜브에 lysate를 수집합니다. </li></ol> 이 두 악기의 가장 큰 장점은이 샘플의 가열을 최소화 할 것입니다. sonication의 일반적으로 사용되는 기술은 sonication 프로브의 끝에서 상당한 열을 생성하고재조합 단백질의 집계 될 수 있습니다. <ol start="5"><li> 30 분에 15,000 XG에서 lysate를 원심 분리기. 별도의 사전 차가운 50 ML 튜브에 표면에 뜨는을 유지. </li><li> 글루타티온 - 아가로 오스 (시그마 - 알드리치)의 50 % 슬러리 500 μl를 추가합니다. 4 ° C.에 30 분을 위해 회전 50 ㎜ 트리스 7.8, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.5 MM dithiothreitol, 10 MM 감소 글루타티온 : 예제는 회전하는 동안, 신선한 용출 버퍼를합니다. </li></ol> 실온에서 수행되는 프로토콜의 유일한 단계는 용출 단계입니다. 따라서, 용출 버퍼는 실온에서 보관됩니다. 용출 버퍼는 신선한 준비해야합니다. <ol start="7"><li> 조립 (90-130 μm) 필터 (에버그린 과학). 인산염의 3 ML로 열 다섯 번 씻으과 일회용 5 &quot;폴리스티렌 크로마토 그래피 칼럼으로 lysate와 슬러리를 따르다가 염분 버퍼. </li><li> 열의 하단에 캡과 룸 온도 용출 버퍼 500 μl를 추가합니다. 상단을 캡열 및 상온에서 5 분 동안 회전 할 수 있습니다. 차가운 1.5 ML의 microfuge 관에 eluate를 수집합니다. 용출 두 배 (1.5 ML 총 eluate)를 반복합니다. </li><li> 인산의 4리터에서 10,000 분자량의 컷오프 투석 막 (예를 들어, 열 과학 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트)에서 eluate을 Dialyze는 4 ° C.에서 하루 아침에 염분 버퍼 인산염의 추가 4리터에 대한 Dialyze은 4에서 염분 버퍼 ° C 1 시간 다음 날. </li><li> 투석 카세트에서 단백질을 제거하고 GST-AICD의 수율을 결정하는 단백질 정량화 분석을 수행합니다. 문화 400 ML의 전형적인 정화가 10-20 MG / ML의 농도에서 단백질을 정제의&gt; 20 밀리그램의 수율이 높아집니다. -80 200 μl aliquots 및 동결로 나누어지는이 단백질 ° C. </li></ol> 3. 트롬빈의 GST-AICD의 절단 및 AICD의 정화 <ol><li> 해동 200 정화 GST-AICD의 μl 1 U / μl thromb의 20 μl를 추가합니다인치 37 박 품다 ° C. </li></ol> 트롬빈의 품질과 순도는 제조업체들 상당히 다양하고, 오염의 중요한 소스가 될 수 있습니다. 우리는 GE 헬스 케어 (시약의 표 참조) 트롬빈을 사용합니다. 박 부화 후, 융합 단백질의&gt; 95 %는 (그림 1B) 흘리고해야합니다. <ol start="2"><li> 트롬빈과 밤 절단 후 해방 AICD의 일부가 집계를 받았습니다 및 솔루션은 흐린 나타날 수 가능성이 높습니다. 4에 30 분에 20,000 XG에서 원심 분리에 의해 집계 된 자료를 삭제 ° C. 미리 차가운 microfuge 관에 표면에 뜨는을 제거합니다. </li><li> 각각 GST 및 트롬빈을 제거을 50 % 글루타티온 - 아가로 오스 슬러리 50 μl 50% P-aminobenzamidine - 아가로 오스 슬러리의 50 μl를 추가합니다. 상온에서 5 분 동안 회전 품다. </li><li> 침전 아가로 오스 비즈를에 짧게 원심 분리기, 그리고 신선한 튜브로 표면에 뜨는을 제거합니다. t의 압축을 풉니 다그는 글루타티온 - 아가로 오스와 GST 네 개를 더 번. P-aminobenzamidine - 아가로 오스와 단일 추출 트롬빈의 20 U를 제거 할 수있는 것입니다. </li><li> 정화의 AICD의 5 μl에 단백질 quantitation 분석을 수행합니다. 400 ML 문화의 일반적인 수율은 0.2-0.5 MG / ML의 농도에 50-100 μg 있습니다. 높은 수율은 GST-AICD의 큰 볼륨을 cleaving에 의해 가능합니다. </li></ol> 정화 AICD는 생화학 / biophysical 특성화에 대한 새로운 준비를해야합니다. 사용하지 않는 자료는 폐기해야합니다. 이 샘플을 lyophilizing와 버퍼 6 작은 볼륨으로 resuspending하여 AICD을 집중하는 것도 가능합니다. AICD을 검출하는 것은 blotting (예 : 필터 트랩 또는 도트 얼룩 분석 후) 막에 대한 항원 검색이 Pimplikar과 Suryanarayana 12 설명으로 수행해야합니다 필요합니다. 4. 원자 힘 현미경을위한 AICD 집적 (AFM) <ol><li> 희석은 갓 P에 AICD 준비hosphate는 0.1 밀리그램 / 15 μl의 최종 볼륨의 ML의 농도에 염분 버퍼. 이 시점에서, 다양한 화합물 및 / 또는 단백질들은 AICD 집계를 억제 여부를 결정하기 위해 추가 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 ubiquilin-1의 몰 농도가 검정 4 AICD의 집계를 방지하는 것으로 나타났습니다. </li></ol> 또한 이러한 필터 트랩 assays와 빛의 분산 4와 같은 생화학 실험에 대한 통합 큰 반응 볼륨 할 수 있습니다. 우리는 성공은 1 μM의 낮은 농도로 희석 AICD 400 μl로 크게 반응 혼합물에 필터 트랩 assays을 수행 있었다. <ol start="2"><li> 48 시간에 Eppendorf Thermomixer 800 rpm으로 흔들어와 43 ° C에서 샘플을 잠복기에 의해 열 집계를 유도. 이 온도는 모델 보호자 기판 구연산의 synthase 4,13의 열 집계를 검토 보호자 assays에 따라 선정되었습니다. </li></ol><p class="jove_content"&gt; 열 집합은 분자간 집계 형성에 결과가 아닌 기본 구조 (풍부한 일반적으로 베타 시트입니다)에 네이티브에서 단백질의 구조 전환을 유도 할 수있는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 열 집합은 부적절한 분자간 상호 작용 (및 따라서 열 집계를 병신의 예방)을 형성 소수성 세그먼트를 보호 분자 보호자의 기능을 검사하는 데 사용됩니다. <ol start="3"><li> 갓 흘리고 운모에 탈 이온수와 장소 2 μl에 20 배 샘플을 희석. 밤새 dessicator에서 샘플을 말린다. 그것은 경험적으로 이미지를위한 최적의 희석을 확인할 필요가있을 것이고, 따라서 10 일부터 이르기까지 여러 dilutions - 100 배에는 신중한 것입니다. </li><li> 모드 14 도청에 AFM 운영을 사용하여 집계 AICD를 표시합니다. 사용 cantilevers은 2 nm의 공칭 팁 반경 골드 코팅 마이크로 날카로운 질화물 레버 (MSNL, Bruker)입니다. 일반적인 도청 진폭 두어ING 영상은 cantilevers (30-50 kHz에서)의 공명 주파수에서 10-20 nm의 수 있습니다. </li></ol> 우리는 서로 다른 단백질을 합산의 이미지 품질 및 대비는 가해진 힘과 실험 기간에 의존 것으로 나타났습니다. 팁이 샘플 섭동을 최소화하기 위해, 우리는 95 % 이상 세트 포인트 비율을 유지하고 5-10 분 각 샘플의 검사를 제한하여 상대적으로 낮은 적용 힘을 유지하고있다. 이미지 처리가 WSxM 소프트웨어 (Nanotec)로 수행되었습니다. 표준 영상 처리는 비행기 빼기와 납작로 구성. 우리 실험실 사용 &quot;집에서 내장&quot;상업 스캐닝 프로브 현미경 제어 시스템 (Nanotec)에 인터페이스 AFM 15.주세요 5. 대표 결과 표현과 GST-AICD의 상대적 농축은 그림 1A에 표시됩니다. 용해 후, 융합 단백질의 대부분은 수용성 분수에 존재하며, 따라서 inclusi에서 추출몸에 필요하지 않습니다. 글루타티온 아가로 오스 칼럼에서 용출 자료&gt; 95 % 순수입니다. 그림 1에 표시된 준비에 열로부터 용출 단백질의 농도는 14.5 밀리그램 / ML이었고, 수율은 22 밀리그램 (400 ML의 시작 문화에서)이었다. 트롬빈 20 U과 밤이 준비 200 μl의 절단은 융합 단백질 (그림 1B)의 거의 100 % 절단하게되었습니다. ( &quot;흘리고&quot;레인, 그림 1b 참조) Coomassie 푸른 얼룩에 의해 감지 될하지로 사용 트롬빈의 양만큼 낮습니다. 트롬빈과 GST의 제거하지만이 0.35 밀리그램 / ML의 농도에 AICD의 70 μg의 사립의 수율과&gt; 90% 순수이었고, 재료의 일부 손실되었습니다. 그림 1C는 AICD의 집합에 대한 플로우 차트를 보여줍니다 및 이후 분석. AFM으로 이미징 AICD 집계는 일반적으로 회전 타원체 / 비정질이며, 크기 범위 50-100 나노 미터 (그림 1D, F)에서. 집계자료 자야 ubiquilin-1의 몰 금액이 집계 반응 (그림 1E) 4에 추가 될 때 감지되지 않습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" /> 1 그림. 정화 및 AICD의 집합이 있습니다. 샘플 A) Coomassie 푸른 얼룩 정화 과정의 각 단계에서 수집. uninduced 및 유도 샘플의 경우, 총 세균의 20 μl은 젤에서 실행되었습니다. 표면에 뜨는 분수를 들어, lysate의 5 μl가 (20 ML의 총 볼륨에서) 젤에서 실행되었습니다. 펠렛 분수를 들어, 펠릿이 용해 버퍼의 20 ML에 resuspended되었고,이 자료의 5​​ μl은 4시 30 분에 물 목욕 sonicator에 sonicated되었습니다 ° C 전에 젤에로드합니다. flowthrough를 들어, 5 μl은 젤에서 실행되었습니다. 젤에로드 eluate의 양이 표시됩니다. uncleaved 흘리고 GST-AICD (2 μl)와 1, 5 및 m의 B) Coomassie 푸른 스테인드 젤U; 리터 정화가 AICD. AICD 정화, 집계 및 분석 C) 흐름도. 의 D, E) 대표 AFM 이미지 열 분자 보호자 ubiquilin-1의 부재 (D)와 존재 (E)에 AICD 집계됩니다. AICD 집계의 크기 분포 F) 히스토그램.

<ol><li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretases%3A+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li>
<li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+reports%22%5BJournal%5D)">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li>
<li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FE65+proteins+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li>
<li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li>
<li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li>
<li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li>
<li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li>
<li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li>
<li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li>
<li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li>
<li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866(2010).</li>
<li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li>
<li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li>
<li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li>
<li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-simultaneous+imaging%2Fpulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707(2007).</li>
<li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction%2C+purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li>
<li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1%2C+a+lipid+raft+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li>
<li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport%2C+amyloid+precursor+protein%2C+kinesin-1%2C+and+the+processing+apparatus%3A+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li>
<li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li>
<li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+under+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li>
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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜에서 우리는, 구조 biophysical 및 생화학 분석을위한 매우 순수 AICD를위한 절차를 설명합니다. 이 절차는 복잡한 크로마토 그래피 장비를 필요로하기 때문에 대부분의 실험실에 액세스 할 수 없습니다. 다른 그룹은 생화학 / 구조 분석을위한 GST-AICD 17-19 포함한 AICD 5-7,16을 정화하고 있습니다. 이전 프로토콜 단점은 가난한 AICD 16 용해도, 이상적인 순도 17 이하 및 크기 제외 16 요구 사항을 포함하거나 상에게 크로마토 그래피 6,20을 뒤집. 따라서, 여기에 설명 된 프로토콜은 크게 AICD의 체외 연구에 용이합니다. 우리는 또한 AFM에 의해 AICD와 감지의 열 집계하는 방법을 설명합니다. 점점 더 아밀로이드 필드 21에 사용했지만, AFM은 고도로 전문화 된 기술입니다. 이러한 빛의 분산, 침강 및 필터 트랩 assays...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> pGEX-4T-1 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 28-9545-49 </td><td></td></tr><tr><td> 트롬빈 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> 27-0846-01 </td><td></td></tr><tr><td> 암피실린 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP1760 </td><td></td></tr><tr><td> 브래드 포드 단백질 분석 시약 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 500-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Coomassie 블루 </td><td> 바이오 RAD </td><td> 161-0786 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG (이소 프로필 - 베타-D thiogalactopyranoside) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> I6758 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타티온 - 아가로 오스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> G4510 </td><td></td></tr><tR&gt; <td> P-aminobenzamidine - 아가로 오스 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A7155 </td><td></td></tr><tr><td> 전체 프로테아제 억제제 칵테일 </td><td> 로슈 </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer 투석 카세트 </td><td> 열 과학 </td><td> 66,380 </td><td></td></tr><tr><td> 크로마토 그래피 칼럼 </td><td> 상록 과학 </td><td> 208-3367-050 </td><td></td></tr><tr><td> 유화제 </td><td> Avestin, Inc의 </td><td> EmulsiFlex-C3 </td><td> 추천 </td></tr><tr><td> Eppendorf Thermomixer </td><td> Eppendorf </td><td> 022670107 </td><td></td></tr><tr><td> 운모 디스크 </td><td> 테드 펠라 </td><td> 50-12 </td><td></td></tr><tr><td> AFM의 cantilevers </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td><td></td></tr><tr><td> WSxM 소프트웨어 </td><td> Nanotec </td><td> N / A </td><td> 금EE 다운로드 </td></tr></tbody></table>

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 알츠하이머 병 (AD)의 pathogenesis과 관련된 유형 I의 transmembrane 단백질입니다. APP는 대형 세포 도메인과 APP 세포 도메인 (AICD)이라고한다 짧은 cytosolic 도메인이 특징입니다. 분비 경로를 통해 성숙하는 동안, APP는 α, β, 그리고 γ-secretases 일이라고한다 프로테아제에 의해 흘리고 할 수 있습니다. β와 γ-secretases와 APP 연속 proteolytic 절단은 작은 proteolytic의 펩타이드, 칭했다 Aβ, amyloidogenic하고 치매 액자의 핵심 구성의 생산에 연결됩니다. AICD은 secretase 처리 후도 막에서 해방이며, Fe65와 Tip60와의 상호 작용을 통해 여러 대상 유전자 2,3의 전사 조절에 참여하는 핵으로 이동시키다 수 있습니다. AICD 관련된 단백질 단백질 상호 작용은 트래픽 관리, 처리, 홀로 APP와 C-termin의 세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다알 조각. 우리는 최근 AICD는 AD-연루 분자 보호자 ubiquilin-14에 의해 억제되어 체외에서 집계,이 처리 할 수있는 것으로 나타났습니다. Fe65 7 구속 할 때 다음 결과에 의거하여 AICD는 소수성 도메인을 노출하고 본질적으로 체외 5,6에 섞여 있으며, 그러나 그것은 안정적인 보조 구조를 얻습니다. 우리는 ubiquilin-1 체외에서, 4 그대로 셀의 집계를 방지 AICD의 부적절한 상호 및 분자 상호 작용을 방지 것을 제안했습니다. 대부분의 연구는 AD의 pathogenesis에 APP의 역할에 초점을하지만,이 과정에서 AICD의 역할은 확실하지 않습니다. AICD의 표현은 경로에게 9 신호 변조하는 apoptosis 8 유도하고, 10 신호 칼슘을 조절하는 표시되었습니다. 유전자 변형 마우스 모델에서 AICD와 Fe65 이상의 표현은 병리학 11처럼 알츠하이머을 유도하고, 최근 AICD는 브라에서 발견되었습니다적절한 항원 검색 기술 12를 사용할 때 서쪽이 blotting에 의해 lysates 인치 AICD의, 구조 생화학 및 biophysical 연구를 촉진하기 위해, 우리는 매우 순수 AICD 단백질의 recombinantly 많은 양을 생산 할 수있는 절차를 개발했습니다. 우리는 더 원자 힘 현미경에 의한 AICD 및 분석의 체외 열 집계에를 유도하는 방법을 설명합니다. 설명 방법, 생화학 biophysical 및 구조 AICD의 특성화 및 AICD 집계에 분자 보호자의 효과에 유용합니다.

APP 세포 도메인 (AICD)의 대규모 정화하기위한 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 또한 유도하는 방법을 설명합니다<em&gt; 체외에서</em원자 힘 현미경으로&gt; AICD 집합 및 시각화. 설명 방법은 생화학 / 구조 AICD의 특성 및 집계에 대한 분자 보호자의 효과에 유용합니다.

아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, APP)은 알츠하이머병(AD)의 병인과 관련된 제1형 transmembrane 단백질입니다. APP는 ...으로 특징지어집니다.

이 절차의 목적은 A ICD로 알려진 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인을 정제하고, 원자 힘 현미경을 이용한 A ICD의 열 응집 및 특성 분석 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이는 먼저 박테리아에서 A ICD의 A GST 융합 단백질을 발현시킴으로써 수행됩니다. 다음으로 G-S-T-A-I-C-D 단백질을 정제한 후 트롬빈으로 절단하여 GST를 A ICD로부터 분리하고 GST를 제거합니다.그 후 A ICD의 열 응집을 유도합니다. 마지막으로, 원자 힘 현미경을 사용하여 A ICD 응집체를 이미지화합니다. 최종적으로, 생화학 및 생물물리학적 분석에 충분한 양의 A ICD를 균질하게 정제할 수 있음을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.복잡한 크로마토그래피 단계가 필요한 기존 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 고순도의 가용성 ICD를 표준 시약과 장비를 사용하여 벤치탑에서 분리할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜로 생산된 ICD는 추가적인 생화학적 및 생물물리학적 특성 분석에 적합합니다.시연은 Amina ti가 진행하겠습니다. 본 연구실의 이전 박사후 연구원인 Dr.Andres Oberer가 A ICD의 원자 힘 현미경(atomic force microscopy) 이미징 수행 방법을 시연할 것입니다. 재조합 A PP 세포내 도메인 또는 A ICD를 발현시키기 위해, GST의 C-말단에 인간 A ICD가 융합된 pgx 41 벡터로 형질전환된 BL 21 세포로 시작하십시오. 단일 콜로니를 사용하여 ampicillin이 포함된 LB 배지 10 milliliters에 접종한 후, 37 °C에서 격렬하게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오.1리터 플라스크에 400 milliliters의 LB ampicillin과 5 milliliters의 하룻밤 배양액을 넣고 배양합니다. 600 nanometers에서의 흡광도가 0.4에서 0.6에 도달할 때까지 37 degrees Celsius에서 강하게 흔들어 배양합니다. G-S-T-A-I-C-D의 발현을 유도하는 데 보통 2에서 2.5시간이 소요됩니다.0.4 mM의 IPTG를 첨가하고 37 °C에서 강하게 흔들어주며 5시간 동안 배양합니다. 4 °C에서 6,000 ×g로 15분 동안 세포를 원심분리하고 펠렛을 -80 °C에 보관합니다. 용해 버퍼를 준비하여 얼음에 둔 후, 펠렛에 20 mL의 버퍼를 첨가하고 파이펫을 사용하여 얼음 위에서 볼텍싱과 교반을 병행하여 충분히 혼합합니다.재현탁된 세균 펠릿을 미리 냉각된 유화기 또는 프렌치 프레스(French press)에 통과시킵니다. 30,000 PSI에서 용해물을 유화기에 다시 한 번 통과시키고, 미리 냉각된 50 milliliter 튜브에 용해물을 수집합니다. 용해물을 15,000 ×g, 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다.상층액을 분리하여 미리 냉각시킨 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 50% glutathione agarose 슬러리 500 microliters를 첨가합니다. 샘플을 회전시키면서 4 °C에서 30분 동안 회전 혼합합니다.배양 후에 신선한 용출 버퍼를 제조합니다. 용해물과 슬러리를 거친 필터가 장착된 5인치 일회용 폴리스티렌 크로마토그래피 컬럼에 붓습니다. 3mL의 PBS로 컬럼을 5회 세척합니다.컬럼 하단을 캡으로 닫고 상온의 용출 버퍼 500 µL를 추가합니다. 컬럼 상단을 캡으로 닫고 상온에서 5분 동안 회전시킵니다. 초기 용출액을 냉각된 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.용출 과정을 두 번 더 반복합니다. 용출액을 10,000 분자량 컷오프 투석막에 넣고 4 °C의 PBS 4L에서 하룻밤 동안 투석한 후, 다음 날 4 °C의 PBS 4L로 1시간 동안 추가 투석합니다.투석 카세트에서 단백질을 꺼내고 단백질 정량 분석을 수행하여 G-S-T-A-I-C-D의 수율을 결정합니다. 400 milliliters의 배양액을 이용한 전형적인 정제 과정에서는 20 milligrams 이상의 정제 단백질 수율과 10 to 20 milligrams per milliliter의 농도를 얻게 됩니다. 단백질을 200 microliter씩 분주하여 -80 °C에서 냉동 보관하십시오.GST 융합체로부터 A ICD를 분리하기 위해, 정제된 G-S-T-A-I-C-D 200 µL에 1 U/µL 농도의 thrombin 20 µL를 첨가하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 4 °C에서 20,000 ×g로 30분간 원심분리하여 응집된 물질을 제거합니다. GST와 thrombin을 제거하기 위해 상층액을 미리 냉각시킨 마이크로 튜브로 옮깁니다. 여기에 50% glutathione aro slurry 50 µL와 50% p and wino zaine aro slurry 50 µL를 각각 첨가합니다.실온에서 5분 동안 회전시키며 배양합니다. 짧게 원심분리하여 agro beads를 침전시키고, 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 글루타치온을 사용하여 GST를 4회 더 추출합니다.정제된 A ICD 5 µL에 대해 단백질 정량 분석을 수행합니다. 400 mL 배양액에서의 일반적인 수율은 0.2~0.5 mg/mL 농도에서 50~100 µg입니다. 갓 준비한 A ICD를 PBS로 희석하여 0.1 mg/mL 농도로 만든 후, 가열 쉐이커에서 43 °C, 800 RPM으로 48시간 동안 샘플을 배양하여 열 응집을 유도했습니다.탈이온수로 샘플을 20배 희석한 후, 새로 절단된 Mica 위에 2 µL를 점적합니다. 응집된 Aβ ICD를 시각화하기 위해 데시케이터에서 샘플을 하룻밤 동안 건조시킵니다. 공칭 팁 반경이 2 nm인 금 코팅 질화규소 캔틸레버를 사용하여 태핑 모드의 원자힘 현미경으로 관찰합니다.이미징 중 일반적인 태핑 진폭은 캔틸레버의 공진 주파수에서 10 to 20 nanometers입니다. G-S-T-A-I-C-D의 발현 및 상대적 농축도가 여기에 표시되어 있습니다. 용해 후 융합 단백질의 대부분이 수용성 분획에 존재하므로, 봉입체로부터의 추출은 필요하지 않습니다.글루타치온 어피니티 컬럼에서 용출된 물질의 순도는 95% 이상이었습니다. 본 실험에 사용된 준비물에서 컬럼으로부터 용출된 단백질의 농도는 14.5 mg/mL였으며, 수득량은 22 mg이었습니다. 이 준비물 200 µL를 20 units의 thrombin으로 하룻밤 동안 처리한 결과, 융합 단백질의 거의 100%가 절단되었습니다.사용된 thrombin의 양은 kumasi로 검출되지 않을 정도로 적습니다. Blue 염색과 thrombin 및 GST 제거 과정에서 일부 물질 손실이 발생했습니다. 그럼에도 불구하고 순도는 90% 이상이었으며, 이번 조제에서 0.35 mg/mL 농도로 70 µg의 A ICD를 얻었습니다.FM으로 촬영한 EICD 응집체는 일반적으로 스테로이드 무정형이며 크기는 50에서 100 nm 범위입니다. 샤페론인 UBI Quillin 1을 등몰량으로 응집 반응에 첨가하면 응집된 물질이 검출되지 않습니다. 이 영상을 시청한 후에는 EICD를 정제하고 응집을 유도하며, AFM으로 EICD 응집체를 촬영하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술로 정제된 시료는 광산란 및 필터 트랩 분석과 같은 다른 방법에 적용하여, 분자 샤페론이 EACD 응집에 미치는 영향에 관한 의문점을 해결하는 데 활용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

SDD - 나이가 세포에서 고분자와 같은 아밀로이드의 감지 및 특성화를위한 유용한 기법입니다. 여기 우리는 대규모 응용 프로그램에이 기술을 의무하게 적응을 보여줍니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을...

Hsp104의 정화, 단백질 Disaggregase

단백질은 네이티브 구조를 채택하거나 불용성 아밀로이드로 잘못 접힐 수 있습니다. 잘못 접히는 경로를 선호하는 조건은 다양한 유형의 아밀로이드 섬유의 형성으로 이어집니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 in vitro에서 네이티브 단백질을 아밀로이드로 빠르게 전환할 수 있습니다.

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성<em&gt; 체외</em

세포 표면 단백질의 수송이 비교적 용이하게 검토되고 있지만, 세포 내 단백질의 매매를 시각화하는 것은 더욱 어렵다. 여기서는 광활성 GFP를 통합 구조를 사용하고 정확하게 하류 구획 골지체에서 아밀로이드 전구체 단백질을 따라 그 틈새를 수행하는 방법을 보여준다.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

대장균에서 봉입체로 발현되는 재조합 Shadoo 단백질의 정제와 정제된 Shadoo를 아밀로이드 구조로 섬유화하는 프로토콜을 위한 2단계 크로마토그래피 방법이 설명되어 있습니다.

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

여기에서 우리는 올리고머 형성이 가능한 고순도 아밀로이드 베타 42(Aβ42) 및 아밀로이드 베타 40(Aβ40) 펩타이드를 생성하는 맞춤형 HPLC 정제 프로토콜을 보고합니다. 아밀로이드 베타는 알츠하이머병과 관련된 응집이 잘 되는 소수성 펩타이드입니다. 펩타이드의 아밀로이드 생성 특성은 정제를 어렵게 만듭니다.

맞춤형 HPLC 정화 프로토콜 즉, 올리고머 형성 할 수있는 수율 고순도 아밀로이드 베타 42과 아밀로이드 베타 펩티드 (40),

여기 우리를 사용 하 여 2 차원 반 변성 agarose 젤 전기 이동 법 다른 유형의 크기의 아 밀 로이드 같은 섬유의 존재를 확인 하 고 크기가 젤 동안 녹말 체 섬유의 분리로 인해 가능성을 제외 실행 중인 프로세스입니다.

2 차원 반 변성 세제 Agarose 젤 전기 이동 법 확인 또는 아 밀 로이드 같은 녹말 체 섬유의 크기가 하 사용

이 프로토콜 분석 blotting 점이 상대적인 양의 Aβ 올리고 머를 평가 하는 합성 펩 티 드에 생체 외에서 에서 Aβ 올리고 준비 하는 방법을 설명 합니다.

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

여기에 제공된 것은 다른 조직과 뇌의 다양한 영역에서 분리된 미토콘드리아를 가진 다른 펩티드 및 단백질의 네이티브 형태, 프리피릴라 및 성숙한 아밀로이드 섬유사이의 상호작용을 조사하기 위한 프로토콜이다.

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.

뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화

학습하세요 아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인(AICD)의 대규모 정화 및 열적 집계 유도 방법을 원자력 현미경으로 특성화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 알츠하이머병 연구에 필수적인 생화학 및 구조 생물학 분석을 가능하게 합니다.

아밀로이드 전구체 단백질 세포 내 도메인의 정화 및 집계

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