Name: 사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 사후 조직에서 심근세포 핵을 분리하는 방법입니다. 조직 균질화, 밀도 침강 원심분리, 형광 활성 세포 분류를 통해 고순도 핵을 얻을 수 있습니다.

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우리는 유동세포계측법와 도움 마르셀 토로 인정 싶어요. 이 연구는 스웨덴어 심장과 폐 재단, 유럽위원회는 FP7 &quot;CardioCell&quot;, 스웨덴어 연구 협의회, AFA 보험 및 ALF에 의해 지원되었다. OB는 도이치 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.

1. 심장 핵​​의 분리 <ol><li> 1퍼센트 BSA / PBS 코팅 용액의 10 ML과 코트 ultracentrifuge 튜브 (Beckman의 원심 분리기 튜브 # 363664). 튜브를 모자하고 그들 튜브 회전에서 30 분 동안 회전하자. 코팅 용액을 제거하고 원심 분리기 튜브 공기 건조 (마우스 심장 당 하나의 튜브가 다른 종류의 단일 마우스 하트, 번갈아 최대 5 마우스의 마음이나 심장 조직의 1g의 분석에 필요한하게 (예 : 인간) 처리할 수 있습니다 연결한 튜브에서). </li><li> 모두 다음 단계는 얼음에서 수행되어야합니다. 메스 신선한 또는 스냅인 냉동 마우스 심장의 좌심실 해부. 참고,이 프로토콜은 마우스 마음에 최적화되어 있습니다뿐만 아니라 쥐 또는 사람의 마음에 맞게 할 수 있습니다. 또는 다른 종의에서 심장 조직의 1g까지 사용합니다. </li><li> 때론 작은 큐비클로 표본을 트림. </li><li> 용해 완충액의 15 ML 가득한 50 ML 팔콘 튜브에 조직 조각을 전송합니다. </li><li> 를 Homogenize10 초위한 24,000 rpm으로 T-25 울트라 Turrax 프로브 균 질기 (이카)과 심장 조직. </li><li> 30 ML에 용해 버퍼의 동일한 볼륨으로 homogenate를 희석. </li><li> 더욱 조직과 무료 핵 homogenize하는 유리 douncer (40 ML)를 사용합니다. 대형 통관 유봉들과 8 스트로크를 수행합니다. </li><li> 원유 핵는 100 μm의 70 μm의 나일론 메쉬 세포 스트레이너 (BD Biosciences), 연속적으로 분리할 전달합니다. </li><li> 원유 핵은 10 분 700 XG에서 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 분리 내려 봐. </li><li> 반전 튜브에 의해 신중하게 뜨는을 제거하고 종이 타월로 튜브의 안쪽을 닦으십시오. 핵 펠렛을 방해하지 않도록주의하십시오. </li><li> 원유 핵이 솔루션은 여러 번 최대 pipetting 및 아래쪽으로 자당 버퍼의 5ml에 격리 디졸브. 녹아 펠렛으로 자당 버퍼의 추가 25 ML을 추가합니다. </li><li> 코팅 ultracentrifuge 튜브 (단계 1.1을 참조) 신선한 자당 버퍼의 10 ML을 추가합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 조심스럽게 단계 1.9에서 자당 버퍼에 녹아있는 resuspended 핵 펠렛과 자당 버퍼의 부가 10 ML 입혀라. </li><li> JS13.1 무료 스윙 로터에 그들을 배치하기 전에 원심 분리기 튜브의 균형과 고속 원심 분리기 (Beckman 아벤티 S-25)에 날개를 놓습니다. </li><li> 60 분 동안 4 ° C에서 13,000 XG에 핵 샘플을 봐. </li><li> 스핀이 완료되면 로터에서 신중하게 튜브를 제거하고 반전 튜브에 의해 표면에 뜨는를 버리고 종이 타월로 튜브의 안쪽에서 남아있는 파편을 닦아. </li><li> 핵 저장 버퍼 (NSB 플러스 버퍼)의 1ml에 핵 펠렛를 해산. 참고 : NSB 플러스 DNA를 안정제로 1.5 MM spermine이 포함되어 있습니다. </li><li> cardiomyocyte 핵의 immunostaining 단계 2.1 진행합니다. </li></ol> 2. 유동세포계측법 위해 Immunostaining <ol><li> immunostaining에 대한 부정적인 제어를 준비합니다. 핵 샘플 20 μl를 벗어 나누어지는와보세요NSB 플러스 버퍼의 DD 980의 μl. </li><li> immunolabel cardiomyocyte 핵에 1:500의 희석에 핵 샘플로 백신 pericentriolar 소재 한 항체를 (토끼 안티 PCM-1, 아틀라스 항체)를 추가합니다. 단계 2.1 준비 부정적인 컨트롤에 대한 안티 PCM-1 항체와 같은 희석에 isotype 항체를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 사이에 부정적인 제어 및 샘플 튜브를 품어. </li><li> NSB 플러스 버퍼 (10 분 700 XG에서 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 튜브를 돌려서. 뜨는 취소하고 NSB 플러스 버퍼의 1 ML에 핵 펠렛를 해산)에 적어도 한 번 이상 부정적인 제어 및 샘플을 씻으십시오. </li><li> 1:1000의 희석에 부정적인 제어 및 샘플 튜브에 안티 - 토끼 형광 이차 항체 (FITC 또는 APC)를 추가합니다. </li><li> 한 H에 대해 4 ° C에서 제외어 제어 및 샘플 튜브를 품어. </li><li> NSB 플러스 버퍼 (10 분 700 XG에 냉장 원심 분리기 (4 ℃)에서 튜브를 다운 스핀과 함께 적어도 한 번 이상 부정적인 제어 및 샘플을 씻으. 뜨는을 무시하고) NSB 플러스 버퍼의 1 ML에 핵 펠렛를 해산. </li><li> 흐름 cytometric 분석과 정렬을 진행합니다. </li></ol> 3. 유동세포계측법 <ol><li> 당신이 단계 1.1에 설명된대로 정렬 유동세포계측법를 시작하기 전에 1퍼센트 BSA / PBS 용액 코트 핵 컬렉션 튜브 (팔콘 15 ML). </li><li> 샘플 및 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 부정적인 제어를 필터링하고 (BD의 유입) 먼저 흐름 cytometer에 부정적인 컨트롤을로드합니다. 전방 산란 (FSC), 전방 산란 펄스 폭 (FS 펄스 폭)와 사이드 분산형 (SSC) (그림 2A와 B)을 바탕으로 핵 및 singlets (단일 핵)을 정의하는 첫 번째와 두 번째 게이트를 정의합니다. 샘플로 얼룩의 DNA (DRAQ5 (1:500)를) 추가하면 처음에 핵 인구를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> immunolabeled 샘플을로드 및 비 cardiomyocyte 핵 (PCM-1-음수)에서 cardiomyocyte 핵 (PCM-1-positve)을 분리하기 위해 세 번째 게이트를 정의합니다. 정렬을 시작합니다(그림 2C와 D). </li></ol> 옵션 : 핵의 DNA 콘텐츠 (ploidy)를 분석하고 핵 (예 : Hoechst 33342 또는 DRAQ5) (그림의 2e)에 얼룩 적절한 DNA를 추가 세포주기 분석을 수행하기 위해서는. <ol start="4"><li> 유동세포계측법 정렬 후, 얼음 핵을 배치하고 정렬 순도 (그림 3A와 B)를 확인하기 위해 다시 분석합니다. </li><li> 15 분 대한 냉장 원심 분리기 1500 XG에서 수집 튜브의 정렬된 핵을 봐. </li><li> 다운 스트림 응용 프로그램과 호환 버퍼에 핵 펠렛를 해산. </li></ol> 4. 대표 결과 핵의 형태 및 무결성의 DNA 얼룩에 의해 평가 및 현미경 (그림 1)에 의해 시각하실 수 있습니다. 성공적인 PCM-1이 라벨은 epifluorescence 현미경 의해 유동세포계측법 (그림 1 및 그림. 2C와 d)에 의해 평가됩니다. PCM-1-positi같군과 부정적인 집단이 아니라 (그림 2C와 D) 서로 구분해야합니다. murine 좌심실에서 모든 핵의 약 30 %는 (그림 2D) cardiomyocyte 핵 있어야합니다. 순결을 정렬하는 것은 정렬 핵 (그림 3A와 B에게) 다시 분석하여 평가 할 수 있습니다. 두 핵의 인구는 95 %를 초과 정렬 순결이 있어야합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> 1 그림. PCM-1 cardiomyocyte 핵을 식별합니다. 심장 핵 (가) PCM-1 (B) 및 성인 쥐 심장에서 Nkx2.5 (C)에 대한 항체 물들일 수 있습니다. (D) PCM-1-라벨이 핵은 cardiomyocyte 세포질 (마이 오신 중쇄 (MHC))으로 둘러싸여 있으며, PCM-1 염색법 (스케일 바, 20 μm의 및 10에 의해 cardiomyocyte 핵의 정확한 신원을 문서화, 전사 인자 Nkx2.5를 표현하고 있습니다 μm의 (D, 삽입된 페이지)). (E) DNA와 시각 심장 핵의 분리는 DRAQ5에 얼룩. (F와 G) Cardiomyocyte 핵은 PCM-1 (스케일 바 10 μm의)에 대한 항체로 분류하고 있습니다. 참고 조직 섹션에 myocyte 핵 및 절연 핵 (화살표)에서 PCM-1 epinuclear 염색법 패턴. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> 그림 2. cardiomyocyte 핵의 흐름 cytometric 정렬. () 심장 핵은 전방 산란 (FSC)와 사이드 분산형 (SSC)에 의해 식별됩니다. (b)는 두 번째 게이트는 FSC와 FS 펄스 폭 5에 하나의 핵을 식별합니다. (C, D) 형​​광 게이팅은 심장 조직에서 cardiomyocyte 핵의 분리 (PCM-1-양성) 및 비 cardiomyocyte (PCM-1-음수)이 핵 수 있습니다. (마) 마우스 cardiomyocyte이 대부분 (&gt; 80 %) diploid (2N)이며, 오직 작은 부분 집합은 (4N) 6 tetraploid입니다. 참고, 인간 cardiomyocytes는 polyploidy 핵의 높은 주파수 (&gt; 2N) 7,8가 포함되어 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <stroNG&gt; 그림 3. 정렬 cardiomyocyte 및 비 cardiomyocyte 핵의 순도 분석. 정렬 비 cardiomyocyte ()와 cardiomyocyte 핵 (B)의 재 분석. 두 인구 99 %를 초과 정렬 순결을 보여줍니다.

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</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

cardiomyocyte 핵의 정확한 신원은 myocardium 2,3의 재생 과정의 분석을 위해 매우 중요합니다. 신선한 조직에서 cardiomyocytes를 분리하기위한 종래의 기술은 주로 세포외 기질 단백질의 소화 효소 및 저속 원심 분리에 의한 간질 세포에서 이후의 정화를 기준으로합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생활 cardiomyocytes의 자세한 정화는 같은 SIRPA 9 또는 mitochondrial 염료 10 표면 마커와 immunolabeling하여 수행할 수, 고정 cardiomyocytes 같은 마이 오신 중쇄 (MHC) 또는 같은 핵 단백질로서 세포질 마커에 의해 확인할 수 있습니다 GATA4 또는 Nkx2.5. 그러나, Nkx2.5과 GATA4의 표현은 성숙 cardiomyocytes에 국한되지 않고, 또한 개발 도중 심장 경색 11,12 후에 전구 세포에서 감지가 가능하다. cardiomyocytes을 식별하는 유전...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. 용해 완충액 </td></tr><tr><td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> 0.32 M의 자당 </td></tr><tr><td> 10 MM 트리스-HCL (산도 = 8) </td></tr><tr><td> 5 MM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 5 밀리미터 마그네슘 아세테이트 </td></tr><tr><td> 2.0 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> 0.5 MM EGTA </td></tr><tr><td> 1 ㎜ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. 자당 버퍼 </td></tr><tr><td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> 2.1 M의 자당 </td></tr><tr><td> 10 MM 트리스-HCL (산도 = 8) </td></tr><tr><td> 5 밀리미터 마그네슘 아세테이트 </td></tr><tr><td> 1 ㎜ DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. 핵 저장 버퍼 (NSB 플러스) </td></tr><tR&gt; <td> 시약의 이름 </td></tr><tr><td> 0.44 M의 자당 </td></tr><tr><td> 10 MM 트리스-HCL (산도가 = 7.2) </td></tr><tr><td> 70 MM KCl </td></tr><tr><td> 10 밀리미터 MgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 MM spermine </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 시약 및 장비 </td><td> 회사 </td></tr><tr><td> Isotype 토끼 IgG 칩 학년, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> 토끼 반 PCM-1 항체, # HPA023374 </td><td> 아틀라스 항체 </td></tr><tr><td> 돈키 초. 항체, 안티 토끼 알렉사 488 형석, #-21206 또는 이와 동등한 초. 형광 항체 </td><td> 생명 기술 </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> 세포 strainers 30 μm의, 70 μm의 및 100 μm의 </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> 유리 douncer (40 ML)과&quot;L&quot;을 유봉 </td><td> VWR (Wheaton의 공업 주식 회사) </td></tr><tr><td> T-25 울트라 Turrax 균 질기 </td><td> 이카 독일 </td></tr><tr><td> 공구 S25 N-18 G를 분산 </td><td> 이카 독일 </td></tr><tr><td> Beckman 아벤티의 원심 분리기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td></tr><tr><td> 팔콘 튜브 15 ML 50 ML </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman의 원심 분리기 튜브 # 363664 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td></tr><tr><td> JS13.1 무료 스윙 로터 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td></tr><tr><td> 유입의 cytometer </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td></tr><tr><td> 튜브 회전 </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

사후 조직에서 cardiomyocyte 핵의 분리

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

대부분의 전략에만 세포질 마커 단백질 1에 의존로 cardiomyocyte 핵의 식별은 조직 섹션에 도전했습니다. 이러한 증식과 apoptosis와 같은 심장 myocytes에서는 드문 행사 심장 myocyte 핵의 정확한 신원은 항상성 및 병리 학적 조건 2의 세포 갱신을 분석해야합니다. 여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)와 후속 유동세포계측법 정렬에 대한 항체가있는 밀도의 침강 및 immunolabeling으로 해부 조직에서 cardiomyocyte 핵을 분리하는 방법을 제공합니다. 이 전략은 신선한 조직 및 냉동 보관 물질에 동일하게 작업의 장점과 높은 처리량 분석 및 절연을 허용합니다. 이렇게하면 이미 biobanks에서 수집한 자료를 공부할 수 있습니다. 이 기술 적용과 종의 광범위한 테스트와 같은 탄소-14 데이트 3 셀 - 사 등 여러 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하다CLE 분석 4, thymidine의 analogues의 시각화 (예 : BrdU와 이두) 4, transcriptome 및 epigenetic 분석.

심장 핵​​은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

대부분의 전략이 세포질 마커 단백질에만 의존하기 때문에, 조직 절편에서 심근세포 핵을 식별하는 것은 까다로운 과제였습니다1. 드문 사건...

본 절차의 전반적인 목표는 사후 조직에서 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 프로브 균질기와 유리 다운너(glass downer)를 사용하여 조직을 균질화한 후, 여러 단계의 여과 과정을 거쳐 수행됩니다. 두 번째 단계는 밀도 침강 원심분리를 통해 다른 세포 분획으로부터 핵 분획을 분리하는 것입니다.다음으로, 심근세포 핵을 PCM1에 대해 제작된 항체로 면역 표지합니다. 마지막 단계는 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 표지된 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 최종적으로 추가적인 후속 조작 직전에, 분류된 핵 분획의 재분석을 통해 심근세포 핵의 순도를 확인합니다.이 기술의 주요 장점은 신선한 조직이나 냉동 보관된 아카이브 조직 모두에서 심근세포 핵을 고처리량 방식으로 동일하게 잘 분석할 수 있다는 점입니다. 심근세포에서의 DNA 기반 연구는 여러 가지 이유로 특히 까다롭습니다. 첫째, 심근세포는 심장 세포의 약 20~30%만을 차지하기 때문입니다.또한, 이들은 상당 부분 핵을 가지고 있습니다. 게다가 심근세포는 상당 부분 다배체입니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 모든 장애물을 극복할 수 있습니다.절차를 시작하기 전에, 초원심분리관을 1% BSA 및 PBS 코팅 용액 10 milliliters로 코팅합니다. 튜브를 30분 동안 회전시킨 후, 코팅 용액을 제거하고 자연 건조시킵니다.메스를 사용하여 급속 냉동된 마우스 심장에서 좌심실을 박리함으로써 심장 핵 분리 절차를 시작합니다. 박리된 시료를 작은 조각으로 다듬은 다음, 15 milliliters의 용해 완충액(lysis buffer)이 채워진 50 milliliter 원추형 튜브에 조직 조각들을 옮깁니다. 다음으로, 프로브 균질기(probe homogenizer)를 사용하여 24, 000 RPM에서 10초 동안 심장 조직을 균질화한 후, 동일한 부피의 용해 완충액을 추가하여 균질액을 30 milliliters까지 희석합니다. 핵을 유출시키기 위해 균질액을 유리 다운 균질기(glass down homogenizer)로 옮기고, 간격이 넓은 페스틀(large clearance pestle)로 8회 스트로크하여 균질화합니다.그다음 조 nuclei(crude nuclei)를 통과시킵니다. 먼저 100 micron 셀 스트레이너로 분리한 후, 다시 70 micron 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 이제 분리된 조 nuclei를 700 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 가라앉힙니다.튜브를 뒤집어 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 페이퍼 타월로 튜브 내부를 닦아냅니다. 이때 핵 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 파이펫으로 용액을 여러 번 흡입하고 배출하여 조핵(crude nuclei)을 재부유시킵니다.5 mL의 sucrose buffer로 분리한 다음, 핵 현탁액에 25 mL의 sucrose buffer를 추가로 첨가합니다. 이어서, 이전에 준비한 코팅된 초원심분리 튜브 중 하나에 새로 제조한 10 mL의 sucrose buffer를 넣습니다. 그 다음, 재현탁된 핵 펠렛 용액을 버퍼 위에 조심스럽게 층이 지도록 얹어줍니다.유리 회전 로터(free swinging rotor)에서 튜브의 균형을 맞춘 후, 고속 원심분리기에 로터를 넣고 핵 샘플을 13,000 ×g, 4 °C에서 60분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 로터에서 튜브를 조심스럽게 꺼내어 다시 한번 뒤집어 줍니다. 상층액을 버리기 위해 이전과 마찬가지로 페이퍼 타월로 튜브 내부의 남은 잔해물을 닦아낸 다음, 핵 펠렛을 1 mL의 핵 보관 버퍼에 다시 현탁합니다.면역 염색 절차를 시작하기 전, 핵 샘플 20 µL 분량을 팩스 튜브로 옮깁니다. 해당 분량에 핵 보관 버퍼 980 µL를 추가하고 튜브에 음성 대조군이라고 표시합니다. 이제 핵 샘플 튜브와 음성 대조군 튜브에 anti PCM1 항체를 1:500 비율로 희석하여 추가합니다.그 다음 두 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, nuclei storage buffer로 튜브를 세척하고 상층액을 제거한 후, nuclei 펠렛을 1mL의 nuclei storage buffer에 다시 현탁합니다.그런 다음, 1:100으로 희석한 항토끼 형광 2차 항체를 세포 샘플에 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 핵 보관 버퍼로 튜브를 세척한 후, 펠렛을 1mL의 핵 보관 버퍼에 다시 현탁하여 유세포 분석 정렬 및 분석을 준비합니다. 비디오 시작 부분과 마찬가지로 BSA와 PBS로 핵 수집 튜브를 코팅한 뒤, 샘플과 음성 대조군을 각각 30µm 세포 스트레이너로 여과하는 것으로 시작하십시오. 로딩 직전에 DNA 염색약을 첨가합니다.핵 집단 식별을 위해 1:500 희석액을 추가하십시오. 음성 대조군을 유세포 분석기에 로드하십시오. 여기 표시된 DOT 플롯과 유사하게 심장 핵을 정의하기 위한 첫 번째 게이트를 설정하려면 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 사용하십시오.그 다음, 전방 산란(forward scatter) 및 전방 산란 펄스 폭(forward scatter pulse width) 파라미터를 사용하여 여기에 표시된 DOT 플롯과 유사하게 핵 단일 세포(nuclei singlets) 주변에 두 번째 게이트를 생성합니다. 이제 면역 표지된 샘플을 로드하고, PCM1 양성 심근세포 핵과 PCM1 음성 비심근세포 핵을 구분하기 위해 세 번째 게이트를 설정합니다. 핵 DNA 염색을 사용하여 DNA 함량을 분석하고, 이 히스토그램에 예시된 분석과 유사하게 세포 주기 분석을 수행합니다.PCM one 양성 여부에 따라 핵을 분리한 후, 분리된 핵을 얼음에 두고 각 분리 샘플의 일부를 재분석하여 분리 순도를 결정합니다. 마지막으로, 수집 튜브에 담긴 분리된 핵을 4 °C에서 1500 ×g로 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 핵 펠릿을 원하는 하위 응용 분야에 적합한 버퍼에 재현탁합니다.첫 번째 그림에서는 성체 생쥐의 심장을 핵 염색약과 PCM one, 심장 전사 인자인 NKX2.5, 그리고 미오신 중쇄(myosin heavy chain, MHC)에 대한 항체로 염색하였습니다. 여기서는 이전 그림의 오버레이 이미지를 확대한 모습이 제시되어 있습니다. 흰색으로 표시된 PCM one 표지 핵들이 빨간색의 전사 인자 NKX2.5를 발현하며, 초록색의 심근세포 세포질로 둘러싸여 있음에 유의하십시오.이러한 데이터들은 PCM one 염색이 심근세포 핵을 식별하는 정확성을 함께 입증합니다. 삽입도는 심근세포 핵 내 PCM one의 epi nuclear 염색 패턴을 강조하며, 이는 다음 세 개의 그림에 묘사된 실험에서 화살표로 추가 표시되어 있습니다. 분리된 심장 핵은 DNA 염색약인 DRAC five와 PCM one 항체로 염색되었습니다. 여기에서 이전 두 그림을 중첩한 이미지의 화살표는 분리된 심근세포 핵에서 PCM one의 epi nuclear 염색 패턴을 다시 한번 강조합니다.이 도트 플롯은 PCM one 표지로 확인된 바와 같이, 이 방법으로 분리된 핵의 약 30%가 심근세포 핵임을 보여줍니다. 마지막으로, 이 히스토그램들이 보여주듯이 마우스 심근세포 핵은 2N 피크로 나타나는 이배체(diploid)가 주를 이루며, 4N 피크가 더 작게 나타나는 것으로 보아 극히 일부만이 사배체(tetraploid)임을 알 수 있습니다. 이 기술의 장점 중 하나는 다른 종에도 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.사람의 경우와 마찬가지입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

심근세포 회전율의 정량화는 어렵습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 신심근세포 핵 생성 및 핵 ploidy의 정확하고 민감한 정량화를 가능하게 함으로써 이러한 과제에 중요한 기여를 합니다.

심근 DNA 합성 및 배수성의 동시 평가 : Method는 심근 재생 및 회전율의 정량을 지원합니다

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

이 연구의 목표는 성인 심장에서 심근세포를 재현하고 DNA 함량 및 핵형성을 측정하는 방법을 개발하는 것입니다.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

여기에서 우리는 심근 경색 후(MI) 마우스 심장에서 높은 생존력을 가진 충분한 양의 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이는 후속 단일 세포 시퀀싱, 유세포 분석 및 일차 세포 배양에 사용할 수 있습니다.

심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

관상동맥 내막 절제술 조직 샘플은 최적화된 해리 프로토콜을 사용하여 단일 핵을 분리하기 위해 처리되었습니다. 분리된 핵의 무결성은 세 가지 보완적 접근법을 통해 검증되었습니다: 막 무결성 평가를 위한 트리판 블루 배제 염색, 핵 형태를 확인하기 위한 DAPI 기반 공초점 현미경, 핵수율과 순도를 정량화하는 유세포 측정법.

관상동맥 우회 이식 환자의 관상동맥 내적출술 조직에서 단일 핵 분리

배우세요 사후 조직에서 심근세포 핵을 분리하는 방법입니다. 조직 균질화, 밀도 침강 원심분리, 형광 활성 세포 분류를 통해 고순도 핵을 얻을 수 있습니다.

사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

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