사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 사후 조직에서 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 프로브 균질화기와 유리 다우너로 조직을 균질화한 다음 여러 여과 단계를 거쳐 수행됩니다. 두 번째 단계는 밀도 침전 원심분리를 통해 다른 세포 분획물로부터 핵 분획을 분리하는 것입니다.

다음으로, 심근세포 핵은 PCM 1에 대해 유래된 항체로 면역 표지됩니다. 마지막 단계는 형광 활성화 세포 분류를 통해 표지된 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 궁극적으로 추가 다운스트림 조작 직전에 심근세포 핵의 순도는 분류된 핵 분획의 재분석을 통해 확인됩니다.

이 기술의 주요 장점은 심근세포 핵을 고처리량 방식으로 신선 또는 냉동 아카이브 조직에서 동등하게 잘 분석할 수 있다는 것입니다. 심근세포에 대한 DNA 기반 연구는 여러 가지 이유로 특히 어렵습니다. 첫째, 심근세포는 심장 세포의 약 20-30%만 구성합니다.

더욱이, 그들은 상당한 정도로 핵이 있습니다. 더욱이, 심근세포는 상당한 정도의 배수성(polyploid)입니다. 여기에 설명된 이 방법은 이러한 모든 장애물을 극복합니다.

절차를 시작하기 전에. 초원심분리기 튜브를 10mL의 1%BSA 플러스 PBS 코팅 용액으로 코팅합니다. 튜브를 30분 동안 회전시킨 후 코팅 용액을 제거하고 자연 건조시킵니다.

메스를 사용하여 스냅 냉동 마우스 심장에서 좌심실을 절개하여 심장 핵 분리 절차를 시작합니다.절개된 표본을 작은 분절로 자른 다음 조직 조각을 15ml의 용해 완충액으로 채워진 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 24, 10 초 동안 000 RPM에 조사 균질화기로 심혼 조직을 균질화하고, 그 후에 30 밀리리터까지 용해 완충액의 동등한 양으로 균질산물을 묽게 하십시오. 핵을 해제하기 위해 큰 클리어런스 유봉에서 8번의 스트로크를 사용하여 균질액을 유리 다운 균질화기로 옮깁니다.

그런 다음 조잡한 핵을 통과시킵니다. 먼저 100미크론 셀 스트레이너를 통해 분리한 다음 70미크론 셀 스트레이너를 통해 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 분리합니다. 이제 조핵을 700배 G와 섭씨 4도에서 10분 동안 스핀다운합니다.

튜브를 뒤집어 상층액을 조심스럽게 제거한 다음 종이 타월로 튜브 내부를 닦습니다. 핵 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 용액을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 조핵을 재현탁합니다.

5ml의 슈크로스 완충액을 분리한 다음 추가로 25ml의 슈크로스 버퍼를 핵 현탁액에 추가합니다. 다음으로, 갓 준비한 자당 완충액 10ml를 이전에 준비된 초원심분리 튜브 중 하나에 추가합니다. 그런 다음 완충액을 재현탁된 핵 펠릿 용액으로 조심스럽게 오버레이합니다.

자유 스윙 로터에서 튜브의 균형을 잡은 후 로터를 고속 원심 분리기에 넣고 13, 000 회 g 및 섭씨 4도에서 60 분 동안 핵 샘플을 회전시킵니다. 스핀이 완료되면 로터에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 다시 뒤집습니다. 상층액을 버리려면 이전과 같이 종이 타월로 튜브 내부에 남아 있는 잔해물을 닦아낸 다음 핵 저장 완충액 1ml에 핵 펠릿을 다시 현탁시킵니다.

면역 염색 절차를 시작하기 전에 핵 샘플의 20마이크로리터 분취액을 팩스 튜브로 옮깁니다. 980마이크로리터의 핵 저장 버퍼를 부분 표본에 추가하고 튜브 음성 대조군에 라벨을 붙입니다. 이제 핵 샘플에 anti PCM one 항체를 추가하고 negative control tube를 1에서 500까지 희석하여 추가합니다.

그런 다음 두 튜브를 모두 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날. 핵 저장 완충액으로 튜브를 세척하고 상등액 resus를 버린 후 핵 펠릿을 다른 밀리리터의 핵 저장 완충액에 현탁시킵니다.

그런 다음 1-100 희석으로 세포 샘플에 항 광견병 형광 2차 항체를 추가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 배양합니다. nuclei storage buffer로 튜브를 세척한 후, reus는 유세포 분석 분류 및 분석을 위해 pellet을 1ml의 nuclei storage buffer에 현탁시킵니다.핵을 코팅한 후 BSA 및 PBS로 수집 튜브를 만드는 것은 비디오의 시작 부분과 같이 개별 30 미크론 세포 스트레이너를 통해 샘플과 음성 대조군을 필터링하는 것으로 시작합니다. 로딩 직전에 A DNA 염색을 추가합니다.

핵 집단 식별을 위해 1에서 500 희석을 추가합니다. negative control을 유세포 분석기에 로드합니다. 전방 및 측면 산란 매개변수를 사용하여 여기에 표시된 DOT 플롯과 유사한 심장 핵을 정의하기 위한 첫 번째 보행을 배치합니다.

그런 다음 forward scatter 및 forward scatter pulse width 파라미터를 사용하여 여기에 표시된 DOT 플롯과 유사한 핵 singlets 주위에 두 번째 게이트를 생성합니다. 이제 면역 표지된 샘플을 로드하고 PCM 1개의 양성 심근 세포 핵과 PCM 1개의 음성 비심근세포 핵을 구별하기 위한 세 번째 게이트를 배치합니다. 핵 DNA 염색을 사용하여 DNA 함량을 분석하고 이 히스토그램에 표시된 분석과 유사한 세포주기 분석을 수행합니다.

PCM 1 양성을 기준으로 핵을 분류한 후, 분류된 핵을 얼음 위에 놓고 분류된 각 샘플의 부분 표본을 재분석하여 분류 순도를 측정합니다. 마지막으로, 수집 튜브에 있는 분류된 핵을 G 1500배와 섭씨 4도에서 15분 동안 스핀다운합니다. 폐기 후, 상등액은 원하는 다운스트림 응용 분야와 호환되는 완충액에 핵 펠릿을 현탁시킵니다.

이 첫 번째 그림에서, 성체 쥐의 심장은 핵 염료와 PCM 1, murn 심장 전사 인자 N KX 2.5 및 미오신 중쇄 또는 MHC에 대한 항체로 염색되었습니다. 다음은 이전 그림의 오버레이를 클로즈업한 것입니다. 흰색으로 표시된 PCM one이 전사 인자 NK X 2.5를 빨간색으로 표현하고 녹색의 심근세포 세포질로 둘러싸여 있는 방법에 주목하십시오.

이러한 데이터는 PCM one staining이 심근세포 핵을 식별하는 정확도를 보여줍니다. 삽입은 근세포 핵에서 PCM 1의 epi 핵 염색 패턴을 강조합니다.이 다음 세 그림에 묘사된 실험에서 화살표로 더 표시된 바와 같이, 심장 핵 분리물은 DNA 염색 DRAC 5로 염색되고 PCM 1에 대한 항체로 염색되었습니다. 여기서, 앞의 두 그림의 오버레이, 화살표는 분리된 심근세포 핵에서 PCM 1의 에피 핵 염색 패턴을 다시 한 번 강조합니다.

이 점도표는 이 방법으로 분리된 핵의 약 30%가 PCM one 라벨링에 의해 표시된 바와 같이 심근세포 핵임을 보여줍니다. 마지막으로, 이러한 히스토그램에서 알 수 있듯이 마우스 심근세포 핵은 주로 2개의 N 피크로 표시된 이배체이며 더 작은 4개의 N 피크로 표시된 것처럼 작은 하위 집합만 사배체입니다. 이 기술의 장점 중 하나는 다른 종에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

인간에 관해서는.