사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리

본 절차의 전반적인 목표는 사후 조직에서 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 프로브 균질기와 유리 다운너(glass downer)를 사용하여 조직을 균질화한 후, 여러 단계의 여과 과정을 거쳐 수행됩니다. 두 번째 단계는 밀도 침강 원심분리를 통해 다른 세포 분획으로부터 핵 분획을 분리하는 것입니다.

다음으로, 심근세포 핵을 PCM1에 대해 제작된 항체로 면역 표지합니다. 마지막 단계는 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 표지된 심근세포 핵을 분리하는 것입니다. 최종적으로 추가적인 후속 조작 직전에, 분류된 핵 분획의 재분석을 통해 심근세포 핵의 순도를 확인합니다.

이 기술의 주요 장점은 신선한 조직이나 냉동 보관된 아카이브 조직 모두에서 심근세포 핵을 고처리량 방식으로 동일하게 잘 분석할 수 있다는 점입니다. 심근세포에서의 DNA 기반 연구는 여러 가지 이유로 특히 까다롭습니다. 첫째, 심근세포는 심장 세포의 약 20~30%만을 차지하기 때문입니다.

또한, 이들은 상당 부분 핵을 가지고 있습니다. 게다가 심근세포는 상당 부분 다배체입니다. 여기에 설명된 방법은 이러한 모든 장애물을 극복할 수 있습니다.

절차를 시작하기 전에, 초원심분리관을 1% BSA 및 PBS 코팅 용액 10 milliliters로 코팅합니다. 튜브를 30분 동안 회전시킨 후, 코팅 용액을 제거하고 자연 건조시킵니다.

메스를 사용하여 급속 냉동된 마우스 심장에서 좌심실을 박리함으로써 심장 핵 분리 절차를 시작합니다. 박리된 시료를 작은 조각으로 다듬은 다음, 15 milliliters의 용해 완충액(lysis buffer)이 채워진 50 milliliter 원추형 튜브에 조직 조각들을 옮깁니다. 다음으로, 프로브 균질기(probe homogenizer)를 사용하여 24, 000 RPM에서 10초 동안 심장 조직을 균질화한 후, 동일한 부피의 용해 완충액을 추가하여 균질액을 30 milliliters까지 희석합니다. 핵을 유출시키기 위해 균질액을 유리 다운 균질기(glass down homogenizer)로 옮기고, 간격이 넓은 페스틀(large clearance pestle)로 8회 스트로크하여 균질화합니다.

그다음 조 nuclei(crude nuclei)를 통과시킵니다. 먼저 100 micron 셀 스트레이너로 분리한 후, 다시 70 micron 셀 스트레이너를 통해 새로운 50 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 이제 분리된 조 nuclei를 700 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 가라앉힙니다.

튜브를 뒤집어 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 페이퍼 타월로 튜브 내부를 닦아냅니다. 이때 핵 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하십시오. 파이펫으로 용액을 여러 번 흡입하고 배출하여 조핵(crude nuclei)을 재부유시킵니다.

5 mL의 sucrose buffer로 분리한 다음, 핵 현탁액에 25 mL의 sucrose buffer를 추가로 첨가합니다. 이어서, 이전에 준비한 코팅된 초원심분리 튜브 중 하나에 새로 제조한 10 mL의 sucrose buffer를 넣습니다. 그 다음, 재현탁된 핵 펠렛 용액을 버퍼 위에 조심스럽게 층이 지도록 얹어줍니다.

유리 회전 로터(free swinging rotor)에서 튜브의 균형을 맞춘 후, 고속 원심분리기에 로터를 넣고 핵 샘플을 13,000 ×g, 4 °C에서 60분 동안 원심분리합니다. 원심분리가 완료되면 로터에서 튜브를 조심스럽게 꺼내어 다시 한번 뒤집어 줍니다. 상층액을 버리기 위해 이전과 마찬가지로 페이퍼 타월로 튜브 내부의 남은 잔해물을 닦아낸 다음, 핵 펠렛을 1 mL의 핵 보관 버퍼에 다시 현탁합니다.

면역 염색 절차를 시작하기 전, 핵 샘플 20 µL 분량을 팩스 튜브로 옮깁니다. 해당 분량에 핵 보관 버퍼 980 µL를 추가하고 튜브에 음성 대조군이라고 표시합니다. 이제 핵 샘플 튜브와 음성 대조군 튜브에 anti PCM1 항체를 1:500 비율로 희석하여 추가합니다.

그 다음 두 튜브를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, nuclei storage buffer로 튜브를 세척하고 상층액을 제거한 후, nuclei 펠렛을 1mL의 nuclei storage buffer에 다시 현탁합니다.

그런 다음, 1:100으로 희석한 항토끼 형광 2차 항체를 세포 샘플에 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다. 핵 보관 버퍼로 튜브를 세척한 후, 펠렛을 1mL의 핵 보관 버퍼에 다시 현탁하여 유세포 분석 정렬 및 분석을 준비합니다. 비디오 시작 부분과 마찬가지로 BSA와 PBS로 핵 수집 튜브를 코팅한 뒤, 샘플과 음성 대조군을 각각 30µm 세포 스트레이너로 여과하는 것으로 시작하십시오. 로딩 직전에 DNA 염색약을 첨가합니다.

핵 집단 식별을 위해 1:500 희석액을 추가하십시오. 음성 대조군을 유세포 분석기에 로드하십시오. 여기 표시된 DOT 플롯과 유사하게 심장 핵을 정의하기 위한 첫 번째 게이트를 설정하려면 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터를 사용하십시오.

그 다음, 전방 산란(forward scatter) 및 전방 산란 펄스 폭(forward scatter pulse width) 파라미터를 사용하여 여기에 표시된 DOT 플롯과 유사하게 핵 단일 세포(nuclei singlets) 주변에 두 번째 게이트를 생성합니다. 이제 면역 표지된 샘플을 로드하고, PCM1 양성 심근세포 핵과 PCM1 음성 비심근세포 핵을 구분하기 위해 세 번째 게이트를 설정합니다. 핵 DNA 염색을 사용하여 DNA 함량을 분석하고, 이 히스토그램에 예시된 분석과 유사하게 세포 주기 분석을 수행합니다.

PCM one 양성 여부에 따라 핵을 분리한 후, 분리된 핵을 얼음에 두고 각 분리 샘플의 일부를 재분석하여 분리 순도를 결정합니다. 마지막으로, 수집 튜브에 담긴 분리된 핵을 4 °C에서 1500 ×g로 15분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 제거한 후, 핵 펠릿을 원하는 하위 응용 분야에 적합한 버퍼에 재현탁합니다.

첫 번째 그림에서는 성체 생쥐의 심장을 핵 염색약과 PCM one, 심장 전사 인자인 NKX2.5, 그리고 미오신 중쇄(myosin heavy chain, MHC)에 대한 항체로 염색하였습니다. 여기서는 이전 그림의 오버레이 이미지를 확대한 모습이 제시되어 있습니다. 흰색으로 표시된 PCM one 표지 핵들이 빨간색의 전사 인자 NKX2.5를 발현하며, 초록색의 심근세포 세포질로 둘러싸여 있음에 유의하십시오.

이러한 데이터들은 PCM one 염색이 심근세포 핵을 식별하는 정확성을 함께 입증합니다. 삽입도는 심근세포 핵 내 PCM one의 epi nuclear 염색 패턴을 강조하며, 이는 다음 세 개의 그림에 묘사된 실험에서 화살표로 추가 표시되어 있습니다. 분리된 심장 핵은 DNA 염색약인 DRAC five와 PCM one 항체로 염색되었습니다. 여기에서 이전 두 그림을 중첩한 이미지의 화살표는 분리된 심근세포 핵에서 PCM one의 epi nuclear 염색 패턴을 다시 한번 강조합니다.

이 도트 플롯은 PCM one 표지로 확인된 바와 같이, 이 방법으로 분리된 핵의 약 30%가 심근세포 핵임을 보여줍니다. 마지막으로, 이 히스토그램들이 보여주듯이 마우스 심근세포 핵은 2N 피크로 나타나는 이배체(diploid)가 주를 이루며, 4N 피크가 더 작게 나타나는 것으로 보아 극히 일부만이 사배체(tetraploid)임을 알 수 있습니다. 이 기술의 장점 중 하나는 다른 종에도 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.

사람의 경우와 마찬가지입니다.