Name: Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 학습하세요 하이포탈라무스 마우스 뇌 슬라이스에서 GFP 태그 뉴런의 칼슘 응답을 적색 형광 칼슘 지시약으로 공초점 현미경으로 촬영하는 방법. 이 기술은 다색 이미징 분석을 통해 뉴런 활동을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

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우리는 작업에 참가 동료는 여기에 요약 감사​​드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 &#39;후각의 통합 분석&#39;에서 보조금 의해 폭스 바겐 재단 (TLZ)에 의해 지원되었다. TLZ는 폭스 바겐 재단의 Lichtenberg 교수입니다.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

신경 과학의 주요 문제는 뇌 사회 정보를 처리 방법을 이해하는 것입니다. 사회적 인식에 필요한 정보의 주된 소스가 후각이나 pheromonal 신호에 의해 인코딩되어 있습니다. neuronal 코의 인구, 특히 뇌, 시상 하부에서 신호의 인식에 의해 이러한 신호의 감지는 많은 사회적 과정과 영향력 호르몬 및 기타 neuroendocrine 요소 13-16에서 핵심적인 역할을한다. 여러 뉴런과 다기능 핵을 포함하는 시상 하부 같은 뇌 영역에 neuronal 응답을 분석의 핵심 장애물 관심의 특정 뉴런의 식별합니다. 많은 유전자 변형 마우스 라인은 주로 GFP는 뉴런을 식별 할 수있는 개발되었습니다. 불행하게도, GFP의 형광 재산은 fluo-3 fluo-4 17와 같은 칼슘 2 + 지표 염료를 사용하여 측정을 복잡하게. 따라서 investi에 시작게이트 fura - 붉은 3,4처럼 적 방편 칼슘 <s...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 고양이. N ° </td></tr><tr><td> 한천 </td><td> 시그마 </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> 시그마 </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> 디메틸 sulfoxide </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> 진동 - 블레이드 마이크로톰 Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> 마이크로톰 Hyrax V 50 장치 CU 65 냉각 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2 인큐베이터, CB210-UL </td><td> 접합재 </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> 슈퍼 접착제, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> 더블 spatulas, 스푼 모양 </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microspoon의 spatulas, 스푼 모양 </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> 봄 가위, 모리아 - Vannas - 울프 - 7mm 블레이드 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15370-52 </td></tr><tr><td> 봄 가위, Vannas - 3mm 블레이드 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15000-00 </td></tr><tr><td> 바그너 가위 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14071-12 </td></tr><tr><td> 의료 포셉, 뒤몽의 7B </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11270-20 </td></tr><tr><td> 대형 직사각형 오픈 목욕 상공 회의소 (RC-27) </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0238 </td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 BioRad 래디언스 2100 </td><td> Zeiss </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 gfp 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

뇌의 정보의 인코딩, 정확한 분자 단계뿐만 아니라 시상 하부가 남아 같은 뇌 영역의 다기능 핵에서 특정 뉴런의 활동에 관한 중요한 질문에 근간이 메커니즘에 대한 우리의 지식에 엄청난 증가에도 불구하고. 이 문제는 여러 neurohormone의 신호 전달 폭포의 규정에 관련된 분자 구성 요소의 식별이 포함되어 있습니다. 세포 내 칼슘 2의 고도는 + 두 신호 전달의 수준과 신경 사이트에서, 뉴런의 감도를 조절에 중요한 역할을한다. 새로운 도구는 특정 발기인의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하여 뇌 뉴런의 무수한에서 뉴런을 식별하는 데 도움 등장했습니다. 모두 spatially 및 시간적 자극 - 유도 모니터링하려면 칼슘이 GFP 태그 뉴런, 비 녹색 형광 칼슘 2 + 지표 염료 N의 + 응답eeds는 사용할 수 있습니다. 또한, 공 촛점 현미경은 조직 내에서 깊이 독특한 비행기에서 뉴런을 시각화하고 밖에서 초점 형광를 제한 할 수있는 능력으로 인해 조직 조각의 이미지 개별 뉴런의 좋아하는 방법입니다. 뉴런 1 GFP 태그와 ratiometric 칼슘 2 + 표시 fura-2 조합에 사용되었습니다. 그러나 염료는 자외선 (UV) 빛 예정입니다. UV 빛의 레이저와 제한된 광학 침투 깊이의 비용은 많은 실험실에서의 사용을 방해. 또한, GFP 형광은 fura-2 신호를 2 영향을 줄 수 있습니다. 따라서, 저희는 빨간색 형광 칼슘 2 + 지표 염료를 사용하기로 결정했습니다. fura - 붉은 거대한 스트로크의 변화는 하나의 여기 파장을 사용하여 GFP와 함께 붉은 형광의 다색 분석을 할 수 있습니다. 우리는 후각 뉴런에게 3 GFP 태그와 함께 fura 빨간색을 사용하여 이전에 좋은 결과를했습니다. 후각 조직 슬라이스에 대한 프로토콜은 전자 일 듯qually 잘 hypothalamic 뉴런의 4. 카 2 기반 Fura - 레드 + 영상도 성공적으로 GFP 태그 췌장 β-세포와 HEK 세포 5,6로 표현 GFP 태그 수용체와 결합되었다. fura - 붉은 작은 장식 체로 그리기의 표시등이 칼슘 7 바인딩 후 650 nm의에서의 형광 강도가 감소한다는 것입니다. 따라서, 낮은 칼슘 2 + 농도와 휴식 뉴런의 형광은 상대적으로 높은 강도를 갖추고 있습니다. 이것은 주목해야한다, 다른 붉은 칼슘 2 + - 표시 염료가 없거나 현재 개발되고, 그 다른 뉴런과 뇌 영역에서 더 나은 또는 개선 된 결과를 제공 할 수 있습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을 업데이트<sup&gt; 2 +</sup빨간색 형광 칼슘을 사용하여 뇌 조직 조각에서 GFP 태그 뉴런의&gt; 신호<sup&gt; 2 +</sup&gt; 표시기 염료.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

뇌 내 정보 부호화의 기저 기전에 대한 지식이 비약적으로 증가했음에도 불구하고, ...에 관한 핵심적인 질문은 여전히 남아 있습니다.

본 절차의 전반적인 목적은 비녹색 형광 칼슘 지표 염료를 사용하여 뇌 절편 내 GFP 표지 뉴런의 자극 유발 칼슘 반응을 공간적 및 시간적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 특정 세포에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 뇌를 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로톰을 사용하여 조직 절편을 준비하는 것입니다.다음으로, 뇌세포가 염료를 흡수할 수 있도록 칼슘 지시 염료 로딩 용액을 슬라이스 위에 피펫으로 분주합니다. 마지막 단계는 공초점 현미경을 사용하여 형광 세포의 타임스탬프 기록을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 다색 칼슘 이미징 분석을 통해 GFP 태그가 지정된 뉴런의 칼슘 반응을 보여줍니다.기존의 공초점 현미경 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 적색 편이된 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하여 녹색 형광 GFP 표지 뉴런 내의 칼슘을 이미징할 수 있다는 점입니다. 적색 형광의 매우 큰 스토크스 이동(Stokes shift) 덕분에 단일 여기 파장을 사용하여 녹색 GFP와 적색 형광의 다색 분석을 수행할 수 있습니다. 우리는 녹색 형광 단백질이라는 유전적 형광 표지법을 통해서만 식별할 수 있는 뉴런의 칼슘 신호를 모니터링해야 하는 문제에 직면했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.이제 이 절차의 몇 가지 중요한 단계들을 시연하겠습니다. 가열된 한천 용액을 정사각형 페트리 접시에 1cm 높이로 부어 절차를 시작하십시오. 4% 한천 겔을 냉각 및 경화시킨 후, 1cm³ 크기의 블록으로 잘라 보관용 병에 넣습니다. 마우스를 안락사시킨 후, 외날 면도날을 사용하여 전두골부터 외후두융기까지 중앙 시상 방향으로 두피를 절개하십시오.이어서 절개한 두피를 먼저 주둥이 쪽 외측 방향으로 더 넓게 엽니다. 그다지 복측 방향으로 엽니다. 그런 다음 외측으로 두 번, 주둥이 쪽으로 한 번 더 절개합니다.작은 스프링 가위를 사용하여 대후두공 부위에서 두개골을 조심스럽게 절개하십시오. 이때 후두골, 간두정골 및 두정골이 분리되어야 합니다. 경막이 여전히 남아 있는 경우, 뇌 손상을 방지하기 위해 핀셋으로 조심스럽게 제거하십시오.다음으로 인편골, 전사골공 및 전두공을 제거합니다. 이제 뒤집힌 마이크로 스푼 스패튤러를 사용하여 뇌를 쉽게 제거하고 뇌신경을 절단할 수 있습니다. 뇌는 절단 방지 표면 위에 복측면이 아래로 향하도록 놓여야 합니다.외날 면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 이 직선 절단면은 관상면 뇌 절편 슬라이싱을 위해 뇌를 플레이트에 고정하는 기준면이 됩니다. 다음으로, 소량의 속경화 고성능 cyanoacrylate 접착제(순간접착제)를 사용하여 절단면이 아래로 가도록 뇌를 마이크로톰의 베이스 플레이트에 접착합니다.그 후, 뇌를 절편화하는 동안 지지하고 고정하기 위해 1 cubic centimeter 크기의 아가로스 겔 블록을 뇌의 복측에 부착하여 마이크로톰의 베이스 플레이트에 고정합니다. 접착제가 마르면, 6 °C의 차갑고 산소가 공급된 세포외 용액이 담긴 마이크로톰 수조에 플레이트를 넣습니다. 그런 다음 낮은 절단 속도로 뇌를 300 microns 두께의 절편으로 자르며, 전체 뇌가 절단될 때까지 관상면 뇌 절편을 수집합니다.이제 onic F1 27 분말에 DMSO 용액을 첨가하여 20%onic F1 27 DMSO 용액을 준비합니다. 다음으로, 용액을 2분 동안 직접 초음파 처리하여 용해시킵니다. 그 후, 50 µg의 세포 투과성 furred am이 들어 있는 튜브에 20%onic F1 27 용액 5 µL를 첨가합니다.피펫을 사용하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 혼합물에 45 µL의 extracellular solution을 추가하고 볼텍싱합니다. 간단히, 325 µL의 extracellular solution을 추가로 넣고 튜브를 3분 동안 더 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 산소화된 세포외 용액 1.156 milliliters를 첨가하여 최종 칼슘 지표 D 로딩 용액을 준비합니다. 관상면 뇌 절편을 산소화된 세포외 용액이 채워진 6-웰 세포 배양 플레이트로 옮기며, 웰당 최대 6개의 절편까지 넣습니다. 그런 다음, 뇌 절편이 손상되지 않도록 주의하며 챔버에서 산소화된 세포외 용액을 흡입하여 제거합니다.다음으로 각 웰에 칼슘 지시약 D 로딩 용액 750 µL를 직접 피펫팅합니다. 뇌 절편이 rore am을 포함한 용액으로 덮여 있어야 합니다. 그 후, 뇌 절편을 산소-이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C로 45분에서 60분 동안 배양합니다.배양 종료 후, 세포의 과적재를 방지하기 위해 칼슘 지시약 DI 로딩 용액을 신선한 산소 공급 세포외 용액으로 교체합니다. 자극으로 유도된 형광 신호의 변화를 모니터링하려면, fure red가 로딩된 뇌 슬라이스 중 하나를 기록 챔버로 옮겨 원하는 위치에 배치합니다. 챔버를 컨포컬 현미경 장치에 장착한 후, 산소 공급 세포외 용액으로 슬라이스를 10분 동안 관류하여 과잉의 세포외 칼슘 지시약 염료를 제거합니다.녹화 챔버에서 배출된 후, PERFUSE 8은 진공 병에 수집됩니다. 그런 다음 저배율 현미경으로 슬라이스를 관찰하십시오. 슬라이스의 방향을 기록하고, 슬라이스 내에서 관심 영역(본 사례의 경우 뇌의 시상하부 영역)을 찾으십시오.그 후, 고배율로 전환합니다. GFP 이미지를 수집함과 동시에 URA red 신호의 형광 강도를 확인하여 슬라이스 내에서 관심 세포를 찾습니다. URA red 형광 강도의 변화를 측정할 수 있으면서 두 형광체의 광퇴색이 일어나지 않는 값으로 레이저 출력을 조정합니다.다음으로, fure 및 GFP 신호를 수집하기 위해 0.5에서 2 Hz 사이의 속도로 이미지 획득을 시작합니다. 이 그림은 관상면 뇌 절편 내 GN, RHR Tau GFP 뉴런의 공초점 이미지를 보여줍니다. 이는 뇌 절편에 fure am을 로딩한 후 관찰되는 비교적 균일한 형광 신호이며, 이는 칼슘 지시약 염료가 로딩된 뉴런을 보여주는 병합 이미지입니다.다음은 서로 다른 시상하부 뇌 영역의 개별 GFP 표지 뉴런에서 체성 자극으로 유도된 칼슘 반응의 예시입니다. 서로 다른 시상하부 핵의 GN RHR 발현 뉴런 간의 뚜렷한 칼슘 신호는, 숙달된 이후에는 동일한 기간 동안 주어진 세포 내 칼슘의 총 변화량에 대한 추정치로서 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하여 비교할 수 있습니다. 이 기법은 적절하게 수행될 경우 칼슘 지시약 염료의 준비, 슬라이스 로딩 및 배양 시간을 포함하여 90분 이내에 완료할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

서골비기관(VNO)은 사회적 및 생식 정보를 전달하는 종내 화학 신호를 감지합니다. 본 연구진은 VNO 조직에서 G-CaMP2를 발현하는 형질전환 생쥐를 사용하여 Ca2+ 이미징 실험을 수행하였습니다. 이러한 접근 방식을 통해 수많은 페로몬 자극에 대한 서골비 뉴런의 복잡한 반응 패턴을 분석할 수 있습니다.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

출처: Bancroft, E. A., et al. 1차 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적 Ca2+ 플럭스와 그 하류 효과를 정량화합니다. J. Vis. Exp. (2020){{TAG_ 46}}이 비디오는 마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 지표(calcium indicator)를 발현하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 컨포칼 현미경으로 뉴런을 이미지화하여 자발적 및 신경전달물질에 의한 칼슘 활동 중 형광 강도의 변화를 추적합니다.

마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

우리는 전체 셀 패치 클램프 기록 및 2 광자 이미징 급성 뇌 조각에 신경 모 수석에 캘리포니아2 + 과도 기록 하는 방법 제시.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

여기에서 우리는 살아있는, 마취 실험실 마우스의 조야성 신경절 신경절을 드러내는 방법과 각성제를 맛보기 위하여 이 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위하여 칼슘 화상 진찰을 사용하는 방법을 제시합니다, 다른 각성제를 가진 다중 예심을 허용하. 이것은 어떤 신경 세포가 어떤 tastants에 반응하는지의 깊이 비교를 허용합니다.

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

본 프로토콜은 체세포 및 내장 자극에 대한 요추-6 DRG 뉴런의 앙상블의 반응을 측정하기 위한 생체 내 칼슘 이미징을 간략하게 설명합니다. 다른 자극에 반응하는 뉴런 간에 철저한 비교가 이루어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 침술과 같은 내장 통증 및 신체 자극의 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다.

생체 내 체세포 및 내장 자극에 대한 배근 신경절 뉴런의 반응에 대한 칼슘 이미징

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

이 프로토콜은 온전한 삼차신경절(TG) 뉴런의 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징을 설명합니다. 이 설명에는 TG 노출 수술, TG 뉴런의 생체 내 공초점 현미경 이미징, TG 뉴런 현미경 이미징 중 체세포 자극 적용 및 생체 내 GCaMP 칼슘 이미징 데이터 분석이 포함됩니다.

생체 내 온전한 삼차신경절의 일차 감각 뉴런 네트워크에서 신경 앙상블의 칼슘 이미징

학습하세요 하이포탈라무스 마우스 뇌 슬라이스에서 GFP 태그 뉴런의 칼슘 응답을 적색 형광 칼슘 지시약으로 공초점 현미경으로 촬영하는 방법. 이 기술은 다색 이미징 분석을 통해 뉴런 활동을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

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