Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답
August 24th, 2012
이 프로토콜에서는, 우리는 영상 칼슘의 최근 진행 상황을 업데이트 2 + 신호 2 + 표시기 염료.
이 절차의 전반적인 목표는 비녹색 형광 칼슘 지표 염료를 사용하여 뇌 절편에서 GFP 태그가 지정된 뉴런 모두에서 공간적으로, 시간적으로 자극에 의한 칼슘 반응을 모니터링하는 것입니다. 이것은 먼저 특정 세포에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 뇌를 추출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로톰으로 조직 절편을 준비하는 것입니다.
다음으로, 칼슘 지시약 염료 로딩 용액을 슬라이스에 피펫으로 주입하여 염료가 뇌 세포에 흡수될 수 있도록 합니다. 마지막 단계는 컨포칼 현미경을 사용하여 형광 세포의 타임스탬프 기록을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, GFP 표지된 뉴런의 칼슘 반응은 다색 칼슘 이미징 분석을 사용하여 표시됩니다.
컨포칼 현미경 검사의 기존하는 방법에 비 이 기술의 주요 이점은 우리가 적색편이 형광성 칼슘 지시자 죽을 사용하여 녹색 형광 GFP 기술 뉴런에 있는 칼슘을 이미지화해서 좋다 입니다. 더 적은 수의 적색의 큰 스트로크 이동을 통해 단일 여기 파장을 사용하여 녹색 GFP와 함께 적색 형광의 다색 분석을 수행할 수 있습니다. 우리는 녹색 형광 단백질인 유전적 형광 기술을 사용해야만 식별할 수 있는 뉴런의 칼슘 신호를 모니터링하는 문제에 직면했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.
이제 이 절차의 여러 가지 중요한 단계를 설명하겠습니다. 가열 된 한천 용액을 1cm 높이의 정사각형 페트리 접시에 붓는 것으로 절차를 시작하십시오.4 % 한천 젤을 냉각 및 경화 한 후 1 입방 센티미터의 블록으로 자르고 병에 넣어 보관합니다. 쥐의 목을 베인 후 한 쪽 면도날로 전두골에서 외부 후두 돌기까지 중앙 시상 방향으로 두피를 자릅니다.
그런 다음 절단된 두피를 먼저 앞 측면 방향으로 더 엽니다. 그런 다음 복부 방향으로. 그런 다음 두 개의 측면 절단과 한 개의 복부 절단을 만듭니다.
작은 스프링 가위가 있는 구멍에서 매그넘은 두개골을 조심스럽게 잘라냅니다. 이 순간, 후두, 두정골, 두정골을 분리해야 합니다. 경막 물질이 여전히 존재하면 뇌 손상을 방지하기 위해 집게로 조심스럽게 제거하십시오.
다음으로, 편평 뼈, 전방 사골 및 전두엽 구멍을 제거합니다. 이제 거꾸로 된 마이크로 스푼 주걱으로 뇌를 쉽게 제거할 수 있으며 뇌 신경을 절단할 수 있습니다. 뇌는 뇌의 복부 표면이 아래로 향하게 하여 절단 저항성 표면의 복부 쪽에 착지해야 합니다.
단일 가장자리 면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 이 직선 절단면은 관상 뇌 단면을 절단할 수 있도록 플레이트에 뇌를 장착하는 기초가 될 것입니다. 다음으로, 소량의 속경화 고성능 시아노아크릴레이트 접착제 슈퍼 접착제를 사용하여 마이크로톰의 바닥판에 절단면이 있는 뇌를 접착합니다.
그런 다음 뇌의 복부 쪽에 있는 1입방센티미터의 한천 젤 블록을 마이크로톰의 바닥판에 붙여서 자르는 동안 뇌를 지지하고 고정합니다. 결합이 건조된 후 플레이트를 섭씨 6도의 차가운 산소 세포외 용액이 들어 있는 마이크로톰의 수조에 넣습니다. 그런 다음 뇌를 낮은 절단 속도로 300미크론 두께의 조각으로 자르고 전체 뇌가 절단될 때까지 관상 뇌 조각을 수집합니다.
이제 onic F1 27 분말에 DMSO 용액을 첨가하여 DMSO 용액에서 20 % onic F1 27을 준비합니다. 그런 다음 2분 동안 용액을 직접 음파로 만들어 용해합니다. 그 후, 50 마이크로 그램의 세포 투과성 털이 많은 am의 튜브에 20 % onic F1 27 용액 5 마이크로 리터를 추가하십시오.
용액을 피펫과 혼합하십시오. 그런 다음 혼합물에 45마이크로리터의 세포외 용액을 넣고 와류로 만듭니다. 간단히 325마이크로리터의 세포외 용액을 추가로 추가하고 튜브를 3분 더 초음파 처리합니다.
초음파 처리 후, 1.156 밀리리터의 산소화 세포 외 용액을 첨가하여 최종 칼슘 지시약 D 로딩 용액을 얻습니다. 코로나 뇌 절편을 웰당 최대 6개의 절편까지 산소가 공급된 세포외 용액으로 채워진 6개의 웰 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 뇌 절편이 손상되지 않도록 주의하면서 챔버에서 산소가 공급된 세포 외 용액을 흡인합니다.
다음 피펫 750 마이크로 리터의 칼슘 지시약 D 로딩 용액을 각각에 직접 주입합니다. 글쎄요, 뇌 절편은 로어 암을 함유한 용액으로 덮여 있어야 합니다. 그 후, 산소 이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 45-60분 동안 조각을 배양합니다.
배양이 끝나면 칼슘 지시약 DI 로딩 용액을 산소가 공급된 새로운 세포외 용액으로 교체하여 세포에 과부하가 걸리지 않도록 합니다. 형광 신호에서 자극으로 유도된 변화를 모니터링하려면 적색으로 장전된 뇌 절편 중 하나를 기록 챔버로 옮기고 원하는 위치에 놓습니다. 컨포칼 현미경 설정에 챔버를 장착한 후 산소가 공급된 세포외 용액으로 슬라이스를 10분 동안 관류하여 과잉의 세포 외 칼슘 지시약 염료를 제거합니다.
레코딩 챔버를 나온 후 PERFUSE eight는 진공 병에 수집됩니다. 그런 다음 저배율로 현미경을 통해 슬라이스를 보십시오. 슬라이스의 방향을 기록하고 슬라이스의 관심 영역(우리의 경우 뇌의 시상하부 영역)을 찾으십시오.
그 후 고배율로 변경합니다. GFP 이미지를 수집하는 동시에 URA 적색 신호의 형광 강도를 확인하여 슬라이스에서 관심 세포를 찾습니다. URA 적색 형광 강도의 변화를 측정할 수 있는 값으로 레이저 출력을 조정하고 두 형광단의 표백을 방지합니다.
다음으로, fure 및 GFP 신호를 수집하기 위해 0.5 - 2 헤르츠 사이의 속도로 이미지를 획득하기 시작합니다. 이 그림은 관상 뇌 절편에서 GN, RHR Tau GFP 뉴런의 컨포칼 이미지를 보여줍니다. 이것은 뇌 절편에 fure am을 로드한 후 관찰된 비교적 균일한 형광 신호이며, 칼슘 지시약 염료가 로드된 뉴런을 보여주는 병합된 이미지입니다.
다음은 다양한 시상하부 뇌 영역에서 개별 GFP 태그가 지정된 뉴런에서 유도된 체세포 자극 유도 칼슘 반응의 예입니다. 서로 다른 시상하부핵의 뉴런을 발현하는 GN RHR 사이의 뚜렷한 칼슘 신호는 곡선 아래 면적을 같은 기간 동안 주어진 세포에서 칼슘의 총 변화에 대한 추정치로 사용하여 비교할 수 있습니다. 이 기술은 칼슘 지시 염료의 준비, 로딩 및 적절하게 수행되는 경우 슬라이스의 배양을 포함하여 90분 이내에 완료할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 뇌 슬라이스 내 GFP 태그가 붙은 뉴런의 칼슘 반응을 모니터링하기 위한 방법을 빨간색 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하여 설명합니다. 이 접근법은 자극에 대한 칼슘 신호의 공간적 및 시간적 분석을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 이미지 기술
배경
- 칼슘 신호 전달은 뉴런 기능에 중요합니다.
- GFP 태그가 붙은 뉴런은 뇌 조직에서 특정 시각화를 가능하게 합니다.
- 빨간색 형광 염료는 녹색 지시약에 대한 대안을 제공합니다.
- 공초점 현미경은 칼슘 역학의 고해상도 이미징을 가능하게 합니다.
연구 목적
- 뉴런의 자극 유발 칼슘 반응을 모니터링하는 것.
- 더 나은 대비를 위해 녹색이 아닌 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하는 것.
- 칼슘 신호의 다색 이미징 분석을 강화하는 것.
사용된 방법
- GFP를 발현하는 형질전환 마우스로부터 뇌 조직을 추출합니다.
- 마이크로톰을 사용하여 뇌 슬라이스를 준비합니다.
- 슬라이스에 칼슘 지시약 염료 로딩 용액을 도포합니다.
- 공초점 현미경을 통한 형광 세포의 타임스탬프 기록합니다.
주요 결과
- 뇌 세포에 의한 칼슘 지시약 염료의 성공적인 흡수.
- GFP 태그가 붙은 뉴런에서의 칼슘 반응 시각화.
- 다색 칼슘 이미징 분석의 효과적인 사용.
- 칼슘 신호 전달의 공간적 및 시간적 역학의 시연.
결론
- 이 방법은 뉴런의 칼슘 신호 전달을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다.
- 빨간색 형광 염료는 이미징 기능을 강화할 수 있습니다.
- 이 프로토콜은 뉴런 활동을 포함하는 다양한 연구에 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative imaging of calcium responses in genetically defined hypothalamic neurons enables precise interrogation of neurohormonal signaling pathways at the single-cell level. This approach addresses the challenge of isolating stimulus-induced activity in specific neuronal populations, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation. The method's compatibility with multicolor analysis facilitates robust, reproducible data for portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of stimulus-induced calcium flux in genetically identified neurons.
- Supports functional validation of neurohormonal targets within complex hypothalamic circuits.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating cell-type specific responses.
- Provides quantitative outputs for hypothesis-driven target selection.
Screening & Assay Development
- Establishes validated brain slice systems for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative calcium imaging readouts for assay standardization.
- Enables multicolor analysis, supporting multiplexed screening strategies.
- Improves assay scalability and platform reuse across neuronal subtypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional readouts with disease-relevant hypothalamic pathways.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of CNS targets.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in neuroendocrine programs.
- Enables comparative analysis across neuronal populations for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in CNS research pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in genetically defined neurons.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative calcium imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides area-under-curve and temporal response metrics for robust statistical comparison.
- Translational Research: Enables alignment of functional outputs with disease-relevant neuronal circuits.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform adaptable to diverse neuronal and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and genetically modified mouse models.
- Demands access to advanced microscopy and fluorescence analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of dye loading and imaging parameters.
- Adaptable to other neuronal populations and tissue types with protocol optimization.
- Dependent on the availability and performance of red-shifted calcium indicator dyes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:52
Solution Preparation and Brain Dissection
3:21
Coronal Hypothalamic Sections Slicing
4:30
Preparation of the Ca2+ Indicator Dye Loading Solution
6:35
Microscopy and Analysis
7:59
Results: Ca2+ Signals in TGFP Neurons of Mouse Hypothalamic Brain Slices
8:52
Conclusion
