Hypothalamic 마우스 뇌 슬라이스의 GFP 태그 뉴런의 영상 칼슘 응답

본 절차의 전반적인 목적은 비녹색 형광 칼슘 지표 염료를 사용하여 뇌 절편 내 GFP 표지 뉴런의 자극 유발 칼슘 반응을 공간적 및 시간적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 특정 세포에서 GFP를 발현하는 형질전환 마우스의 뇌를 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로톰을 사용하여 조직 절편을 준비하는 것입니다.

다음으로, 뇌세포가 염료를 흡수할 수 있도록 칼슘 지시 염료 로딩 용액을 슬라이스 위에 피펫으로 분주합니다. 마지막 단계는 공초점 현미경을 사용하여 형광 세포의 타임스탬프 기록을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 다색 칼슘 이미징 분석을 통해 GFP 태그가 지정된 뉴런의 칼슘 반응을 보여줍니다.

기존의 공초점 현미경 방법과 비교하여 이 기술이 갖는 주요 장점은 적색 편이된 형광 칼슘 지시약 염료를 사용하여 녹색 형광 GFP 표지 뉴런 내의 칼슘을 이미징할 수 있다는 점입니다. 적색 형광의 매우 큰 스토크스 이동(Stokes shift) 덕분에 단일 여기 파장을 사용하여 녹색 GFP와 적색 형광의 다색 분석을 수행할 수 있습니다. 우리는 녹색 형광 단백질이라는 유전적 형광 표지법을 통해서만 식별할 수 있는 뉴런의 칼슘 신호를 모니터링해야 하는 문제에 직면했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

이제 이 절차의 몇 가지 중요한 단계들을 시연하겠습니다. 가열된 한천 용액을 정사각형 페트리 접시에 1cm 높이로 부어 절차를 시작하십시오. 4% 한천 겔을 냉각 및 경화시킨 후, 1cm³ 크기의 블록으로 잘라 보관용 병에 넣습니다. 마우스를 안락사시킨 후, 외날 면도날을 사용하여 전두골부터 외후두융기까지 중앙 시상 방향으로 두피를 절개하십시오.

이어서 절개한 두피를 먼저 주둥이 쪽 외측 방향으로 더 넓게 엽니다. 그다지 복측 방향으로 엽니다. 그런 다음 외측으로 두 번, 주둥이 쪽으로 한 번 더 절개합니다.

작은 스프링 가위를 사용하여 대후두공 부위에서 두개골을 조심스럽게 절개하십시오. 이때 후두골, 간두정골 및 두정골이 분리되어야 합니다. 경막이 여전히 남아 있는 경우, 뇌 손상을 방지하기 위해 핀셋으로 조심스럽게 제거하십시오.

다음으로 인편골, 전사골공 및 전두공을 제거합니다. 이제 뒤집힌 마이크로 스푼 스패튤러를 사용하여 뇌를 쉽게 제거하고 뇌신경을 절단할 수 있습니다. 뇌는 절단 방지 표면 위에 복측면이 아래로 향하도록 놓여야 합니다.

외날 면도날을 사용하여 소뇌를 제거합니다. 이 직선 절단면은 관상면 뇌 절편 슬라이싱을 위해 뇌를 플레이트에 고정하는 기준면이 됩니다. 다음으로, 소량의 속경화 고성능 cyanoacrylate 접착제(순간접착제)를 사용하여 절단면이 아래로 가도록 뇌를 마이크로톰의 베이스 플레이트에 접착합니다.

그 후, 뇌를 절편화하는 동안 지지하고 고정하기 위해 1 cubic centimeter 크기의 아가로스 겔 블록을 뇌의 복측에 부착하여 마이크로톰의 베이스 플레이트에 고정합니다. 접착제가 마르면, 6 °C의 차갑고 산소가 공급된 세포외 용액이 담긴 마이크로톰 수조에 플레이트를 넣습니다. 그런 다음 낮은 절단 속도로 뇌를 300 microns 두께의 절편으로 자르며, 전체 뇌가 절단될 때까지 관상면 뇌 절편을 수집합니다.

이제 onic F1 27 분말에 DMSO 용액을 첨가하여 20%onic F1 27 DMSO 용액을 준비합니다. 다음으로, 용액을 2분 동안 직접 초음파 처리하여 용해시킵니다. 그 후, 50 µg의 세포 투과성 furred am이 들어 있는 튜브에 20%onic F1 27 용액 5 µL를 첨가합니다.

피펫을 사용하여 용액을 혼합합니다. 그런 다음 혼합물에 45 µL의 extracellular solution을 추가하고 볼텍싱합니다. 간단히, 325 µL의 extracellular solution을 추가로 넣고 튜브를 3분 동안 더 초음파 처리합니다.

초음파 처리 후, 산소화된 세포외 용액 1.156 milliliters를 첨가하여 최종 칼슘 지표 D 로딩 용액을 준비합니다. 관상면 뇌 절편을 산소화된 세포외 용액이 채워진 6-웰 세포 배양 플레이트로 옮기며, 웰당 최대 6개의 절편까지 넣습니다. 그런 다음, 뇌 절편이 손상되지 않도록 주의하며 챔버에서 산소화된 세포외 용액을 흡입하여 제거합니다.

다음으로 각 웰에 칼슘 지시약 D 로딩 용액 750 µL를 직접 피펫팅합니다. 뇌 절편이 rore am을 포함한 용액으로 덮여 있어야 합니다. 그 후, 뇌 절편을 산소-이산화탄소 세포 배양 인큐베이터에서 37 °C로 45분에서 60분 동안 배양합니다.

배양 종료 후, 세포의 과적재를 방지하기 위해 칼슘 지시약 DI 로딩 용액을 신선한 산소 공급 세포외 용액으로 교체합니다. 자극으로 유도된 형광 신호의 변화를 모니터링하려면, fure red가 로딩된 뇌 슬라이스 중 하나를 기록 챔버로 옮겨 원하는 위치에 배치합니다. 챔버를 컨포컬 현미경 장치에 장착한 후, 산소 공급 세포외 용액으로 슬라이스를 10분 동안 관류하여 과잉의 세포외 칼슘 지시약 염료를 제거합니다.

녹화 챔버에서 배출된 후, PERFUSE 8은 진공 병에 수집됩니다. 그런 다음 저배율 현미경으로 슬라이스를 관찰하십시오. 슬라이스의 방향을 기록하고, 슬라이스 내에서 관심 영역(본 사례의 경우 뇌의 시상하부 영역)을 찾으십시오.

그 후, 고배율로 전환합니다. GFP 이미지를 수집함과 동시에 URA red 신호의 형광 강도를 확인하여 슬라이스 내에서 관심 세포를 찾습니다. URA red 형광 강도의 변화를 측정할 수 있으면서 두 형광체의 광퇴색이 일어나지 않는 값으로 레이저 출력을 조정합니다.

다음으로, fure 및 GFP 신호를 수집하기 위해 0.5에서 2 Hz 사이의 속도로 이미지 획득을 시작합니다. 이 그림은 관상면 뇌 절편 내 GN, RHR Tau GFP 뉴런의 공초점 이미지를 보여줍니다. 이는 뇌 절편에 fure am을 로딩한 후 관찰되는 비교적 균일한 형광 신호이며, 이는 칼슘 지시약 염료가 로딩된 뉴런을 보여주는 병합 이미지입니다.

다음은 서로 다른 시상하부 뇌 영역의 개별 GFP 표지 뉴런에서 체성 자극으로 유도된 칼슘 반응의 예시입니다. 서로 다른 시상하부 핵의 GN RHR 발현 뉴런 간의 뚜렷한 칼슘 신호는, 숙달된 이후에는 동일한 기간 동안 주어진 세포 내 칼슘의 총 변화량에 대한 추정치로서 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하여 비교할 수 있습니다. 이 기법은 적절하게 수행될 경우 칼슘 지시약 염료의 준비, 슬라이스 로딩 및 배양 시간을 포함하여 90분 이내에 완료할 수 있습니다.