의 세포 구체적인 분석 Arabidopsis 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

본 실험 절차의 전체적인 목표는 잎에서 특정 세포 유형의 프로토플라스트 집단을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 잎의 특정 세포 유형에서 GFP를 발현하는 식물을 재배함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 잎을 수확하고 효소 소화를 이용하여 프로토플라스트를 생성하는 것입니다.

다음으로, 형광 활성화 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting 또는 FACS)을 사용하여 원형질체를 여과하고 분류합니다. 마지막 단계는 형광 현미경을 사용하여 분류의 정확성을 확인하는 것입니다. 최종적으로, 분류된 원형질체는 세포 유형 특이적 유전자 발현 분석, 단백질체 분석 또는 대사 프로파일링에 사용될 수 있습니다.

형광 활성 세포 분류법은 이전에 뿌리에 성공적으로 적용되었으나, 여기서는 잎 세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이 방법의 적용 전 GFP 표지는 엽록소 형광의 간섭으로 인해 제한적이었습니다. 세포 분류 중에 발생할 수 있는 광범위한 생리적 변화를 최소화하기 위해서는 신속하면서도 세심한 시료 준비가 매우 중요하므로, 이 방법의 시각적 시연이 필수적입니다.

일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 셀 소터(cell sorter)를 설정하는 방법이나 정확한 소팅 여부를 확인하는 방법을 잘 모르기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 방법은 식물 시스템 생물학 분야의 주요 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 잎과 같이 복잡한 다세포 기관에서 유전자 조절 네트워크를 식별할 때 발생하는 문제는 서로 다른 세포 유형이 서로 다른 유전자 그룹을 발현한다는 점입니다.

전체 잎의 수확 분석에서는 이러한 유전 정보가 소실됩니다. 이에 따라 해당 절차를 시연하겠습니다. 저와 함께 본 실험실에서 기술 지원을 담당하는 Ellison As와 Sanjeev Kuma가 함께하겠습니다. 먼저, 9 cm 원형 페트리 접시에 프로토 플래팅 효소와 전사 및 RNA 억제제가 포함된 용액 A 20 mL를 채웁니다.

그 다음, 여기에 표시된 샘플과 같이 단일 잎 이상의 잎을 포함하는 샘플을 위해 원하는 잎 재료를 채취합니다. 잎을 최대 15장까지 겹쳐 쌓습니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 잎을 1 mm 너비의 조각으로 자릅니다.

평집게를 사용하여 잎 조각들을 즉시 페트리 접시에 옮긴 후, 조각들을 부드럽게 분리하고 샘플을 5분씩 두 번 진공 침투시킵니다. 다음으로, 페트리 접시를 상온에서 90 RPM으로 설정된 궤도 쉐이커 위에 올려놓고 3~4시간 동안 원형질 분해 샘플을 처리합니다. 배양하는 동안 30분 간격으로 집게를 사용하여 잎 조각들이 서로 떨어지도록 분리해 줍니다.

소화 과정 후, 원형질체 용액을 70 micron 셀 스트레이너를 통해 50 milliliter 튜브에 조심스럽게 여과합니다. 잎 조각들을 제거하기 위해, 조각들은 걸러지고 원형질체만 통과하게 됩니다.

이제 4 mL의 용액 A를 사용하여 잎 조각들을 부드럽게 헹구고, 세척액을 50 mL 튜브에 수집하십시오. 그런 다음 원형 바닥 튜브에 프로토플라스트 현탁액을 옮기고, 상온에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리하십시오. 펠렛이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 최대한 부드럽게 흡입하여 제거한 후, 동일한 원심분리 조건에서 5 mL의 용액 A로 프로토플라스트를 세척하십시오.

마지막으로, 부유물을 제거한 후 cutoff P 1000 팁을 사용하여 분리 직전에 적절한 부피의 용액 A로 PROTOPLASTS를 재현탁합니다. 절단되지 않은 P 1000 팁을 사용하여 Protoplasts 용액 내의 응집물을 풀어줍니다. 50 micron fillon 필터를 통해 원심분리 튜브로 protoplasts를 여과하여 세포를 추가로 해리시킵니다.

그런 다음 세포 공급 노즐의 막힘을 방지하기 위해 세포 용액을 적절하게 희석하십시오. 최적의 세포 공급 조건을 결정한 후, 488 nm Argonne 레이저를 사용하여 530/40 밴드패스 필터 대비 580/30 밴드패스 필터의 출력을 분석함으로써 GFP 양성 원형질체를 식별하십시오. GFP 양성 원형질체는 530 신호는 높고 580 신호는 낮은 군집에서 나타납니다.

low 530, low 580 집단에 있는 non GFP 원형질체와 달리, 사멸하거나 죽어가는 원형질체 및 파편은 high 580 집단에 나타납니다. 형광 현미경으로 분리된 원형질체를 시각화하기 위해, 분리 후 원형질체를 용액 A의 최소 8배 부피로 직접 분리하십시오. 원심 분리를 통해 원형질체를 농축하며, 원형질체는 용액 A의 8배 부피로 분리하여 수집한 후 형광 현미경으로 시각화하여 농축 여부를 확인할 수 있습니다. 첫 번째 이미지는 공변세포에서 GFP를 발현하는 TP 382 세포주의 농축 사례를 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 증식 전후에 얻은 수율의 예시는 이 표에 요약되어 있습니다.

500 picograms에서 50 nanograms 사이의 획득량은 ovation PICO WTA 시스템을 통한 증폭 및 이후의 quantitative PCR, next generation sequencing 또는 microarray 분석에 충분한 양입니다. 다음 일련의 이미지들은 방금 설명한 방법으로 분리 및 분류된 다양한 원형질체 세포주를 보여줍니다. 이 첫 번째 원형질체들은 KC 2 74의 잎 횡단면에서 유래되었습니다.

잎의 모습은 GFP가 관다발 조직에서 발현됨을 보여줍니다. 이 원형질체들은 KC 4 64 잎에서 분리되었으며, KC 4 64 잎의 횡단면을 통해 GFP 발현이 A dal 표피에서 나타남을 확인할 수 있습니다. 마지막으로, 이 원형질체들은 TP 3 82 잎의 TP 3 82 잎에서 유래되었습니다.

여기서는 GFP가 공변세포에서 발현되었습니다. 580 ± 30 nm 대역 통과 필터와 530 ± 40 nm 대역 통과 필터의 출력값을 보여주는 전형적인 FACS 획득 도트 플롯이 제시되어 있습니다. 표시된 소팅 게이트는 소팅 과정에서 일반적으로 사용되는 범위입니다.

억제제가 없는 상태에서 Col-4 잎 유래 원형질체를 이용해 작성한 이 첫 번째 도트 플롯은 530 저강도, 580 저강도인 단일 군집을 보여줍니다. 반면, 억제제가 있는 상태에서 야생형 Col-4 잎 유래 원형질체를 이용해 작성한 이 도트 플롯은 억제제로 인한 스트레스 및 염색으로 인해 발생하는 580 형광의 이동을 보여줍니다. 이 도트 플롯들은 각각 KC74, KC464 및 TP382 라인의 잎 유래 원형질체를 나타냅니다.

이 샘플들은 억제제 존재 하에 분석되었으며, GFP가 high 530 및 low 580 집단에 포함되어 있음을 보여주었습니다. 이 대표적인 정량적 PCR 실험을 위해, 먼저 각 분획 유형별로 샘플을 얻었습니다. 그 후 ovation PICO WTA 시스템과 정량적 PCR을 사용하여 샘플을 증폭시켰습니다.

GFP 특이적 프라이머를 사용하여 분석을 수행하였습니다. 표시된 값 중 빨간색은 가장 높은 값, 녹색은 가장 낮은 평균값 또는 단일 값을 나타내며, actin 2를 참조 유전자로 사용한 결과는 노란색 가로 막대로 표시되었습니다. 이 결과는 분리된 분획 내 GFP 세포 함량에 대한 광학적 평가를 재검증한 것입니다.

high 530 low 580 집단에서 GFP 발현 수준이 가장 높게 측정되었습니다. high 530 high 580 집단은 GFP 발현이 약 1000배 더 낮게 나타난 반면, low 530 low 580 및 low 530 high 580 집단은 대조군인 전체 잎 및 비분리 원형질체 집단과 유사한 낮은 수준의 GFP 발현을 보였습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 식물부터 분리된 세포 집단을 얻기까지 4~5시간 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 분리 정확도를 유지하기 위해 세포 분리기를 지속적으로 모니터링하고 필요 시 다시 보정하는 것이 중요합니다.

본 절차를 확인하였습니다. 서로 다른 세포 유형의 유전자 발현 수준을 비교 및 대조하기 위해 마이크로어레이 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이제 이 기술이 개발되었으므로, 우리는 다양한 발달 단계에 있는 특정 잎 세포 유형의 유전자 발현을 분석하고 있으며, 이를 농학 프로젝트에서 생성된 잎 전체의 데이터와 비교할 예정입니다.

이 영상을 시청한 후에는 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 이용하여 잎의 단일 세포 유형을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.