Glycosphingolipid 항원의 대량 Spectrometric 분석

이 절차의 전반적인 목표는 면역 기관 및 세포에서 글리코 핑거 지질 항원의 발현 프로파일에 대한 통찰력을 얻기 위해 특이적이고 민감한 방법을 만드는 것입니다. 이는 먼저 세포에서 글리코 핑(glyco fing) 지질을 추출하여 이루어집니다. 두 번째 단계는 산성 글리코 핑갈 지질에서 중성 글리코 핑거링 지질을 분리하는 것입니다.

중성 지질에서 인지질이 제거된 후, 추출된 글리코 지질은 헥소스의 모든 하이드록실 그룹이 메톡시기로 대체되는 파마 메틸화 반응을 사용하여 화학적으로 변형됩니다. 궁극적으로 추출된 글리코 핑거 지질은 매트릭스 보조 레이저, 탈흡착 이온화, 비행 시간, 질량 분석법, 약식 금형 TOF MS 및 철 트랩 질량 분석법을 사용하여 분석됩니다. 분석용 HPLC 및 항체 염색과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 질량 분석법이 더 민감하고 정확한 거대 분자를 측정한다는 것입니다.

이 방법은 낮은 농도의 당지질 항원 측정과 같은 면역학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 GD 2 및 global H와 같은 많은 당지질 항원이 암 바이오마커로 발현되기 때문에 암 치료 또는 진단으로 확장됩니다. 저는 DA pen Zoe 교수의 연구실에서 학부생으로 절차를 시연할 것입니다.

David Hawk 박사는 이 절차를 시작하기 전에 질량 분석기 기기에 대한 절차를 수행할 것입니다. 쥐 호염병 백혈병 세포를 혈액 세포 분석기로 세포를 계수하는 준비. 트리퍼 블루 염색 후 세포의 생존율은 95% 이상이어야 합니다.먼저 클로로포름 메탄올의 1:1 부피 비율 6ml를 세포에 첨가하여 지질을 추출합니다.

혼합 극성 용매로 1-2시간 동안 광범위한 초음파 처리를 사용합니다. 서면 절차에 설명된 대로 최종 추출로 준비된 이소프로판올 헥산 물의 55-25-20 부피 비율로 이 절차를 두 번 반복합니다. 6 밀리리터의 클로로포름, 메탄올을 첨가하고 초음파 처리합니다.

4, 5 분 동안 000 RPM에서 불용성 물질을 펠릿으로 만들기 위해 원심 분리로 초음파 처리를 따르십시오. 세나를 당긴 후 스피드 백에서 4시간 동안 건조시킵니다. 산성 지질에서 중성 지질을 분리하려면 de A e sedex A 20의 작은 컬럼에 음이온 교환 크로마토그래피를 사용합니다.

이 비디오와 함께 제공되는 서면 절차에 설명된 대로 DEAE SEDEX A 25를 준비한 후 유리벽과 9인치 파스타 피펫을 사용하여 컬럼을 준비합니다. 수지 가루가 기둥을 통과하지 않도록 유리벽을 조심스럽게 포장하십시오. 컬럼을 건조시키지 않고 9인치 과거 공기 피펫의 목에 DEAE sedex A 25 수지를 추가합니다.

구멍에 수지가 없는지 확인하십시오. 초음파 처리를 용해하고 클로로포름 메탄올 물의 30 내지 60 대 8 부피 비율로 지질을 재현탁하고 용해 된 샘플을 컬럼에 적용한다. 중성 지질은 컬럼을 통해 흐르는 반면 하전된 지질은 컬럼에 남아 산성 지질 분획을 메탄올 중 8ml의 아세트산나트륨으로 용리화합니다.

여기에 표시된 것은 아세트산나트륨으로 처리한 후 건조된 음전하를 띤 분획입니다. 투석 후 슬라이드 Eliza 투석 카세트를 사용하여 투석으로 분획을 탈염합니다. 고성능 박막 크로마토그래피 또는 H-P-T-L-C를 사용하여 지질의 예비 분석을 수행하기 전에 분획을 빠르게 건조시켜 H-P-T-L-C를 수행하여 분리된 중성 글리코 핑거 지질 또는 gsl을 클로로포름 메탄올 용매의 1:1 부피 비율로 200마이크로리터에 용해시킵니다.

실리카겔 박층 크로마토그래피 플레이트에 샘플을 로드합니다. 플레이트를 건조시킨 후 클로로포름 메탄올 물의 60:35:8 부피 비율로 플레이트를 실행합니다. 산성 지질 또는 강글리오사이드에 대해 섭씨 300도의 Arsenal Sulfuric acid로 글리코 핑거 지질을 시각화합니다.

55 대 25 대 20의 부피 비율의 이소프로판올 헥산 물을 용매로 사용하고 동일한 방식으로 H-P-T-L-C에서 실행합니다. 이 시점에서 중성 분획에는 중성 글리코 핑거 지질뿐만 아니라 인지질도 포함되어 있으며, 이는 아세틸화 및 파라 아세틸화 반응에 의해 제거되어야 합니다. 먼저 DEAE sedex A 25 통과 분획을 4 시간 동안 냉각과 함께 속도 VAC에서 건조시킵니다.

샘플이 건조된 후 다시 속도에 넣고 4시간 더 건조시킵니다. 잔류 물이 파라 아세틸화 반응을 방해하므로 이러한 샘플이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 하룻밤 동안 섭씨 37도의 어둠 속에서 배양하는 최대 200마이크로그램의 글리코 핑 지질의 파라 아세틸화 반응을 위해 PELINE 1ml와 아세트산 0.5mL를 샘플에 추가합니다.

GSL이 완전한 증발을 보장하기 위해 1ml의 톨루엔을 첨가하고 3시간 동안 스피드 진공으로 파라 물질을 건조시키는 것이 더 나은 온도입니다. 샘플이 여전히 완전히 건조되지 않은 경우 여기에 표시된 건조될 때까지 VAC를 가속화합니다.amp건조된 paracetic 샘플입니다. 한편, 먼저 섭씨 110도의 오븐에서 배양하여 플로리스 바다표범 구슬을 완전히 건조시켜 Floris 바다표범 컬럼을 준비합니다.

그런 다음 유리솜이 있는 파스타 피펫에 비드를 목까지 채우고 굴뚝 세포 컬럼에서 1 2 디 클로로 Ethan Hexane 용출의 4:1 부피 비율로 평형을 이루어 유리솜으로 파스타 피펫의 컬럼을 준비합니다. 용매의 급격한 휘발성으로 인해 컬럼이 건조될 수 있습니다. 따라서 모든 용매 혼합물은 컬럼을 실행하기 전에 준비해야 합니다.

용리 중에는 컬럼을 중지할 수 없기 때문입니다. 퍼셋 샘플을 1 밀리리터에 1 2 디 클로로 ETH 에단 헥산의 4 : 1 부피 비율로 적용합니다. 6ml의 동일한 용매로 컬럼을 세척한 다음 10ml의 2개의 디클로로 에탄 용리액을 세척합니다.

1 2 디염소 아세톤의 1 대 1 부피 비율의 6 밀리리터를 가진 중성 percet GSL. 이 단계는 퍼셋 글리코 핑거링 지질은 플루오롤 컬럼에 결합하는 반면 퍼셋 인지질은 결합하지 않기 때문에 글리코 핑거링 지질에서 퍼셋 인지질을 제거합니다. 분획을 2시간 동안 빠르게 다시 건조시킨 후 실온에서 3시간 동안 0.5몰 나트륨, 메혼 산화물 2밀리리터 및 메탄올 2밀리리터로 탈아세틸레이트합니다.

배양 후, 3 밀리리터의 메탄올, 아세트산으로 혼합물을 중화하고 투석으로 디젤을 속구하여 건조시키고 건조 된 제품을 3 밀리리터의 물에 용해시키고 슬라이드 Eliza 투석 카세트에 주입 한 후 24 시간 동안 물에 대한 투석을 실시하고, 물을 적어도 두 번 변경하여 샘플이 완전히 건조 될 때까지 투석 된 gsl을 스피드 VAC으로 건조시킵니다. 먼저 특별한 건조 조건이나 화학 후드의 불활성 가스 분위기를 사용하지 않고 150 마이크로 리터의 디메틸 설 폭사이드에서 스크류 탑과 테프론 라이너가있는 유리관에 GSL을 도입하고 수산화 나트륨 입자에서 수산화 나트륨 분말을 유봉으로 화학 모르타르에서 분쇄하여 수산화 나트륨 분말을 준비합니다. 다음으로, 수산화나트륨 분말을 주걱으로 샘플 용액에 첨가합니다.

그런 다음 100마이크로리터 Hamilton 주사기로 80마이크로리터의 IO 메탄을 추가합니다. 2 밀리리터의 물로 메틸화 반응을 담금질한 후 1 시간 동안 실온에서 혼합물을 흔들어 2 밀리리터의 디클로로 메탄을 첨가하여 파마 메틸화 생성물을 추출합니다. 당지질은 낮은 단계인 디클로로메탄 단계에 있으므로 위쪽 단계는 새로운 유리관으로 전달될 수 있습니다.

그런 다음 perm 메틸화 생성물을 클로로 메탄으로 다시 추출하여 총 3회 추출할 수 있습니다. 결합 된 디 클로로 메탄 추출물을 2 밀리리터의 물로 3 회 세척하고, 최종 세척 후 각 세척 후 상부 수성상을 버리고 샘플을 새 튜브로 옮기고 건조시킵니다. 그런 다음 speed vac을 사용하여 샘플을 100-200마이크로리터의 메탄올에 용해시켜 서면 절차에 설명된 대로 수행된 질량 분석 분석을 수행하고, 샘플을 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 단백질체학 시설에 제출하고, MALDI에 의해 MS MS 질량 분석기와 이온 트랩 LTQ 질량 분석기로 분석했습니다.

여기에 표시된 것은 NKT 세포에 글리코 핑거 지질 항원을 제시하는 항원 제시 세포 유형인 랫드 백혈병 세포주 RBL의 글리코 핑거 지질에 대한 MALDI MS 분석의 예입니다. 이온은 글리코 핑거 지질 합성을 억제하는 약물로 처리된 RBL 세포의 특정 글리코 핑거링 지질 구조에 할당될 수 있습니다. 모든 글리코 핑거 지질의 현저한 감소가 관찰되었습니다.

구조적 이성질체는 구별할 수 없습니다. Applied Biosystems 4, 700의 MSMS 용량은 MS 1 이온을 MS 2 단편으로 단편화하여 제한된 구조 정보를 생성할 수 있습니다. 그러나 MS 2 분석은 올리고당 이성질체를 구별하기에 충분하지 않은 경우가 많은 반면, 글리코 핑거 지질에 대한 이온 트랩 MS 분석을 통해 올리고당 이성질체를 연구하여 이러한 이성질체를 검출할 수 있습니다.

표준 IGB 3 및 GB 3은 이 특성에서 나타난 바와 같이 차이가 발견될 때까지 여러 차례의 단편화로 분석되었습니다. IGB 3 또는 GB 3의 다른 비율이 섞일 때 IGB 3 또는 GB 3에서 파생된 이온의 MS 4 단면도는, 각 이성질체에서 파생된 서명 이온의 이온 풍부도에 기초를 두어 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 여기에 제시된 예에서 IGB 3 및 GB 3은 표준과 비교하여 구별할 수 있습니다.

이 스펙트럼은 1 3 2 5의 MS 4 분석을 나타내며, GB 3 및 IGB 3의 IMR을 나타내는 분자 철, IGB 3에 대한 3 개의 서명 이온과 GB 3에 대한 서명 이온이 발견되어 두 이성질체의 혼합물이 존재함을 시사합니다. IGB 3 대 GB 3의 비율은 표준 곡선과 비교하여 계산되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 당지질의 프로 메틸화 전에 크로마토그래피 중에 당지질을 완전히 회복해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

정제하는 동안 최소 80마이크로그램의 당지질이 회수되었는지 확인하십시오. 이 동영상을 시청한 후에는 반정량적 질량 분광법(semi-quantitative mass spectometry method)으로 당지질을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 당지질 추출, 중성 및 산성 분획으로의 분리, 파마 메틸화 반응에 의한 변형, 변형된 당지질을 질량 분광 측정 시설에 제출하는 주요 단계를 마스터하게 됩니다.

one two di chloro ethane chloroform, chlor acetic acid 및 I oto methane으로 작업하는 것은 발암성에 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑 및 실험실 가운과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 규칙을 존중하고 발견을 즐기십시오.