Name: Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 학습하세요 연골세포에 동적 기계적 압축 하중을 적용하여 콜라겐과 프로테오글리칸 합성을 평가하는 방법을. 아가로오스 하이드로겔을 사용한 이 기법은 연골 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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1. 기본 관절 Chondrocytes의 절연 동물 관절의 관절 표면에서 수확 10-15 전체 두께 연골의 조각 (로컬 abbatoir에서 얻은 skeletally 성숙 소의 손바닥 뼈 - phalangeal 공동을 지정할 수). <ol><li> 37 번 2 시간에 대한 햄의 F-12 (w / V)에서 0.5 % 프로테아제의 20 ML에 100mm 페트리 접시 및 배양 ° C.의 장소 연골 슬라이스 햄의 F-12 문화 미디어에 세 번 헹구고, 0.15 %의 Collagenase의 20 ML을 품다 37 번 밤새 햄의 F-12 문화 미디어 ° C.에 </li><li> 깨끗한 그릇에 200 메쉬 스크린 필터를 통해 세포 현탁액을 필터링 할 수 있습니다. 햄의 F-12의 5 ML과 필터를 깨끗이 씻어 요리에 추가 할 수 있습니다. 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 햄의 F-12의 10 ML과 페트리 접시를 씻어과 원뿔 튜브에 추가 할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 6-8 분 동안 600-800 rcf에있는 튜브를 원심 분리기. </li><li> 일을 방해하지 보장 표면에 뜨는을 대기음전자 세포 펠렛과 햄의 F-12 문화 미디어 40 ML에 다시 - 일시 중지합니다. </li><li> 6-8 분에 600-800 rcf에있는 튜브를 원심 분리기. </li><li> 3 회 총에 대한 단계 1.4 1.5 두 번 더 반복합니다. 전에 세 번째 시간 centrifuging에, 교반을 통해 펠릿을 resuspend와 셀 계산을위한 500 μl 나누어지는을 구하십시오. </li><li> hemacytometer와 역 가벼운 현미경으로 Trypan 파랑 제외 방법 9를 사용 가능한 셀을 계산합니다. </li><li> 표면에 뜨는을 대기음하고 원하는 심는 밀도를 두 배로 햄의 F-12의 미디어 볼륨에서 펠렛을 다시 일시 중지 (예 : 20 × 10 10 × 10 6 세포 / 캡슐화 한 후 ML의 최종 농도 6 셀 / ML). </li></ol> 2. Chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 캡슐화 <ol><li> 열 0.8 g autoclaved 유형 VII 아가로 오스 용해 ° C까지 120 세트 핫 플레이트에 살균 1X PBS (산도 7.4)의 20 ML 인치 일단 용해, ° C보다 높은 온도로 60 열을 낮출 wil난 세포 생존에 영향을 미칩니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 철저하게 아가로 오스 (최종 2퍼센트 아가로 오스의 히드로 겔에 대한 예 4퍼센트 아가로 오스 정지)의 두 원하는 농도로 세포 현탁액의 동등한 볼륨을 섞는다. 그들은 세포 생존에 영향을 미치는 피로 수명을 만들 수 있으므로 큰 거품의 생성을 피하십시오. </li><li> 조심스럽게 나누어지는 10 60mm 직경 페트리 접시에 chondrocyte - 아가로 오스 혼합물의 ML, 큰 거품의 생성을 피하면서. </li><li> gelled 때까지 실온에서 30 분에 서 보자. </li><li> 많은 chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 샘플로 4mm 생검 펀치를 사용하여 (일반적으로 20-30) 필요에 따라 얻습니다. </li><li> 마이크로 미터를 사용하여 대표 시료의 물리적 인 크기를 (직경 높이) 측정하고 기록합니다. 구조는 샘플 높이 차이가 큰 2 %였다 지역에서 얻은 샘플을 폐기, 높이 약 5mm해야합니다. </li><li> 새로운 60mm 페트리 접시와 보충에 샘플을 전송전체 미디어의 10 ML (20 MM HEPES, 100 μg / ML 아스코르브 산, 그리고 배 항생제 / antimycotics와 햄의 F-12 문화 미디어 등 20% 태아 소 혈청)과. </li></ol> 3. Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계 자극 및 Radiolabelling <ol><li> 압축 장비의 금속 구성 요소를 압력솥. 70 % 에탄올 (야간) 및 UV 빛 (적어도 15 분 용)과 플라스틱 구성 요소를 살균. </li><li> 24 잘 문화 판의 우물에서 장소 12 멸균 플라스틱 유지 링 (구조 직경보다 큰 내부 직경) (N = 6, 샘플 및 컨트롤을), 이상 떨어지는 집게를 사용 구조를 유지합니다. </li><li> 집게를 사용 조심스럽게 유지 링에 각각 확보, 페트리 접시에서 24 잘 판에 chondrocyte - 아가로 오스의 hydrogels를 전송할 수 있습니다. </li><li> 전체 미디어 400 μl (예를 들면 20% 20 MM HEPES, 100 μg / ML의 아스코르브 산으로 햄의 F-12 문화 미디어 FBS 및 전송잘 각 샘플에) 항생제 / antimycotics 2 배. </li><li> 살균 압축 장비 (그림 1) 조립 및 세트 나사와 platens을 확보. 24 잘 문화 판에 압축 장비를 연결합니다. </li><li> 플래 튼 - 히드로 겔 연락처 (제로 변형 상태)를 구축하기 위해 세트 나사를 해제하고 다시 고정하십시오. </li><li> 마하-1 Micromechanical 테스트 시스템으로 조립 압축 장비를로드합니다. 세트 나사와 장소에서 위치 핀과 잠금을 통해 수직 단계에 보안 장비. 간격 지그를 제거합니다. </li><li> 주파수 (예 : 1 Hz에서) 및 기간 또는 사이클의 수 (60 분에 예를 들어 시간 간격까지), 원하는 진폭 (샘플의 원래 높이를 기준으로 예를 들어 10 %의 변형 진폭)에서 동적 압축 하중을 적용합니다. </li><li> 기계 자극 완료되면, 간격 지그를 대체 위치 핀 세트 나사를 풀어 마하-1 Micromechanical 테스트 시스템에서 압축 장비 및 문화 판을 제거합니다. </lI&gt; <li> Radiolabel 셀 - 히드로 겔 원하는 동위 원소 (chondrocyte 특정 콜라겐 합성과 [35 S] - 유황 proteoglycan 합성을위한에 대한 예 [3 H]-프롤린 단백질 라벨) 5 μCi으로 미디어를 보완하여 구조. </li><li> 37에서 24 시간에 대한 방사성 동위 원소 표지 된 구조를 길러 ° C, 5 % 2 10 CO. </li><li> 방사성 동위 원소 표지 된 히드로 겔 구조를 수확하고 비법 인 동위 원소를 제거 할 1X PBS (산도 7.4)에서 3 번 씻어. papain (20 MM의 암모늄 아세테이트 40 μg / ML, 65에서 1 ㎜ ethyldiaminetetraacetic 산 2 밀리미터 dithiothreitol ° C 72 시간 용)를 사용하여 다이제스트 샘플. </li><li> PicoGreen 염료 분석 11, 법인의 동위 원소 활동, 12,13 즉시 다음 papain을 소화을 계산 β-액체 섬광에 의해 DNA의 콘텐츠에 대한 표준화를 사용하여 DNA 콘텐츠에 대한 분석 요약. </li></ol> 참고 : 방사성 물질의 구입 및 처분 (폐기물 동위 원소 및 항목연락처 방사성 물질에 와서 도움이 될 수 있도록 () 및 / 또는 정부) 정책과 방사성 물질의 안전한 취급 및 폐기 절차 관련 기관을 준수해야합니다. 4. 대표 결과 소 관절 chondrocyte - 아가로 오스 hydrogels 구조 (10 × 10 6 세포 / ML 캡슐화 된 셀과 2퍼센트 아가로 오스)는 기계적으로 20-60 분 (또는 1200에 3600 사이클 1 Hz의 주파수 10 % 압축 응력의 진폭에 자극했다 ) 및 방사성 동위 원소의 설립에 의한 DNA 콘텐츠 및 세포 외 기질 합성에 assayed. DNA와 세포 외 기질 합성은 복용에 의존 방식으로 영향을했습니다. 자극의 60 분 (그림 2) 아무런 영향을 전시하지 반면, DNA 내용은, 자극의 20 ~ 30 분 (P &lt;0.01)의 결과로 상당한 35 % 감소 전시. 연골 특정 콜라겐과 proteoglycan 합성 ([3 H]-프롤린 및 결정각각 [35 S] - 유황 설립은) 전혀 관찰 할 수있는 효과를 전시하지 자극 60 분 (그림 3)과 자극을 20 ~ 30 분 (P &lt;0.01)에 대한 응답으로 약 60 %의 상당한 증가를 전시. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="그림 1" /> . chondrocyte - 아가로 오스 구조를 촉진을위한 맞춤식 동적 압축 장비의 그림 1 도식 왼쪽 :. 조립 장비 마우스 오른쪽 :. 개별 구성 요소를 보여주는 뷰를 폭발했다. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="그림 2" /> chondrocyte - 아가로 오스의 DNA 콘텐츠에 그림 2. 변경은 기계적으로 20-60 분 1 Hz에서 10 % 압축 변형 진폭 (± SEM, N = 6/group을 의미)에서 자극 hydrogels. chondrocyte - 아가로 오스의 세포 외 기질 합성 (콜라겐과 proteoglycans)의 그림 3. 변경은 기계적으로 20-60 분 (± SEM, N = 6/group을 의미) 1 Hz에서 10 % 압축 변형 진폭에 따라 자극 hydrogels.

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</ol>

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<html> 셀 - 시드 아가로 오스 hydrogels로 제어 기계 자극을 적용하기위한 설명 방법은 chondrocyte 신진 대사에 동적 압축 힘의 효과에 직접 조사 할 수 있습니다. 유지 링과 함께 맞춤형 테스트 장비의 사용은 샘플 팁의 잠재적 인 문제를 방지하기 위해 구조에 대한 측면 제약 조건을 제공했습니다. 세트 요원 확보 사망 가중 로딩 platens의 사용은 샘플의 높이에 잠재적 인 차이에도 불구하고 구조와 직접적인 접촉을 보장합니다. 세포 생합성는 동적 기계적 자극의 여러 응용 프로그램에 활용 될 수있는 하나의 테스트 장비에 대한 허용, 오염의 가능성을 감소 측정 후 자극을 Radiolabeling. 이 방법은 쉽게 다른 기계 로딩 모드 (예 : 전단 1,4, 긴장 1,2)의 효과를 조사하기 위해 또는 특정 mechanotransduction 책임이 경로 명료하게하다하도록 구성 할 수 있습니다. ove_content &quot;&gt; 대표 결과 약 3...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 또는 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 햄의 F-12 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> 아스 코브 산 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> 항생제 / antimycotics </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop 캐나다 (주) </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan 파랑 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> 93,595 </td><td></td></tr><tr><td> 라이 밝은 줄 Hemacytometer </td><td> Hausser 과학 </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> 양의 - IT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> 파파야 라텍스에서 Papain </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> 암모니아 아세테이트 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic 산 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> 43,819 </td><td></td></tr><tr><td> 낮은 녹는 점 아가로 오스, 유형 VII </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td> 메쉬 스크린 (200) 필터 </td><td> 시그마 알드리치 (주) </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> 마하-1 Micromechanical 시험기 </td><td> Biomomentum 주식회사 </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> 압축 로딩 파티는 </td><td> 주문품의 </td><td></td><td> 비슷한 제품은 Biomomentum 주식회사에서 제공 될 수 </td></tr><tr><td> 매 24 자 문화 플레이트 </td><td> 온도 피셔 과학 </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-액체 신틸레이션 계수기 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] 프롤린 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] 황 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

chondrocyte - 아가로 오스 hydrogels의 기계적 자극

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

기계 모욕이나 관절염과 같은 질환에 의해 저하에 의해 손상되면 관절 연골은 제한된 복구 능력을 앓고. 이 결핍을 해결하려면 몇 가지 의료 개입이 개발되었습니다. 하나의 방법은 조직 - 엔지니어링 연골과 손상된 영역을 표면화하는 것입니다, 그러나, 엔지니어링 조직은 일반적으로 장기 survivability에 의문을 제기하고, 기본 연골의 생화학 특성과 내구성이 부족합니다. 이 주입 된 자료를 보호하기 위해 주변 조직에 의존, 작은 초점 결함의 수리에 연골 조직 공학의 응용 프로그램을 제한합니다. 개발 조직의 속성을 개선하기 위해 기계 자극은 연골 성의 세포 외 기질의 합성뿐만 아니라 엔지니어링 조직의 결과 기계적 성질을 향상시키기 위해 활용 인기있는 방법입니다. 기계 자극은 조직에 힘을 적용 생체에 이러한 경험과 유사한 구성합니다. 이기계 환경, 부분적으로, 기본 조직 1,2의 개발과 유지 보수를 조절하는 전제에 기반을두고 있습니다. 연골 조직 공학에서 기계 자극의 가장 일반적으로 적용되는 형태는 1 Hz에서 1,3의 주파수에서 약 5~20%의 physiologic 변종에 동적 압축합니다. 몇몇 연구는 동적 압축의 효과를 조사했고 최종적으로 개발 된 조직 4-8의 기능적 특성에 영향을 미치는, chondrocyte 신진 대사와 생합성에 긍정적 인 효과를 보여 주었다. 이 논문에서, 우리는 기계적으로 동적 압축에 따라 chondrocyte - 아가로 오스의 히드로 겔 구조를 자극하고 생화학 및 방사성 동위 원소 assays을 통해 생합성의 변화를 분석 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 쉽게 기계적 자극의 결과로 세포의 반응에 잠재적으로 유도 변경 사항을 평가하기 위해 수정할 수 있습니다.

chondrocytes의 연골 성의 세포 외 기질의 생합성은 기계적 자극의 응용 프로그램에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이 방법은 3D 구조와 chondrocyte 신진 대사를 유도 변화의 평가에 캡슐화 chondrocytes에 동적 압축 변종을 적용하는 기술에 대해 설명합니다.

Chondrocyte - 아가로 오스 Hydrogels의 기계적 자극

관절 연골은 기계적 손상으로 인해 손상되거나 골관절염과 같은 질환으로 인해 퇴행할 때 회복 능력이 제한적이라는 특성이 있습니다. 이를 해결하기 위해...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 세포가 파종된 하이드로젤에 동적 기계적 압축 하중을 가하는 것입니다. 이를 위해 연골 슬라이스의 박리 및 효소 소화를 통해 일차 세포를 얻습니다. 분리된 세포를 2% agros 하이드로젤에 캡슐화하고, 생검 펀치를 사용하여 세포가 파종된 구조체를 제작합니다.그 후 샘플을 압축 하중 장치에 넣고 mach one 마이크로 기계적 자극기에 장착합니다. 이어서 세포가 파종된 구조체에 동적 압축 하중을 가하여 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성을 평가합니다. 배양 후 통합된 구조체를 방사성 표지합니다.동위원소는 신틸레이션 계수를 통해 정량화하며, 결과 데이터는 DNA로 표준화합니다. 함량 분석을 통해 기계적 자극 이후의 세포외 기질 합성의 변화를 보여줍니다. 이 방법은 자극 부위의 반응과 기계적 자극에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이는 줄기세포, 다른 결합 조직 또는 기계적 수용 세포와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 본 실험에 사용된 골격 성장이 완료된 소의 중수지절 관절은 현지 도축장에서 멸균 해부 구역 내에서 수집되었습니다. 층류 후드 내에서 0.5% protease가 함유된 20 mL의 hams, F 12가 들어 있는 100 mm 직경의 페트리 접시에 연골 슬라이스를 넣고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다.진공 배양 후, 프로테아제 용액을 흡입하여 제거하고 hams. F 12 배양액을 첨가하여 슬라이스를 부드럽게 흔들어 헹군 다음, 다시 흡입하여 제거합니다. 이 과정을 두 번 더 반복하고, 세 번째 세척 후에는 배양액을 진공 흡입하여 제거합니다.0.15% collagenase A가 포함된 hams F 12 20 milliliters를 첨가하고, 디쉬를 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 200 mesh 스크린 필터를 통해 세포 현탁액을 깨끗한 페트리 접시에 피펫으로 옮깁니다. 필터를 세척하기 위해 hams F 12 5 milliliters를 추가로 피펫팅하여 여과액을 동일한 접시에 수집합니다. 세포 현탁액을 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다.페트리 접시를 10 milliliters의 hams F 12로 세척합니다. 그런 다음 세척액을 원뿔형 튜브에 넣습니다. 실온에서 600 to 800 RCF로 6분에서 8분 동안 튜브를 원심 분리합니다.원심분리가 완료되면 세포 펠릿이 흐트러지지 않도록 주의하며 상층액을 흡입하여 제거합니다. 펠릿을 40 milliliters의 배양액에 재현탁합니다. 튜브를 600에서 800 RCF로 6분에서 8분 동안 원심분리합니다.흡입, 재현탁 및 원심분리를 세 번째 회전 전까지 총 세 번이 되도록 두 번 더 반복합니다. 교반을 통해 구개 조직을 재현탁하고, 세포 수 측정을 위해 500 µL의 분주액을 취합니다. 세 번째 원심분리 동안, 헤모사이토미터와 도립 광학 현미경을 사용하여 트립판 블루 배제법으로 분주액 내의 생존 세포 수를 측정합니다.그 후 세포 수를 결정하고 세 번째 원심분리가 완료되면, 상층액을 흡입하고 재현탁합니다. 펠릿을 원하는 정착 밀도의 2배 부피의 배양액에 현탁하십시오. 여기서는 연골세포를 20 × 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁합니다.절차의 다음 단계는 분리된 일차 관절 연골세포를 aros 하이드로겔로 캡슐화하는 것입니다. 비커에 0.8 g의 aros를 20 mL의 멸균 PBS에 현탁시키십시오. aros가 용해되는 즉시 비커를 120 °C로 설정된 핫플레이트 위에 올리십시오.50 mL 원뿔형 튜브를 사용하여 온도를 60 °C로 낮춥니다. 세포 현탁액과 원하는 농도의 두 배가 되는 가열된 aro 용액을 동일한 부피로 혼합합니다. 여기서는 5 mL의 세포 현탁액에 4% agro 현탁액 5 mL를 추가하여 최종 2% Agros 하이드로젤을 만듭니다. 세포 생존율에 영향을 줄 수 있는 커다란 기포가 생기지 않도록 주의하며 피펫팅을 통해 충분히 혼합합니다.다음으로, 연골세포 아가로스 혼합물 10 milliliters를 60 millimeter 직경의 페트리 접시에 조심스럽게 분주합니다. 이때 다시 한번 큰 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 접시의 뚜껑을 닫아 덮어줍니다.그 후 혼합물을 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 혼합물이 응고되면, 4mm 생검 펀치를 사용하여 가능한 한 많은 연골세포 아가로스 하이드로겔 샘플을 채취합니다. 일반적으로 20~30개 정도의 샘플을 얻을 수 있습니다.마이크로미터를 사용하여 샘플을 깨끗한 페트리 접시에 놓고, 각 샘플의 직경과 높이를 기록합니다. 이상적으로는 구조체의 높이가 약 5mm가 되어야 하며, 샘플 높이가 2%보다 큰 영역에서 얻은 샘플은 폐기하십시오. 샘플을 10ml의 완전 배지가 들어 있는 새로운 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 프로토콜의 이 단계에서 세포가 안착된 구조체는 동적 압축을 통해 기계적으로 자극을 받게 됩니다.이는 구성체 하중 PLAs를 모의 마이크로 기계 시스템에 기계적으로 결합하여, 구성체에 가해지는 압축량을 제어하는 맞춤형 설계 압축 장치를 사용하여 수행됩니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 압축 장치에 시료를 장착하는 것입니다. 동적 압축 하중이 적절하게 가해지도록 장치 내의 플레이트를 정확하게 조정하는 것이 중요합니다.사용 전, 압축 장치의 금속 부품을 오토클레이브로 멸균하십시오. 플라스틱 부품은 70% ethanol로 하룻밤 동안 멸균하고 UV 램프로 최소 15분 동안 처리하십시오. 이는 연골세포 aros 하이드로겔 구조물이 쓰러지는 것을 방지하기 위함입니다.포셉을 사용하여 24웰 배양 플레이트의 웰에 멸균된 플라스틱 리테이닝 링 12개를 배치합니다. 리테이닝 링의 내경은 구조물의 직경보다 커야 합니다. 포셉을 사용하여 조심스럽게 작업하십시오.chondro aros 하이드로젤을 페트리 접시에서 24웰 플레이트로 옮겨 각각을 고정 링으로 고정합니다. 각 샘플에 400 microliters의 완전 배지를 넣습니다. 이어서 멸균된 압축 장치를 조립하고, 세트 스크류를 사용하여 PLA를 고정합니다.압축 장치를 24웰 배양 플레이트에 부착하여 하이드로겔 접촉 해제를 설정하고 다시 고정합니다. 세트 스크류 구조의 변형은 이 부하가 없는 기준 상태 또는 제로 스트레인 상태에 적용됩니다. 조립된 압축 장치를 위치 고정 핀과 함께 Mach one 마이크로 기계적 시험 시스템에 장착합니다.장치를 수직 스테이지에 고정한 다음, 고정 나사를 사용하여 위치를 잠급니다. 간격 조정 지그를 제거합니다. Mach one 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 주파수를 1 Hz, 진폭을 350 µm, 사이클 수를 1,200회로 설정합니다.이는 샘플의 원래 높이를 기준으로 10% 변형 진폭의 동적 압축 하중을 가합니다. 기계적 자극을 시작하려면 시작 버튼을 눌러 mach one 액추에이터를 작동시키십시오. 배양 플레이트에 부착되는 하중 장치에는 위아래로 움직이는 6개의 인덴터(indent)가 있어 6개의 샘플을 동시에 자극합니다.비자극 대조군 샘플 또한 동일한 배양 플레이트에 들어있으나, 홈이 있는 웰에 배치하지는 않습니다. 작동이 완료되면 기기에서 비프음이 울리고 액추에이터가 하중이 제거된 기준 상태로 이동합니다. 기계적 자극이 끝나면 스페이싱 지그를 다시 장착하십시오.위치 고정 핀의 세트 스크류를 풀고, 방사성 표지 옆의 테스트 시스템에서 압축 장치와 배양 플레이트를 제거합니다. 세포 하이드로젤 구조체에 연골세포 특이적 콜라겐 합성을 위한 5 µCi의 Tritium Prolene 단백질 표지와 프로테오글리칸 합성을 위한 5 µCi의 S 35 sulfur를 각 웰에 피펫팅합니다. 방사성 표지된 구조체를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 후 방사성 표지된 하이드로젤 구조체를 수확합니다. 핀셋을 사용하여 각 하이드로젤 구조체를 PBS에 3회 침지하여 세척합니다. 결합되지 않은 동위원소를 제거하기 위해 세척된 구조체를 1.5 mL 튜브에 넣습니다.다음으로, 1.5 mL 튜브에 500 µL의 pape 용액을 추가합니다. 이를 히팅 블록에 올리고 65 °C에서 72시간 동안 소화시킵니다. 소화가 완료되면 시료가 비교적 투명하게 보여야 합니다.pape 소화를 마친 직후, 각 시료에서 100 µL의 aliquot를 취하여 pico green D assay를 통해 DNA 함량을 측정합니다. 이어서 각 시료에서 100 µL의 aliquot를 다시 취해 베타 액체 섬광 계측법으로 도입된 동위원소 활성도를 측정합니다. 결과적으로 얻은 동위원소 활성도는 분석을 위해 DNA 함량에 따라 정규화해야 합니다.10⁶ cells/mL의 세포가 캡슐화된 2% aros로 구성된 소 관절 연골세포 aros 하이드로젤 구조체를 1 Hz의 주파수로 10% 압축 변형 진폭으로 20분에서 60분 동안, 즉 1,200회에서 3,600회 사이클 동안 기계적으로 자극하였습니다. 그 후 방사성 동위원소 도입법을 통해 DNA 함량과 세포외 기질 합성을 분석하였습니다.여기서 볼 수 있듯이, DNA 및 세포외 기질 합성이 농도 의존적인 방식으로 영향을 받았습니다. DNA 함량은 20분 또는 30분 동안의 자극 결과 p 값이 0.01 미만으로 유의미한 35% 감소를 보였으며, 60분 동안의 자극은 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 연골 특이적 콜라겐 및 프로테오글리칸 합성은 각각 트리튬, 프롤린 및 S 35 황의 통합 분석을 통해 측정되었습니다.이들은 20분 또는 30분간의 자극에 반응하여 p-value 0.01 미만으로 약 60%의 유의미한 증가를 보였으며, 60분간의 자극에서는 관찰 가능한 효과가 나타나지 않았습니다. 이 영상을 시청한 후에는 동적 압착을 이용해 하이드로겔 배양물을 기계적으로 자극하는 방법과 이 프로토콜을 유사한 응용 분야에 적용하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

활액 액체 높은 수준의 culturing 인간의 관절 chondrocytes의 3D 시스템이 설명되어 있습니다. 활액 액체는 관절 연골의 가장 자연 microenvironment을 반영하고, 쉽게 얻은하고 저장할 수 있습니다. 이 시스템은 따라서 연골 재생을 공부 및 관절염 치료를위한 심사 치료제 사용할 수 있습니다.

활액 유체에 Culturing 인간 관절 Chondrocytes을위한 3D 시스템

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조직 공학을위한 이축 기계 로딩 생물 반응기의 설계

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