Name: 기능 Assays을위한 조직 항원의 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 기능 면역 분석을 위한 인간 조직 추출물 준비 방법을. BAW 용액에서 조직을 균질화하고 동결 건조하여 항원을 추출합니다. 이 기술은 독성 용매 없이 T세포 반응을 정확히 측정할 수 있습니다.

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이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (NHMRC # 559007) 및 아동 당뇨병 연구 재단 (JDRF 4-2006-1025)와 빅토리아 정부의 운영 인프라 계획의 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 인간의 조직을 제공하는 톰 Mandel 작은 섬 이식 프로그램 작은 섬 절연 팀의 구성원을 감사드립니다. 인간의 조직이 지역의 윤리적 승인을 수집하여 사용되었다 (세인트 빈센트 병원 HREC-A 011 / 04, 세인트 빈센트의 건강 HREC-A 135 / 08).

1. 비장 조직을 준비 <ol><li> 참고 - 모든 인간 자료는 잠재적으로 전염성이 모든 절차는 클래스 II의 층류 내각에서 실시되어야한다로 취급해야합니다. 멸균 가위와 집게를 사용하여, 비장 섹션 (크기 ~ 1~2센티미터)에서 지방과 섬유 조직을 제거하고 가능한 한 바깥 쪽 캡슐 소재의 많은을 잘라. </li><li> 비장 조직의 작은 조각 (1~2센티미터 3) 잘라 멸균 50 ML 팔콘 튜브에 각각의 조각을 배치합니다. </li><li> 액체 N 2 침수에 의해 조직의 조각을 스냅 - 고정. </li><li> -80에서 저장 ° C. 유사한 프로토콜은 다른 조직 (들)에 적합합니다. </li></ol> 2. 스토리지에 대한 인간의 작은 섬 준비 <ol><li> CMRL 미디어 문화 섬. 10 ML 원뿔 바닥 관에서 섬을 수집하고 5 분을 위해 1,500 rpm으로 centrifuging하여 PBS로 두 번 씻어. PBS를 넣어하고 종이 타월에 잠시 역 튜브를 삽입하여 잔류 버퍼를 배수한다. 주의하지 말아라섬를 제거합니다. </li><li> -80에서 액체 질소와 매장에서 일단 배수, 재 캡 튜브와 스냅 - 동결 ° C. </li></ol> 3. 추출 준비 <ol><li> 4에 BAW 믹스 (10:30:60 % V / V) 및 매장 ° C. 준비 </li><li> -80 ° C.에서 튜브를 제거 실온에서 해동. </li><li> 조직의 조각을 충당하기 위해 충분한 얼음처럼 차가운 BAW을 추가합니다. 섬 3-5 ML을 사용하십시오. 비장 조직의 경우 조직의 조각의 크기에 따라 10-20 ML을 사용합니다. </li><li> 조직 균질를 조립. 70 % 에탄올 / 물 10-20 ML &#39;을 homogenizing&#39;로 청소하십시오. </li><li> 조직 및 BAW 솔루션 관에 균질 프로브를 삽입 한 후 여러 뿜어의 조직을 균질화. 이후 얼음 양동이에 관세요. </li><li> 철저히 10-20 70 % 에탄올 / 물 ML 후 BAW 버퍼를 homogenizing하여 샘플 사이의 균질를 청소. 이것은 우리 한 후 70 % 에탄올 / 물 samples.Dismantleand 깨끗한 사이의 조직의 교차 오염을 방지5. </li><li> 만 수용성 물질을 포함하는 추출물이 필요한 경우 10 분 동안 RT에서 4,000 rpm으로 균질 조직 추출물을 원심 분리기. 더 많은 원유 추출물가 필요한 경우, 5 분 동안 RT에서 1,000 rpm으로 회전. BAW-불용성 단백질을 추출하기위한 가장 적합한 기술은 단백질의 하류 분석에 따라 달라집니다. 기능 면역의 assays에 사용하기 위해 우리는 우리가 이전에이 잘 6 용납 할 수 발견으로 8 M의 요소에 불용성 일부를 분해하려고 시도하는 것이 좋습니다 것입니다. </li><li> 깨끗한 튜브에 표면에 뜨는 전송과 얼음에 넣어. </li><li> BCA 분석 또는 이와 유사한을 사용하여 추출물의 단백질의 농도를 결정합니다. </li></ol> 4. 건조 추출물을 동결 <ol><li> 단백질 필수의 질량 (예, 튜브 당 100 μg)에 따라 적절하게 homogenate를 희석하여 표시 5.0 ML 멸균, 매 (12x75 mm) 튜브에 aliquots을 투여. 우리는 자주 100 μg / 튜브를 사용합니다. </li><li> 1을 사용각 튜브의 뚜껑에 3 개의 구멍을 만들 8-20 게이지 멸균 주사기 바늘. </li><li> ~ 10 분에 드라이 아이스 나&gt; 1 시간에 -80 ° C 냉장고에 그들을 배치하여 두 튜브를 고정. -80에서 저장 ° C lyophilizer에 넣어 준비가 될 때까지. </li><li> 냉동 건조기에 전환 (-100 ° C) 평형 할 수 있습니다. 이 약 30 분 정도 소요됩니다. </li><li> 볼륨에 따라 냉동 건조는 3 시간 이내에 완료하지만 우리는 정기적으로 하루 아침에 우리의 샘플을 떠날 수 있습니다. </li><li> 건조 사이클을 완료 한 후, 진공 펌프를 끄고 천천히 챔버로 압력을 수 있습니다. 랙을 제거합니다. </li><li> 멸균 후드에서 튜브에서 구멍 마개를 제거하고 새 (매 352,032)로 교체하십시오. </li><li> -20 ° C.에 상점 튜브 샘플은 문화 미디어, 또는 다른 버퍼에 재구성하고, 함수 또는 생화학 assays에서 사용할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 1은 단백질의 착색을 보여줍니다젤 비장 및 췌장 고갈 췌장 조직 (acinar 표시)에서 추출물과 인간의 섬을 (라벨 섬) 정화와 함께로드. 결과는 각 조직에 대해 서로 다른 분자량의 단백질의 좋은 표현을 보여줍니다. 인간 T-세포 증식을 자극하는 조직 추출물의 용량은 CFSE 기반 확산 분석 7 (그림 2)를 사용하여 테스트되었습니다. 이 분석에 사용 된 PBMC는 제 1 형 당뇨병과 개인으로부터 격리되었다. 응답의 크기는 항원이없는 5000 CD4 +, CFSE 밝은 세포 당 CFSE 흐린 세포의 수의 비율로 표시됩니다 : 5,000 CD4 당 CFSE 흐린 세포의 +, 세중의 샘플 7 항원과 CFSE 밝은 세포. 결과는 약한를 표시하지만, acinar에 대응 (CD1 = 3.5)와 작은 섬 추출물 (6.8)에 강한 반응 감지, 증식. Inactivated 인플루엔자 바이러스 (CDI = 142.6)이로 포함되어 있습니다긍정적 인 제어 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> 그림 1. 단백질 젤. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> acinar과 작은 섬 추출물에 대한 CFSE 기반의 확산 분석에서 그림 2. 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 이러한 세제 등 독성 화학 물질에서 자유를 인간의 조직에서 추출을 생성 싶었 기 때문이 프로토콜은 개발되었습니다. 특히 우리는 체외에서 인간의 면역 기능의 assays에서 사용할 수있는 인체 조직의 추출물을 준비하는 데 사용했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비 추출물은 똑같이 버퍼에 재구성 및 blotting 서쪽이나 액체 크로마토 그래피 등 여러 생화학 분석, 사용할 수 있습니다. 이것은 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 적용이 기법을합니다. 우리의 프로토콜을 사용하여 조직 추출물에 대한 응답은 강력한 없습니다. 우리가 &#39;자기&#39;항원에 대한 답변을 찾고 있기 때문에 이것은 예상됩니다, 우리의 경우에는 작은 섬의 항원에 대한 T 세포 반응을 자주 한 약입니다. 이전에 우리는 인간 CD4 + 재조합 proinsulin 및 글루탐산의 탈 카복실 화 효소 (갓)에 T 세포 응답, 제 1 형 당뇨병의 aut...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 5 ML 12 X 75mm 멸균 폴리스티렌 튜브 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> 튜브의 폴리스티렌 튜브에 캡 (위) </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml 멸균 튜브 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> 아세토 니트릴 </td><td> Mallinckradt 화학 </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-좋았어요 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> 균질 : PRO200 </td><td> 바이오 전략 </td><td> 01-01200 </td><td> 10 × 115mm 톱니 생성기 </td></tr><tr><td> Lyophilizer </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> 멸균 니들 18-20 게이지 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> REF 302,032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 매체 </td><td> 시그마 </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 특정 시약 및 장비.

기능 assays을위한 조직 항원의 추출

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

B와 T 세포에 의해 인식 적응 면역 반응의 항원 대상, 대부분은 1 정의되지 않았습니다. 이 면역 질환과 암 2 특히 사실입니다. 우리의 목적은 면역 질병 1 형 당뇨병 1,3,4,5 인간의 T 세포에 의해 인식 항원을 조사하는 것입니다. T 세포에 의해 인식 항원이 발견되지 않는 조직에 대한 인간 T-세포 반응을 분석하기 위해 우리는 기능 assays 6 호환되는 형식으로 인간의 조직에서 단백질 항원을 추출하는 방법을 개발했습니다. 추출 방법은 인간의 말초 혈액 mononuclear 세포에 독성했다 세제를 포함하는 lysate를 얻을 수 있기 때문에 unpurified 조직 추출물로 이전, T-세포 반응을 측정 할 수 없습니다. 여기 인간의 T 세포에 독성이없는 형식으로 인간의 조직에서 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 설명합니다. 조직은 butan-1-안녕, 아세토 니트릴 및 와트의 혼합물에 균질하고 있습니다어 (BAW). 조직 추출물의 단백질 농도는 측정 및 단백질의 알려진 질량은 튜브에 aliquoted 있습니다. 추출 후, 유기 용제는 lyophilization에 의해 제거됩니다. 필요 할 때까지 동결 건조 된 조직 추출물은 저장 될 수 있습니다. 면역 기능, 면역 세포의 정지 assays에 사용하기 위해, 적절한 문화 미디어, 동결 건조 추출물에 직접 추가 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 준비 추출물에 대한 응답으로 PBMC의 시토 킨 생산 및 확산은, 쉽게 측정 하였다. 따라서, 우리의 방법은 T-세포 반응의 분석에서 항원의 소스로 사용할 수있는 인간의 조직 lysates의 급속한 준비를 할 수 있습니다. 이 방법은 이식, 암과 autoimmunity의 조직에 적응 면역 반응의 분석을 용이하게 할 것을 권장합니다.

기능 T-세포 assays에서 항원의 소스로 사용되는 인체 조직의 추출물을 준비하기위한 간단한 프로토콜은 설명되어 있습니다. 이 방법은 조직 유래 항원에 대한 T 세포 반응을 측정 할 수 있습니다<em&gt; 체외에서</em&gt;.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

B 세포와 T 세포에 의해 인식되는 적응 면역 반응의 많은 항원 표적들이 아직 규명되지 않았습니다 1. 이는 특히 자가면역 질환에서 두드러집니다...

본 절차의 전체적인 목표는 기능적 면역 분석과 호환되는 조직 추출물을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직의 샘플을 수집함으로써 수행됩니다. 그다음으로, 부탄올, 아세토나이트릴 및 물의 혼합물인 BAW에서 조직 샘플을 균질화합니다.단백질 농도를 결정한 후, 추출물을 분주하고 동결 건조하여 용매를 제거합니다. 최종적으로, 재구성된 추출물은 인간 T 세포 증식 또는 사이토카인 분비 분석의 항원 공급원으로 사용됩니다. 계면활성제 용해와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동결 건조된 추출물에 독성 용매와 계면활성제가 포함되어 있지 않다는 점입니다.본 프로토콜에서 모든 인체 유래 물질은 잠재적 감염 가능성이 있는 것으로 간주해야 하며, 모든 절차는 2등급 층류 작업대(class two lamina flow cabinet) 내에서 수행되어야 합니다. 멸균된 가위와 핀셋을 사용하여 약 1~2cm 크기의 비장 절편에서 지방 및 섬유 조직을 제거하십시오. 외부 캡슐 물질을 가능한 한 많이 다듬어 제거하십시오.비장 조직을 작은 조각으로 자른 후, 각 조각을 멸균된 50 milliliter Falcon tube에 넣습니다. 액체 질소에 침전시켜 조직 조각을 급속 냉동하고 minus 80 degrees Celsius에서 보관합니다. 저장 배양을 위한 인간 섬도 준비 절차를 시작합니다.37°C의 CMRL 배지 내에 있는 안구(eyelets)를 준비합니다. 10mL 원추형 바닥 튜브에 안구를 수집하여 1,500 RPM에서 5분간 원심분리합니다. 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척한 후, 두 번째 세척 단계를 마칩니다.PBS를 따라내고, 튜브를 거꾸로 세워 페이퍼 타월 위에 잠시 놓아 남은 버퍼를 제거합니다. 이때 아이렛(eyelets)이 빠지지 않도록 주의하십시오. 배출이 완료되면 튜브 캡을 닫고 액체 질소로 급속 냉각한 뒤 -80 °C에서 보관합니다.조직 추출물을 준비하려면, 먼저 -80 °C에서 조직이 담긴 튜브를 꺼내 실온에서 해동합니다. 조직은 이전에 준비하여 4 °C에 보관한 부탄올, 아세토니트릴 및 물의 혼합물인 BAW에서 균질화됩니다. 조직 조각이 완전히 잠길 정도로 충분한 양의 ice cold BAW를 첨가합니다. 본 시연에서 사용된 비장 조직의 경우, 10 to 20 mL의 BAW를 사용하였습니다.조직 균질기를 조립하십시오. 70% ethanol 수용액 20 milliliters를 균질화하여 균질기를 세척하십시오. 다음으로 조직과 BAW 용액이 들어 있는 튜브에 균질기 프로브를 넣고 조직을 여러 번 나누어 균질화하십시오.이후 샘플 간 조직의 교차 오염을 방지하기 위해 튜브를 적절한 버킷에 보관하십시오. 70% ethanol 10~20 mL를 물과 함께 균질화한 후, BAW buffer로 원심분리하여 샘플 사이의 균질기(homogenizer)를 철저히 세척하십시오. 균질화된 조직 추출물은 상온에서 보관하십시오.가용성 물질만 포함된 추출물이 필요한 경우에는 4,000 RPM에서 10분 동안 원심분리합니다. 더 조잡한(crude) 추출물이 필요한 경우에는 원심분리 후 1,000 RPM으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 깨끗한 튜브로 옮기고 얼음 위에 둡니다. 이후 BCA 분석법 또는 유사한 분석법을 사용하여 추출물의 단백질 농도를 측정합니다.본 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 추출물 내의 단백질 농도를 정확하게 측정하여 적절한 부피의 추출물을 동결 건조하는 것입니다. 원하는 질량의 단백질을 동결 건조하기 위해서는, 먼저 필요한 단백질 양에 따라 균질액을 희석한 후 라벨이 부착된 5 mL 멸균 튜브에 분주합니다. 본 예시에서는 튜브당 100 µg의 단백질을 할당하였습니다.18~20 gauge 멸균 바늘을 사용하여 각 튜브 캡에 3개의 구멍을 뚫고, 튜브를 드라이아이스 위에 약 10분 동안 놓아 동결시킵니다. 동결건조기를 켜고 -100 °C까지 평형 상태가 될 때까지 기다립니다. 이 과정은 약 30분이 소요됩니다. 동결건조기 준비가 완료되면 튜브를 동결건조기 안에 넣고 진공 펌프를 켭니다.추출물의 부피에 따라 동결 건조는 3시간 이내에 완료될 수 있습니다. 다만, 일반적으로 샘플을 밤새 방치합니다. 건조 사이클이 완료되면 진공 펌프의 전원을 끄고 챔버 내에 서서히 압력을 가합니다.멸균 후드 내에서 튜브 랙을 꺼냅니다. 튜브의 타공 캡을 제거하고 새 캡으로 교체합니다. 튜브를 -20 °C에서 보관하십시오.샘플은 나중에 배양액, 배지 또는 기타 완충액으로 재구성하여 생화학적 분석의 기능에 사용할 수 있습니다. 이 그림은 비장 섬세포 결핍 췌장 조직 추출물과 정제된 인간 섬세포를 로딩한 단백질 젤의 염색 결과를 보여줍니다. 이러한 결과는 각 조직에 대해 서로 다른 분자량의 단백질이 잘 나타남을 보여주며, 인간 T 세포 증식을 자극하는 췌장 및 섬세포 추출물의 능력을 증식 분석법을 통해 테스트하였습니다. 이 분석에서는 말초혈액 단핵구 또는 PBMC를 형광 염료인 CFSE로 라벨링하였으며, 항원에 반응하여 증식한 세포로 인해 발생하는 CFSE 강도의 감소를 유세포 분석기로 직접 측정하였습니다.본 예제에서 사용된 PBMC는 제1형 당뇨병 환자로부터 분리되었습니다. C 세포 반응의 크기는 항원이 없는 상태의 CD4 양성 CFSE bright 세포 5,000개당 CFSE dim 세포 수와 항원이 있는 상태의 CD4 양성 CFSE bright 세포 5,000개당 CFSE dim 세포 수의 비율로 세 번의 반복 실험 샘플을 통해 표현되었습니다. 결과는 Asana에 반응하여 세포 분열 지수(CDI) 3.5의 약하지만 검출 가능한 증식을 보여줍니다.아이렛(eyelet) 추출물에 대해 더 강한 반응이 나타났으며, CDI 값은 6.8이었습니다. 이 절차의 양성 대조군으로는 불활성화된 인플루엔자 바이러스를 포함하였습니다. 조직 유래 항원에 반응하여 어떤 사이토카인이 분비되는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 Ali Spot 또는 e Iza와 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

강력한, 소규모 HELA 핵 추출물의 준비를위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 이러한 약물이나 RNAi로 치료 세포와 같은 세포의 작은 인구의 사용을 요구 assays를위한 가치있는 것입니다. 방법은 유전자 발현 assays 및 환자 세포 등 다른 세포 유형의 다양한 적용해야합니다.

유전자 표현 기계의 기능 Assays을위한 소규모 핵 추출물

이 동영상은 항체를 분비하는 B 세포(ASC)의 기능을 평가하기 위해 ELISpot 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. ASC에 의해 분비된 항체는 효소 접합 IgG 또는 IgM 항체에 의해 검출되는 막 결합 다클론 항체 단편과 상호 작용합니다. 각 웰에서 생성된 착색된 반점은 특정 항체의 동형이 존재함을 나타내며, 이는 B 세포의 분비 활동과 관련이 있습니다.

ELISpot Assay를 사용한 항체 분비 B 세포의 기능 평가

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장기 기증자와 받는 사람 쌍 사이 인간 백혈구 항 원 (HLA) 시퀀스에 불일치 장기 이식의 거부 항 체 중재의 주요 원인입니다. 여기 안티 기증자 HLA alloantibodies 기관 수령인에 프로브를 개별 기증자의 HLA 시퀀스를 기반으로 하는 사용자 지정 항 배열의 사용 선물이.

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

전혈 기반 면역분석은 진단 및 연구 목적으로 항원 특이적 면역을 분석할 수 있는 간편하고 자원 효율적인 도구를 제공합니다. 이 기사는 소아 환자 및 소동물을 위한 소량 버전을 포함하여 진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 포괄적인 분석을 위해 이중 공동 자극을 갖춘 최적화된 전혈 기반 프로토콜을 제공합니다.

진균 및 바이러스성 병원체에 대한 숙주 면역의 항원 특이적 분석을 위한 이중 공동 자극을 사용한 전혈 분석

자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

배우세요 기능 면역 분석을 위한 인간 조직 추출물 준비 방법을. BAW 용액에서 조직을 균질화하고 동결 건조하여 항원을 추출합니다. 이 기술은 독성 용매 없이 T세포 반응을 정확히 측정할 수 있습니다.

기능 Assays을위한 조직 항원의 추출

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