Name: 절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 학습하세요 확장성 심근증 환자의 심근세포 기능에 대한 항체 효과 측정 방법을. 흰쥐 심근세포에서 세포 수축과 칼슘 변화를 분석하여 심장 자가항체를 검출하는 이 기법은 자가면역 심장질환 연구에 활용됩니다.

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심혈관 질환의 체액 면역 응답 (-이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG)의 Sonderforschungsbereich Transregio 19 일 (SFB/TR19, C2), 경제 및 기술 프로젝트 ZIM - KF 2727801MD0 연방 교육부 및 혁신 능력의 센터에 의해 지원되었다 ZIK - 하이킹, 교육 및 연구, 독일 연방 교육부의 BMBF FKZ 03Z2CN12). 동물과 주택과 실험은 유럽 연구소 동물 과학 협회 (FELASA)의 연구실 동물 과학 (Gesellschaft 털 Versuchstierkunde, GV-SOLAS)와 제휴를위한 학회의 권고에 따라 수행되었다.

1. 환자 샘플에서 IgG 절연 <ol><li> 빈 Econo 팩 칼럼으로 두 ML 환자의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 플라즈마 당 3 ML 항 IgG 세 파로스를 작성하여 미니 immunoadsorption 항목을 준비합니다. IgG 격리는 환자 플라즈마의 최소한 2 ML이 필요합니다. </li><li> 반 IgG 세 파로스 상단에 필터를 넣고, 열 아래 팁을 열고 잘라 약 1 방울 / 초의 유량에 도달 할 필터를 누르십시오. 열이 부족 보존 솔루션을 보자. </li><li> 3 권 플라즈마의 볼륨 당 NaCl 0.9 %로 열을 씻으십시오. </li><li> 열에서 플라즈마를 피펫. 플라즈마 완전히 반 IgG 세 파로스에 몰두했을 때, 같은 볼륨 0.9 % NaCl로 씻는다. </li><li> 피펫 한 플라즈마 열에서 0.2 M 글리신 HCL, pH를 2.8의 볼륨과 세 파로스로 잠그다 보자. 열에 글리신 HCL의 또 다른 볼륨을 추가합니다. 15 ML 관을 통해 흐름을 수집하여 0.5 M 트리스 - HCL, pH를 8.0로 7.3으로 산도를 조정합니다. </li><li> 열을 생성하려면3 플라즈마 볼륨 글리신 HCL을 씻는다. 2 권 0.9 % NaCl로 최종 세척 후, 열은 다음 플라즈마 샘플에 사용할 수 있습니다. ° C 최대 4 주까지 8 - 또는 열이 보존 솔루션으로 가득과 4에 저장할 수 있습니다. </li><li> cardiomyocytes에서 사용하기 위해, 수집 된 IgG 분획은 실험 버퍼 (EB)에 대해 dialyzed해야합니다. EB의 준비를 들어, 117 MM NaCl, 2.8 MM KCl, 0.6 MM MgCl 2, 1.2 MM KH 2 PO 4, 1.2 MM CaCl 2, 10 밀리미터 HEPES 및 자기 교반기에 20 밀리미터 포도당 1 L 증류수로 추가하고 pH를 조정 7.3 있습니다. </li><li> 100 kDa의 차단 분자량과 셀룰로오스 에스테르 투석 막 관에 IgG의 일부를 입력합니다. 1 L의 EB에 튜브를 넣고, 4에서 자기 교반기로 천천히 저어 ° C. 8 시간 후, 신선한 EB 3 L로 투석 튜브를 전송하고 4시에 또 다른 20 시간을위한 dialyze ° C. </li><li> inactivat 할 수있는 물 욕조에 57시 30 분 ° C에 대한 투석, 열에게 샘플을 따라전자 보완 요소. 총 IgG 농도를 결정 및 330 μg IgG 각을 포함하는 aliquots를 준비합니다. 측정 (단계 4.3)에 대한 cardiomyocytes에 샘플을 추가 할 때, EB 1 ML에 aliquots를 입력합니다. Undiluted aliquots는 더 이상 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 쥐 Cardiomyocytes의 절연 <ol><li> 칼슘 2 + 무료 절연 버퍼 (IB)의 준비를 들어, 110 MM NaCl, 2.6 MM KCl, 1.2 MM MgSO 4, 1.2 MM KH 2 PO 4, 20 밀리미터 HEPES과 자기를 사용하여 1 L 증류수 11 으 포도당을 추가 교반기. 살균을위한 0.2 μm 병 톱 필터를 통해 실내 온도 및 필터에서 7.4로 산도를 조정합니다. </li><li> thermostated Langendorff 재관류 시스템의 상부 저수지에서 IB의 80 ML을 입력합니다. 37 ° C의 버퍼 온도를 유지하고 95% O 5분의 2 % 30 분에 CO 2와 버퍼를 폭기하는 온도 설정을 조정합니다. </li><li> 약 10,000 무게 - collag의 12,000 U를enase 유형 II, 175 MG 지방산 무료 BSA하고 100 MM CaCl 2 재고 솔루션의 22.5 μl를 포함하는 20 ML IB에 용해. 상단 저장소의 절연 버퍼의 pH를 제어하고 필요한 경우 조정합니다. </li><li> 375 μg / kg 체중의 thiopental 200 G - 175의 Wistar 쥐를 마취시키다. thiopental 솔루션에 2,500 IU의 헤파린을 추가합니다. 그대로 대동맥 활과주의 깊게 thoracotomy, 소비세 마음에와 얼음처럼 차가운 0.9 % NaCl로 전송. 혈액의 마음과 주변 조직과 신선한 0.9 % NaCl로 전송를 청소합니다. 대동맥을 노출, 2-3/sec의 하락 속도를 얻고 캐뉼라에 마음을 첨부 Langendorff 시스템의 흐름 감속기를 엽니 다. </li><li> 까지 남은 피를 씻어 한 방울 / 초의 유량과 3 분에 대한 마음을 Perfuse. Langendorff 시스템의 IB를 순환하기 시작한다. 상부 저수지부터 20 ML 버퍼를 제거 등의 80 ML에 도달하는 데 필요한 많은 버퍼로 collagenase 솔루션과 리필 입력합니다. C를 순환<html> 또 다른 27 분에 ollagenase 솔루션입니다. 유량은 흐름 감속기를 사용하여 한 방울 / 초에서 정기적으로 관리 및 유지 관리해야합니다. </li><li> 심방과 대동맥에서 깨끗한 캐뉼라의 마음을, 이탈 작은 조각으로 썰어. collagenase 솔루션은 낮은 저수지로 실행하도록 허용, 40 ML의 최대 볼륨을 줄이고 더 10 다진 심실을 소화 % - 95 % O가 5분의 2 %의 CO 2 연속 폭기에서 15 분. 그 후 50 ML 튜브에 200 μm의 메쉬 크기 거즈를 통해 세포 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 200 μM에게 CaCl 2를 포함하는 10 ML의 IB의 객실 온도와 resuspend 세포에서 2 분에 43 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기 : 3 단계에서 세포의 칼슘 2 + 내용을 복원합니다. 다시 원심 분리기, 500 μM CaCl 2 10 ML IB에서 셀을 resuspend. 최종 원심 분리 50,000 세포 / ML의 밀도에 살균 필터 EB의 cardiomyocytes을 (1.8 참조) resuspend 후. </li></ol>Cardiomyocytes의 &quot;&gt; 3 e_title. Fura-2 염색법 <ol><li> 코트 10 μg의 당 잘 laminin과 완전히 건조 될 때까지 기다리과 4 잘 쏠 수 coverglass. </li><li> 각이 잘 커팅 팁과 micropipette를 사용하여에 cardiomyocyte 정지 1 ML을 입력합니다. 세포가 실온에서 1 시간에 준수 할 수 있습니다. </li><li> 10 일 MG / ML의 μl Fura-2 5 ML의 EB의 주식 솔루션입니다.를 희석 어둠 속에서 착색 솔루션세요. </li><li> coverglass 각도에 착색 솔루션의 피펫 0.5 ML의 버퍼와 무소속의 세포를 벗어. 적당한 흔들림에 따라 10 분에 세포를 배양. 그 후, 착색 솔루션을 벗고 일 ML의 EB를 한 번 세포를 씻어 마지막으로 각도에 0.5 ML의 EB를 채 웁니다. 착색 과정에서 직접 빛을 방지하고 항상 어둠 속에서 스테인드 세포를 유지. </li></ol> 4. 셀 단축 및 CA 2 + 과도의 기록 <ol><li> 역 형광의 m에 쏠의 coverglass를 삽입icroscope는 myocyte 칼슘, 수축성 기록 시스템에 연결되어 있습니다. 물론 처음에 유입 및 유출 관과 맞춤 제작 전극을 배치합니다. 1 ML / 분 EB와 (20 V, 1 Hz에서, 5 밀리 초 시간) 전기 자극을 시작으로 Superfuse cardiomyocytes. 세포가 약 2 분의 자극에 적응 할 수 있도록 허용합니다. </li><li> 분명 결 지속적인 수축과 손상로드 모양의 cardiomyocyte를 선택합니다. 시야의 중심에있는 셀을 위치와 카메라 채널을 엽니 다. 셀 프레임 어댑터를 회전하고 현미경 단계를 이동하여 비디오 영역에서 수평으로 셀을 일정한 방향으로 향하게. </li><li> 초기 셀 단축 및 CA 2 + 과도를 얻기 위해 15 수축 - 가장자리가 동영상 영역의 제어 요소 (그림 2)을 검출 조정, 형광 채널과 기록이 10여십시오. </li><li> 형광 얼룩의 표백 방지하기 위해 현미경 광 채널을 닫습니다. 샘플로 EB에서을 통해 흐름을 전환환자 IgG 1 ML과 3 방향 밸브 및 superfuse의 cardiomyocytes으로 우회. 공기가 잘 도달 전에 펌프를 중지합니다. </li><li> 빛 채널을 열고 또 다른 10 기록 - 급성 세포 응답을 얻기 위해 15 수축합니다. 녹화를 일시 중지하고 다시 조명 채널을 닫습니다. 이 후 녹음 및 5 분 반복합니다. </li><li> 우물의 전극을보십시오. EB와 철저하게 튜브를 청소하고 쏠 수의 coverglass의 다음 잘를 계속합니다. </li><li> 각각 세포 단축 및 CA 2 + &#39;Edge-Length/Length &quot;를 사용하여 IonWizard 소프트웨어와 과도하고&quot;fura 2 숫자는 / 비율을 뺀&#39;창을 분석합니다. 초기 셀 단축 및 CA 2 + 급성의 기준 (BL %에서 최대 H)에 언급 된 피크 높이의 과도, 2 분, 5 분 응답에서 변경 률을 계산합니다. </li></ol>

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</ol>

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제시 방법은 불분명 출신 DCM 환자에서 기능적으로 효과적인 심장 autoantibodies를 감지 할 수있는 적절한 방법을 제공합니다. 다른 방법에 비해, 캠프 레벨 6에 미치는 영향에 의해 β1-adrenoceptor에 대한 기능을 활성화 항체의 검출을 예를 들어, 우리의 방법은 특정 에피토프의 독립적입니다. 물론 문학에 설명 된 다른 에피토프 독립 assays는 IE 패치 클램프 기술 또는 절연 Purkinje 섬유 (14)의 수축성에 의해 성인 cardiomyocytes의 칼슘 전류를 측정하는 신생아 cardiomyocytes 13의 박동 속도를 계산, 있습니다. 이러한 방법으로 활용에서, 여기에 제시된 분석에는 시간이 많이 걸릴 적을 수 있으며 표준화 된 프로토콜에 따라 증가 객관성을 제공합니다. 또한, 동시에 수축성과 세포 내 칼슘 과도에 미치는 영향을 감지 할 수 있습니다. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Immunosorba 보존 솔루션 </td><td> Fresenius 의료 </td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 2 형 </td><td> 셀 시스템 </td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA, 지방산 무료 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> F0888 </td><td> DMSO 1 MG / ML </td></tr><tr><td> Econo 팩 크로마토 그래피 열 </td><td> BioRad </td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td> 스펙트럼 / 포 바이오 셀룰로오스 에스터 투석 Membran전자 </td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 네 잘 쏠 수 Coverglass </td><td> Nunc </td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td> Myocyte 칼슘과 수축성 기록 시스템 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6.0 분석 소프트웨어 </td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절연 cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

확장 성 심근증 (DCM)은 젊은 성인 1 심장 마비의 주요 원인 중 하나입니다. 독성 물질에 대한 유전 처분 및 박람회가 환자의 약 셋째에서이 질병에 대한 원인을 알려져 있지만, DCM의 출처는 대부분 불분명 남아 있습니다. 이 환자의 상당수에서 심장 epitopes에 대한 autoantibodies가 감지되었으며 질병 2,3의 발병과 진행에 중요한 역할을 의심하고 있습니다. 심장 autoantibodies의 중요성은 immunoadsorption 3-5로 autoantibodies의 제거 후 DCM 환자에서 관찰 hemodynamic 개선에서 빨간 밑줄이 있습니다. 특정 항원의 다양한 이미 2,3를 확인하고 있으며 이러한 목표에 대한 항체가 immunoassays에 의해 검출 될 수있다. 그러나, 이러한 assays은 자극 (및 따라서 기능적 효과)와 autoantibodies을 차단 구별 할 수 없습니다. eviden 명이 증가이 구별이 중요한 6,7입니다 CE. 또한 cardiotropic 항체의 수에 대한 목표는 여전히 미확인이며, 따라서 immunoassays에 의해 감지 할 수 있다고 가정 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 각각의 항원과는 독립적 기능 활성화 cardiotropic 항체의 검출하는 방법을 설립했습니다. 방법의 배경은 일반적으로 포유 동물 8,9 사이에 심장 단백질의 기능 영역에 대한 관찰 높은 호몰 로지입니다. 이 인간의 항원에 대한 감독이 심장 항체 성인 쥐 cardiomyocytes에 DCM 환자에서 IgG의 테스트를 할 수 있습니다 이외의 인간 대상 세포와 함께 상호 반응 제안한다. 우리의 방법은 3 단계로 구성 : 첫 번째는 IgG는 immunoadsorption 열 (PlasmaSelect, Teterow, 독일)에서 얻은 세 파로스 결합 항 IgG 항체를 사용하는 환자의 혈장에서 분리됩니다. 둘째, 성인 cardiomyocytes는 AP를 사용하여 Langendorff 재관류 장치에 collagenase 재관류에 의해 고립되어rotocol은 이전 작품에서 10,11을 수정했습니다. 획득 cardiomyocytes는 laminin 코팅 쏠의 coverglasses에 부착 Fura-2, 쉽게 (CA 2 +) 내용 12 세포 내 칼슘을 관찰하는 셀에 반입 할 수있는 칼슘 선택성 형광 염료를 물들입니다. 마지막 단계에서, 세포 단축 및 CA 2 환자 IgG의 효과 + 필드에 자극을 cardiomyocytes의 과도는 표준 역 형광등에 연결된 상업 myocyte 칼슘, 수축성 모니터링 시스템 (IonOptix, 밀튼, MA, USA)를 사용하여 온라인으로 감시하고 있습니다 현미경.

분야에서 세포 inotropy의 측정을위한 두 예제는 아래에 myocyte 칼슘 2 + 및 수축성 기록 시스템을 사용하여 성인 cardiomyocytes을 (그림 2) 자극. 그림 3은 제어 측정의 인상을줍니다, 그림 4에있는 동안 cardiodepressive 항체의 효과 있는 환자의 DCM가 표시됩니다. 에서 두 예, 초기 세포 단축 및 CA 2 + EB있는 superfusion 동안 과도은 분석을위한 전제 조건입니다, 명확하고 지속적인 봉우리을 나타냅니다. 우리의 응용 프로그램에 대한 최선의 14 % 정장, 낮거나 높은 초기 수축성과 cardiomyocytes은 종종 세포 단축의 부당한 변경 사항을 전시하는 경향이있는 동안 - 우리는 7 범위에서 초기 파 % 최대 H를 전시 세포가 있다는 경험 알아요. 제어 IgG의 신청 후 즉,</e...

제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.

절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

확장성 심근병증(Dilated cardiomyopathy, DCM)은 젊은 성인층에서 발생하는 심부전의 주요 원인 중 하나입니다1. 유전적 소인 및 독성 물질에의 노출...

다음 실험의 전반적인 목표는 확장성 심근병증 또는 자가면역 배경을 가진 기타 심장 질환 환자의 혈장 내 심장 친화성 항체를 검출하는 것입니다. 이는 두 번째 단계인 면역글로불린 G 정제를 위해, 항 IgG spheros 컬럼을 이용하여 환자 혈장을 1차 미니 면역 흡착함으로써 달성됩니다. 본 바이오어세이의 세포 기반을 제공하기 위해 성체 Wistar 쥐로부터 심실 심근세포를 분리합니다.다음으로, 심근세포가 챔버 커버슬립에 부착되도록 한 뒤 URA 2:00 AM으로 염색하여 수축 중 세포 내 칼슘 과도 현상을 관찰할 수 있게 하고, 환자의 IgG를 테스트하여 심근세포 수축력에 미치는 영향을 관찰합니다. 그 결과는 분리된 심근세포의 수축력 및 칼슘 과도 현상의 변화를 바탕으로 환자의 IgG에 친화성 항체가 포함되어 있는지 여부를 입증합니다. 항체 검출을 위한 표준 면역 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특정 항원에 의존하지 않으며, 자극 항체와 차단 항체를 구별할 수 있다는 점입니다.이 절차의 시연은 Google 및 저희 실험실의 기술 지원을 통해 진행됩니다. 이 절차를 시작하려면, 빈 econopak 컬럼에 2 mL의 환자 EDTA 혈장당 3 mL의 anti IgG spheros를 채워 미니 면역 흡착 컬럼을 준비하십시오. 그다음, anti IgG spheros 위에 필터를 배치하십시오.컬럼의 하단 팁을 절개하고 필터를 눌러 초당 약 한 방울의 유속이 되도록 조절합니다. 그런 다음 0.9% Sodium chloride 1플라스마 부피로 컬럼을 세 번 세척합니다. 플라스마가 anti IgG Spheros에 완전히 침전되면, 동일한 부피의 0.9% sodium chloride로 컬럼 내의 플라스마를 피펫팅하여 세척합니다. 다음으로 pH 2.8의 0.2 molar glycine hydrochloride 1플라스마 부피를 컬럼에 피펫팅하고 구슬(spheres)에 침전되도록 둡니다.그 다음 글리신 염산염을 컬럼에 동일한 부피만큼 추가합니다. 유출액을 15 milliliter 튜브에 수집하고, pH 8.0의 0.5 molar tris 염산염을 사용하여 pH를 7.3으로 조절함으로써 컬럼을 재생합니다. 0.9% sodium chloride를 두 부피만큼 사용하여 최종 세척한 후, 글리신 염산염을 플라스마 부피의 3배만큼 사용하여 세척합니다.해당 컬럼은 심근세포용 다음 혈장 샘플에 다시 사용할 수 있습니다. 수집된 IgG 분획은 먼저 분자량 컷오프가 100 kilodaltons인 셀룰로오스 에스테르 투석막 튜브에 IgG 분획을 채운 후, 실험 버퍼(experimental buffer)에 대해 투석해야 합니다. 그 다음 튜브를 1 liter EB에 넣고 4 °C에서 마그네틱 스터러로 천천히 교반합니다. 8시간 후, 투석 튜브를 3 liters의 신선한 EB로 옮겨 4 °C에서 20시간 동안 추가로 투석합니다.시료를 항온수조에서 57 °C로 30분 동안 가열합니다. 보체 인자를 비활성화하기 위해, 총 IgG 농도를 측정하고 각각 330 µg의 IgG를 포함하는 분주액을 준비합니다. 본 과정에서는 동봉된 원고에 따라 칼슘이 없는 분리 버퍼를 준비합니다.그다음 thermostat lanor perfusion system의 상단 저장조에 IB 80 milliliters를 채우고, 버퍼를 37 °C로 유지하며 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 30분 동안 에어레이션합니다. collagenase type two 약 7,000~10,000 units와 fatty acid-free BSA 174 milligrams를 112.5 µM calcium chloride가 포함된 IB 20 milliliters에 녹인 후, 필요에 따라 상단 저장조 내 분리 버퍼의 pH를 조절합니다.다음으로, thiopental 용액에 2,500 IU heparin을 첨가하여 kg당 375 µg의 thiopental을 사용하여 175~200g의 wistar rat을 마취합니다. 흉곽 절개 후, 대동맥궁이 온전한 상태로 심장을 조심스럽게 적출하여 얼음처럼 차가운 0% sodium chloride 용액으로 옮깁니다. 심장에서 혈액과 주변 조직을 제거합니다.그 다음, 이를 신선한 0.9% sodium chloride로 옮기고 대동맥을 노출시킵니다. Langendorff 시스템의 유량 조절기를 켜서 초당 2~3방울의 적하 속도를 얻습니다. 그 후 심장을 캐뉼라에 연결합니다.남아 있는 혈액을 씻어내기 위해 초당 한 방울의 유속으로 최대 3분 동안 관류합니다. 그 후, LOR 시스템에서 IB를 순환시킵니다. 이제 상단 저장조에서 버퍼 20 milliliters를 제거합니다.리저버에 콜라게나제 용액을 채우고, 총 부피가 80 milliliters가 되도록 필요한 만큼 버퍼를 추가로 채웁니다. 그런 다음 소화 용액을 27분 동안 더 순환시킵니다. 이어서 캐뉼라에서 심장을 분리합니다.심방과 대동맥을 제거한 후, 심실을 작은 조각으로 다집니다. 소화 완충액이 하단 저장조로 흘러 들어가게 합니다. 부피를 최대 40 milliliters로 줄여, 95%oxygen, 5%carbon dioxide를 지속적으로 공급하며 다진 심실을 10분에서 15분 동안 추가로 소화시킵니다.그 후, 세포 현탁액을 200 micron 메쉬 크기의 거즈로 걸러 50 milliliter 튜브에 담습니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 40 3G에서 2분 동안 원심분리하여 세포의 칼슘 함량을 복원합니다. 실온에서 세포를 10 milliliters로 재현탁합니다.200 µM calcium chloride가 포함된 IB를 다시 원심분리하고 세포를 10 mL에 재현탁합니다. 500 µM calcium chloride가 포함된 IB를 처리합니다. 최종 원심분리 후, 심근세포를 멸균 여과된 EB에 50,000 cells/mL 밀도로 재현탁합니다.4-웰 챔버의 커버 글라스를 웰당 10 µg의 laminin으로 코팅하고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 그런 다음 각 웰에 심근세포 현탁액 1 mL를 채웁니다. 팁을 자른 마이크로 파이펫을 사용하여 세포가 상온에서 1시간 동안 부착되도록 합니다. 1 mg/mL fira 2:00 AM 스톡 솔루션 10 µL를 5 mL의 eb에 희석하고, 염색 용액을 암소에 보관합니다.다음으로, 커버 글라스에서 완충액과 부착되지 않은 세포를 제거하고 염색액 0.5 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 각 웰에서 세포를 중간 속도로 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 이후, 염색액을 제거하고 1 milliliter의 eb로 세포를 한 번 세척합니다.그런 다음, 이 절차에 따라 각 웰에 0.5 milliliters EB를 추가하고, 커버 글라스를 심근세포 칼슘 및 수축력 기록 시스템에 연결된 도립 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유입 및 유출 튜브가 있는 맞춤 제작 전극을 첫 번째 웰에 배치하고, 분당 1 milliliter의 eb로 심근세포를 관류합니다.20 V, 1 Hz, 펄스당 5 ms의 조건으로 전기 자극을 시작하고, 세포가 자극에 적응하도록 약 2분간 둡니다. 뚜렷한 가로무늬와 일정한 수축을 보이는 온전한 막대 모양의 심근세포를 선택하여 시야 중심에 위치시킵니다. 그런 다음 카메라 채널을 열고, 세포 프레임 어댑터를 회전시키고 현미경 스테이지를 이동하여 비디오 영역 내에서 세포가 수평이 되도록 방향을 맞춥니다.비디오 영역의 검출 제어 요소 경계를 조정합니다. 형광 채널을 켜고 10~15회의 수축을 기록하여 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 현상을 얻습니다. 그 후, 형광 염색제의 퇴색을 방지하기 위해 현미경 광원 채널을 끕니다.3방향 밸브를 사용하여 흐름을 EB에서 샘플 바이패스로 전환하고, 환자의 IgG 1 mL로 심근세포를 관류합니다. 공기가 웰에 도달하기 직전에 펌프를 멈춘 뒤, 광채널을 켜고 10~15회의 수축을 추가로 기록하여 급성 세포 반응을 얻습니다. 그런 다음 기록을 일시 중지하고 광채널을 다시 끈 후, 2분 및 5분 뒤에 기록을 반복하고 완료되면 웰에서 전극을 제거합니다. 마지막으로, IonWizard 소프트웨어의 edge length/length 및 URA two numeric subtracted/ratio 윈도우를 각각 사용하여 세포 단축과 칼슘 트랜지언트를 분석합니다.다음으로, 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 현상 정점 높이로부터 급성, 2분 및 5분 반응의 백분율 변화를 계산합니다. 다음은 대조군 측정의 대표적인 예시입니다. 세포 단축 및 칼슘 과도 현상을 IgG 과류 주입 전, 그리고 IgG 과류 주입 직후 2분 및 5분 시점에 온라인으로 모니터링하였습니다.다음은 심장 억제 항체를 포함하는 IgG 샘플의 측정 예시입니다. IgG 관류 전, 그리고 IgG 관류 직후 2분 및 5분 후에 세포 단축과 칼슘 과도 현상을 온라인으로 측정하였습니다. 이 영상을 시청하신 후에는, 분리된 성인 쥐 심근세포의 세포 단축 및 칼슘 과도 현상에 미치는 분리된 IgG의 영향을 측정하여 환자 혈장 내 심장 독성 항체를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마음에서 기능적 면역 세포를 분리를위한이 방법은 이러한 세포의 감소 반응의 결과로, 원치 않는 면역 세포 활성화의 원인이 collagenase의 소화의 종래의 방법에 대한 대안을 제공합니다. 격리 우리의 방법은 효소 소화와 관련된 문제를 피함으로써 기능 심장병 면역 세포를 산출.

심장 기능 면역 세포의 분리

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

야생형 마우스와 돌연변이 마우스의 개별 심근세포는 수축성과 칼슘 과도 상태를 연구하기 위해 심장에서 분리할 수 있습니다. 이를 통해 모든 원인에서 심장 기능 장애에 대한 세포 기능 장애의 기여도를 특성화할 수 있습니다.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

여기, 우리가 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서 단일 셀 심 방 cardiomyocytes의 격리에 대 한 최적화, Langendorff 기반 절차를 설명합니다. 심장 구멍의 intraluminal 압력의 수동 조절 기능 그대로 myocytes 흥분-수축-결합 연구에 대 한 적합 한를 구현 됩니다.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

이 프로토콜은 피부 심장 근구를 사용하여 심장 기능의 추출 및 평가 기술을 단계별로 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론은 마우스에서 남성에 이르기까지 다른 심장 위치에서 수집 할 수있는 작은 냉동 생검을 사용하여 myofilament 기능의 측정 및 급성 변조를 허용합니다.

피부 심근세포를 이용한 심장 기능의 체외 평가

우리는 선행 관류 기술에 의해 고품질의 개별 마우스 심장 세포를 격리하기위한 simple 방법을 개발했습니다. 이 방법은 Langendorff가 없으며 심실 및 심방 심근 세포 또는 심장 섬유아세포 또는 선조와 같은 간질 세포를 분리하는 데 유용합니다.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

인간 iPSC 유래 심근 세포의 수축 기능 및 세포 무결성의 변화 분석은 비임상 약물 개발에 매우 중요합니다. 하이브리드 96웰 세포 분석 시스템은 임상 단계로의 안전한 전환에 필요한 신뢰할 수 있는 인간 관련 결과를 위해 실시간 및 생리학적 방식으로 두 파라미터를 모두 처리합니다.

전임상 심장 위험 평가를 위해 인간 iPSC 유래 심근 세포의 구조적 및 수축성 변화를 평가하기위한 하이브리드 세포 분석 시스템

여기서 우리는 유세포 분석을 사용하여 혈관 내 또는 내피 공간에서의 위치를 기반으로 심근 B- 림프구의 정량화 및 분화를위한 프로토콜을보고합니다.

유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

이 프로토콜은 전임상 개발 중 약물에 의한 수축성 변화를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼인 MyoBLAZER 시스템을 사용하여 기증자 심장에서 성인 인간 원발성 심근세포의 수축성을 측정하는 방법을 설명합니다.

고립된 성인 인간 원발성 심근세포의 심장 수축성 측정

우리는 cytosolic CA를 평가하는 접근 방법을...

Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에

학습하세요 확장성 심근증 환자의 심근세포 기능에 대한 항체 효과 측정 방법을. 흰쥐 심근세포에서 세포 수축과 칼슘 변화를 분석하여 심장 자가항체를 검출하는 이 기법은 자가면역 심장질환 연구에 활용됩니다.

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