절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정

다음 실험의 전반적인 목적은 확장성 심근병증 또는 자가면역 배경을 가진 기타 심장 질환 환자의 혈장 내 심장 친화성 항체(cardio tropic antibodies)를 검출하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 면역글로불린 G를 정제하기 위해 anti IgG spheros 컬럼에서 환자 혈장을 1차 미니 면역 흡착시켜 달성합니다. 이 바이오어세이의 세포 기반을 마련하기 위해 성체 Wistar 쥐로부터 심실 심근세포를 분리합니다.

다음으로, 심근세포가 챔버 커버슬립에 부착되도록 한 뒤 수축 중의 세포 내 칼슘 일시적 변화(calcium transient)를 관찰할 수 있도록 URA 2:00 AM으로 염색하며, 이후 환자의 IgG를 처리하여 심근세포 수축력에 미치는 영향을 테스트합니다. 결과는 분리된 심근세포의 수축력 및 칼슘 일시적 변화의 변동을 바탕으로 환자의 IgG에 친화성 항체가 포함되어 있는지 여부를 보여줍니다. 항체 검출을 위한 표준 면역 분석법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 특정 항원에 의존하지 않으며, 자극 항체와 차단 항체를 구별할 수 있다는 점입니다.

절차 시연은 Google의 지원과 본 연구실의 기술 지원을 통해 진행됩니다. 이 절차를 시작하려면, 빈 econopak 컬럼에 환자의 EDTA 혈장 2 mL당 anti IgG spheros 3 mL를 채워 미니 면역 흡착 컬럼을 준비하십시오. 그 다음, anti IgG spheros 위에 필터를 배치하십시오.

컬럼의 하단 팁을 절개하고 필터를 눌러 초당 약 한 방울의 유속이 되도록 조절합니다. 그다음 0.9% Sodium chloride를 혈장 부피의 1배만큼 사용하여 컬럼을 3회 세척합니다. 혈장이 anti IgG Spheros에 완전히 잠기면 동일한 부피의 0.9% sodium chloride로 세척합니다. 이어서 pH 2.8의 0.2 molar glycine hydrochloride를 혈장 부피의 1배만큼 컬럼에 피펫팅하여 상(phase)에 잠기도록 둡니다.

그 다음, 동일한 부피의 glycine hydrochloride를 컬럼에 추가합니다. 유출액을 15 milliliter 튜브에 수집하고, pH 8.0의 0.5 molar tris hydrochloride를 사용하여 pH를 7.3으로 조정하여 컬럼을 재생합니다. 0.9% sodium chloride 2분량으로 최종 세척한 후, glycine hydrochloride 3플라즈마 부피로 세척합니다.

해당 컬럼은 심근세포에 사용할 다음 혈장 샘플에 다시 사용할 수 있습니다. 수집된 IgG 분획은 먼저 분자량 컷오프가 100 kilodaltons인 셀룰로오스 에스테르 투석막 튜브에 IgG 분획을 채운 후, 실험 버퍼(experimental buffer)로 투석해야 합니다. 그다음 튜브를 1 liter EB에 넣고 4 °C에서 마그네틱 스터러로 천천히 교반합니다. 8시간 후, 투석 튜브를 3 liters의 신선한 EB로 옮겨 4 °C에서 20시간 동안 추가로 투석합니다.

항온수조에서 샘플을 57°C로 30분 동안 가열하십시오. 보체 인자를 불활성화하려면 총 IgG 농도를 측정하고, 각각 330 µg의 IgG를 포함하도록 분주액을 준비하십시오. 이 과정에서 동봉된 원고에 따라 칼슘 프리 분리 버퍼를 준비하십시오.

그다음 써모스탯 라노 퍼퓨전 시스템(thermostat lanor perfusion system)의 상단 저장조에 IB 80 milliliters를 채우고, 버퍼를 37 °C로 유지하며 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 30분 동안 폭기합니다. 약 7,000~10,000 units의 collagenase type two와 112.5 micromolar calcium chloride를 포함하는 IB 20 milliliters에 174 milligrams의 fatty acid-free BSA를 녹인 후, 필요한 경우 상단 저장조에 있는 분리 버퍼의 pH를 조절합니다.

다음으로, thiopental 용액에 2,500 IU heparin을 첨가하여 375 µg/kg의 용량으로 175~200 g의 wistar rat을 마취합니다. 흉곽 절개 후, 대동맥궁이 손상되지 않도록 주의하여 심장을 적출하고, 이를 얼음처럼 차가운 0% sodium chloride 용액에 옮깁니다. 심장에서 혈액과 주변 조직을 제거합니다.

그런 다음 이를 신선한 0.9% sodium chloride로 옮기고 대동맥을 노출시킵니다. Langor 시스템의 유량 조절기를 켜서 초당 2~3방울의 낙하 속도를 얻습니다. 그 후 심장을 캐뉼라에 연결합니다.

남은 혈액을 씻어내기 위해 초당 한 방울의 유속으로 최대 3분 동안 관류합니다. 그 후, LOR 시스템에서 IB를 순환시킵니다. 이제 상부 저장조에서 20 milliliters 버퍼를 제거합니다.

저장조에 콜라게나제 용액을 채우고, 전체 부피가 80 milliliters가 되도록 필요한 만큼의 완충액을 추가로 채웁니다. 그다음 소화 용액을 27분 동안 더 순환시킵니다. 이어서 캐뉼라에서 심장을 분리합니다.

심방과 대동맥을 제거한 후, 심실을 작은 조각으로 자릅니다. 소화 완충액이 하단 저장조로 흘러 들어가게 합니다. 부피를 최대 40 milliliters로 줄인 다음, 95%oxygen, 5%carbon dioxide를 지속적으로 공급하며 잘게 자른 심실을 10~15분 동안 추가로 소화시킵니다.

그 후, 세포 현탁액을 200 micron 메쉬 크기의 거즈로 걸러 50 milliliter 튜브에 담습니다. 마지막으로, 세포 현탁액을 40 3G에서 2분 동안 원심분리하여 세포의 칼슘 함량을 복구합니다. 상온에서 세포를 10 milliliters에 재현탁합니다.

200 µM 염화칼슘이 포함된 IB를 다시 원심분리하고 세포를 10 mL에 재현탁합니다. 500 µM 염화칼슘이 포함된 IB를 사용합니다. 최종 원심분리 후, 심근세포를 멸균 여과된 EB에 1 mL당 50,000 cells의 밀도로 재현탁합니다.

4웰 챔버의 커버 글라스를 웰당 10 µg의 laminin으로 코팅하고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 그 다음 각 웰에 심근세포 현탁액 1 mL를 채웁니다. 팁 끝을 자른 마이크로 파이펫을 사용하여 세포를 분주하고 실온에서 1시간 동안 부착시킵니다. 1 mg/mL fira 2:00 AM 스톡 솔루션 10 µL를 5 mL의 eb로 희석하고, 염색 용액을 암소에 보관합니다.

다음으로, 커버 글라스에서 버퍼와 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 염색액 0.5 milliliters를 피펫으로 분주합니다. 각 웰에서 세포를 적당히 흔들어주며 10분 동안 배양합니다. 그 후, 염색액을 제거하고 세포를 1 milliliter의 eb로 한 번 세척합니다.

그런 다음, 이 절차에 따라 각 웰에 0.5 milliliters EB를 추가하고, 커버 글라스를 심근세포 칼슘 및 수축력 기록 시스템과 연결된 도립 형광 현미경 아래에 놓습니다. 유입 및 유출 튜브가 포함된 맞춤 제작 전극을 첫 번째 웰에 배치하고, 분당 1 milliliter의 eb로 심근세포를 관류합니다.

20 volt, 1 hz, 펄스당 5 ms 지속 시간으로 전기 자극을 시작하고, 약 2분 동안 세포가 자극에 적응하도록 합니다. 뚜렷한 가로무늬가 있고 일정하게 수축하는 온전한 막대 모양의 심근세포를 선택하여 시야 중심에 위치시킵니다. 그런 다음 카메라 채널을 열고, 세포 프레이밍 어댑터를 회전시키고 현미경 스테이지를 이동하여 비디오 영역 내에서 세포가 수평이 되도록 조절합니다.

비디오 영역의 검출 제어 요소 경계를 조정합니다. 형광 채널을 켜고 10~15회의 수축을 기록하여 초기 세포 단축 및 칼슘 일시적 변화(calcium transient)를 얻습니다. 그 후, 형광 염색제의 퇴색을 방지하기 위해 현미경 광원 채널을 끕니다.

3방향 밸브를 사용하여 흐름을 EB에서 샘플 바이패스로 전환하고, 환자 IgG 1 mL로 심근세포를 초융합(super Fuse)합니다. 공기가 웰에 도달하기 직전에 펌프를 멈추고, 광채널을 켠 후 10~15회의 수축을 추가로 기록하여 급성 세포 반응을 얻습니다. 그 다음 기록을 일시 중지하고 광채널을 다시 끈 뒤, 2분과 5분 후에 기록을 반복하고 완료되면 웰에서 전극을 제거합니다. 마지막으로, IonWizard 소프트웨어의 edge length/length 및 URA two numeric subtracted/ratio 윈도우를 각각 사용하여 세포 단축과 칼슘 과도 현상을 분석합니다.

다음으로, 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 현상(calcium transient)의 피크 높이를 기준으로 급성 반응, 2분 및 5분 반응의 백분율 변화를 계산합니다. 다음은 대조군 측정의 대표적인 예입니다. IgG를 이용한 과류(superfusion) 전과 IgG 과류 직후 2분 및 5분 후에 세포 단축과 칼슘 과도 현상을 온라인으로 모니터링하였습니다.

다음은 심장 억제 항체를 포함하는 IgG 샘플의 측정 사례입니다. 세포 단축과 칼슘 과도 현상은 IgG 과류 주입 전, 그리고 IgG 과류 주입 직후 2분과 5분에 온라인으로 측정되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 성인 쥐 심근세포의 세포 단축과 칼슘 과도 현상에 미치는 단리된 IgG의 영향을 측정하여 환자 혈장 내 심장 독성 항체를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.