절연 Cardiomyocytes의 세포 기능에 대한 항체 효과 측정
March 8th, 2013
제시 방법은 절연 쥐 cardiomyocytes의 휴대폰 단축하고 세포 내 칼슘 과도에 절연 환자의 면역 글로불린의 영향을 분석하여, 관계없이 특정 항원의, 확장 성 심근증 환자의 혈장에 기능을 효과적으로 cardiotropic autoantibodies를 감지 할 수있는 방법을 제공합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 확장성 심근병증 또는 자가면역 배경이 있는 기타 심장 질환 환자의 혈장에서 심폐 항체를 검출하는 것입니다. 이는 두 번째 단계로 면역글로불린 G를 정제하기 위해 항 IgG 스페로스 컬럼에서 환자 혈장의 초기 미니 면역 흡수를 통해 달성됩니다. 심실 심근세포는 이 생물학적 분석을 위한 세포 기반을 제공하는 성체 위스타쥐에서 분리됩니다.
다음으로, 심근세포를 챔버 커버 슬립에 부착하고 URA 2:00 AM으로 염색하여 수축 중 세포 내 칼슘 과도도를 관찰할 수 있도록 한 다음 환자의 IgG를 검사하여 심근세포 수축성에 미치는 영향을 관찰합니다. 결과는 환자의 IgG에 분리된 심근세포의 수축성 및 칼슘 과도 변화의 변화를 기반으로 영양성 항체가 포함되어 있는지 여부를 보여줍니다. 항체 검출을 위한 표준 면역분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 특정 항원과 독립적이며 자극 항체와 차단 항체를 구별할 수 있다는 것입니다.
절차를 시연하면 Google을 이용하고 실험실의 기술 지원을 받을 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 빈 이코노팩 컬럼에 2밀리리터 환자 EDTA 혈장당 3밀리리터의 항 IgG 스페로를 채워 미니 면역 흡수 컬럼을 준비합니다. 다음으로, 항 IgG 스페로 위에 필터를 놓습니다.
컬럼의 아래쪽 끝을 잘라서 열고 필터를 눌러 초당 약 1방울의 유속에 도달합니다. 그런 다음 0.9% 염화나트륨의 한 플라즈마 부피로 컬럼을 세 번 세척하고, 플라즈마가 안티 IgG 스페로스에 완전히 침지되었을 때 컬럼의 플라즈마를 동일한 부피의 0.9%염화나트륨으로 세척합니다. 다음으로, pH 2.8에서 0.2 몰 글리신 염산염의 혈장 부피 1개를 컬럼에 피펫팅하고 인에 침지시킵니다.
그런 다음 컬럼에 다른 부피의 글리신 염산염을 추가합니다. 15ml 튜브에 흐름을 수집하고 p pH 8.0에서 0.5몰 트리스 하이드로클로라이드로 pH를 7.3으로 조정하여 컬럼을 재생합니다. 0.9% 염화나트륨 2양으로 최종 세척 후 글리신 염산염의 3가지 혈장 부피로 세척하십시오.
이 컬럼은 심근세포에 사용하기 위한 다음 혈장 샘플에 사용할 수 있습니다. 수집된 IgG 분획은 먼저 100킬로달톤에서 분자량 컷오프로 셀룰로오스 에스테르 투석막 튜브에 IgG 분획을 충전하여 실험용 완충액에 대해 투석해야 합니다. 그런 다음 튜브를 1리터 EB에 넣고 섭씨 4도에서 자기 교반으로 천천히 약동합니다.8시간 후, 투석 튜브를 3리터의 새로운 EB로 옮기고 투석 후 섭씨 4도에서 또 다른 20시간 동안 투석합니다.
샘플을 수조에서 섭씨 57도에서 30분 동안 끓입니다. 보체 인자를 비활성화하려면 총 IgG 농도를 측정하고 각각 330마이크로그램의 IgG를 함유한 부분 표본을 준비합니다. 이 절차에서는 동봉된 원고에 따라 무칼슘 분리 완충액을 준비합니다.
그런 다음 온도 조절기 lanor 관류 시스템의 상부 저장소에 80ml의 IB를 채우고 버퍼를 섭씨 37도로 유지하고 95% 산소, 5% 이산화탄소로 30분 동안 폭기합니다. 대략 7, 000에서 10, 20 밀리리터에 있는 콜라겐 분해 효소 유형 2 및 174 밀리그램 지방산 자유로운 BSA의 000 단위를 녹인다. 112.5 마이크로몰 염화칼슘을 함유한 IB를 만들고 필요한 경우 상부 저장소에서 분리 버퍼의 pH를 조정합니다.
다음으로, 175-200g의 wistar rat를 킬로그램당 375마이크로그램으로 티오펜탈을 사용하여 티오펜탈 용액에 2, 500IU 헤파린을 첨가하여 마취합니다. 개흉술 후, 손상되지 않은 대동맥궁으로 심장을 조심스럽게 절제하고 얼음처럼 차가운 염화나트륨에서 얼음처럼 차가운 0% 염화나트륨으로 옮깁니다. 심장에서 혈액과 주변 조직을 제거합니다.
그런 다음 신선한 0.9% 염화나트륨으로 옮기고 대동맥을 노출시킵니다. langor 시스템의 감속기를 켜서 초당 2-3의 낙하 속도를 얻으십시오. 그런 다음 캐뉼라에 심장을 부착합니다.
초당 한 방울의 유속으로 최대 3분 동안 관류하여 남아 있는 혈액을 씻어냅니다. 그 후 LOR 시스템에서 IB를 순환시킵니다. 이제 상단 저장소에서 20 밀리리터 버퍼를 제거하십시오.
용기에 콜라겐분해효소 용액을 채우고 80밀리리터에 도달할 때까지 필요한 만큼 완충액을 다시 채웁니다. 그런 다음 소화 용액을 27분 더 순환시킵니다. 다음으로, 캐뉼라에서 심장을 분리합니다.
심방과 대동맥을 제거한 다음 심실을 작은 조각으로 자릅니다. 분해 버퍼가 하단 저장소로 흐르도록 합니다. 부피를 최대 40ml로 줄여 95%산소, 5%이산화탄소로 연속 폭기하에서 10-15분 동안 다진 심실을 더 소화합니다.
그런 다음 200미크론 메쉬 크기의 거즈를 통해 세포 현탁액을 50ml 튜브에 여과합니다. 마지막으로, 40 3G에서 2분 동안 세포 현탁액을 원심분리하여 세포의 칼슘 함량을 회복합니다. 실온에서 세포를 10ml로 재현탁시킵니다.
200 마이크로몰의 염화칼슘을 함유한 IB를 다시 원심분리하고 10밀리리터의 세포를 재현탁합니다. 500 마이크로 몰 염화칼슘을 함유 한 IB. 마지막 원심분리 후에, resus는, 50의 조밀도에 메마른 걸러진 EB에 있는 cardiomyocytes, 밀리리터 당 000의 세포를 중단한다.
웰당 10마이크로그램의 라미닌으로 4웰 챔버에 커버 유리를 코팅하고 완전히 마를 때까지 기다립니다. 그런 다음 심근세포 현탁액 1ml를 각 웰에 채웁니다. 절단 팁이 있는 마이크로 피펫을 사용하여 실온에서 1시간 동안 세포가 접착되도록 하고 10마이크로리터/밀리리터 피라 2:00 AM 원액을 5밀리리터에 희석하고 염색 용액을 어두운 곳에 보관합니다.
다음으로, 커버 안경 피펫에서 0.5 밀리리터의 염색 용액에서 완충액과 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 각각에서 적당한 흔들림으로 10분 동안 세포를 잘 배양합니다. 그 후, 염색 용액을 제거하고 1 밀리리터의 eb로 세포를 한 번 씻으십시오.
그런 다음 이 절차에서 각 웰에 0.5ml EB를 추가하고 근세포 칼슘 및 수축성 기록 시스템에 연결된 역 형광 현미경 아래에 커버 유리를 놓습니다. 유입 및 유입 튜브가 있는 맞춤형 전극을 첫 번째 웰과 슈퍼에 배치합니다. 심근세포를 분당 1밀리리터로 융합합니다.
20볼트, 펄스당 1헤르츠 및 5밀리초 동안 전기 자극을 시작하고 약 2분 동안 세포가 자극에 적응할 때까지 기다립니다. 선명한 줄무늬와 지속적인 수축을 가진 온전한 막대 모양의 심근세포를 선택하고 시야의 중앙에 배치합니다. 그런 다음 카메라 채널을 열고 셀 프레이밍 어댑터를 회전시키고 현미경 스테이지를 이동하여 비디오 영역 내에서 셀을 수평으로 배치합니다.
비디오 영역의 감지 제어 요소의 경계를 조정합니다. 형광 채널을 켜고 10-15회의 수축을 기록하여 초기 세포 단축 및 칼슘 과도 상태를 얻습니다. 그런 다음 형광 염색이 표백되지 않도록 현미경 광 채널을 끄십시오.
3방향 판막을 사용하여 EB에서 시료 바이패스로 흐름을 전환하고 1ml의 환자 IgG로 심근세포를 수퍼 융합합니다. 공기가 도달하기 직전에 펌프를 멈추고 광 채널을 켠 다음 10-15 번의 수축을 기록하여 급성 세포 반응을 얻습니다. 다음 기록을 멈추고 가벼운 수로를 다시 끄고, 2 및 5 분 후에 기록을 반복하고 끝에 끝날 때 우물에서 전극을 철수하고, 가장자리 길이 내리침 길이 및 URA 2개의 수에 의하여 빼진 내리침 비율 창을 각각 사용하여 이온 마법사 소프트웨어로 일시적인 세포 단축 그리고 칼슘을 분석하십시오.
다음으로, 초기 세포 단축 및 칼슘 일시적 피크 높이로 인한 급성, 2분 및 5분 반응에 대한 백분율 변화를 계산합니다. 다음은 제어 측정의 대표적인 예입니다. 세포 단축 및 칼슘 일시적 현상은 IgG와의 과융합 전에 온라인으로 모니터링되었으며 IgG와의 과융합 직후 2분 및 5분 후에 모니터링되었습니다.
다음은 심장 억제 항체를 포함하는 IgG 샘플의 측정 예입니다. 세포 단축 및 칼슘 과도 현상은 IgG와의 과융합 전에 온라인으로 측정되었으며 IgG와의 과융합 직후 2분 및 5분 후에 측정되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 고립된 성인 적색 심근세포의 칼슘 과도상태에서 세포 단축에 대한 분리된 IgG의 효과를 측정하여 환자 혈장에서 심혈관성 항체를 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 연구는 확장성 심근병증 환자의 기능적 유효 심장 자가항체를 검출하는 방법을 제시합니다. 이 기법은 분리된 환자 면역글로불린이 분리된 쥐 심근 세포의 세포 수축 및 세포내 칼슘 일시적 변화에 미치는 영향을 분석합니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 심장학
- 면역학
- 세포 생물학
배경
- 확장성 심근병증은 자가면역 반응과 관련이 있습니다.
- 심장 자가항체의 검출은 심장 질환을 이해하는 데 중요합니다.
- 기존 방법은 종종 특정 항원에 의존합니다.
- 자극 항체와 차단 항체를 구분할 수 있는 기법이 필요합니다.
연구 목적
- 환자 혈장에서 심장 자가항체를 검출합니다.
- 환자 IgG가 심근 세포 수축성에 미치는 영향을 평가합니다.
- 특정 항원에 의존하지 않는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 항-IgG spheros 컬럼에 환자 혈장의 소량 면역흡착.
- 성인 Wistar 쥐로부터 심실 심근 세포의 분리.
- 세포내 칼슘 일시적 변화를 관찰하기 위한 심근 세포의 염색.
- 환자 IgG가 심근 세포 수축성에 미치는 영향의 평가.
주요 결과
- 수축성 및 칼슘 일시적 변화의 변화는 심장 자가항체의 존재를 나타냅니다.
- 이 방법은 다른 유형의 항체를 성공적으로 구분합니다.
- 결과는 이 기법이 표준 면역 분석보다 효과적임을 보여줍니다.
- 발견 사항은 심장 질환의 자가면역 메커니즘을 이해하는 데 기여합니다.
결론
- 제시된 방법은 심장 자가항체를 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 접근 방법입니다.
- 확장성 심근병증의 자가면역 반응 연구 능력을 향상합니다.
- 이 기법은 심장학에서 진단 능력을 향상시킬 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to detect functionally active cardiotropic antibodies in patient plasma without requiring prior antigen identification, addressing a key gap in autoimmune heart disease research. By measuring effects on cardiomyocyte contractility and calcium transients, it provides a functional readout that distinguishes stimulating from blocking autoantibodies, supporting target de-risking in early discovery. The antigen-independent approach enhances predictive confidence for therapeutic intervention strategies in dilated cardiomyopathy and related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting autoantibodies that directly modulate cardiomyocyte function.
- Operational Value: Provides a functional assay system independent of known antigens, expanding target space for autoimmune cardiology.
- Predictive Value: Discriminates between stimulating and blocking antibody effects, improving confidence in mechanism-based target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, real-time readouts of cell shortening and calcium transients for compound or antibody screening.
- Reproducibility: Standardized isolation and staining protocols support consistent cellular responses across experiments.
- Platform Utility: Establishes a reusable bioassay for evaluating immunomodulatory candidates in cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses adult rat cardiomyocytes with high homology to human cardiac proteins, enhancing translational potential.
- Mechanistic De-risking: Links autoantibody presence to functional cellular outcomes, supporting causal inference in disease models.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of antibody effects on contractility and calcium handling in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immunological insights that inform preclinical candidate selection in cardiovascular autoimmune research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking patient-derived IgG to measurable changes in cardiomyocyte physiology.
- Screening: Delivers quantitative, real-time measurements of contractility and calcium flux for evaluating immunomodulatory effects.
- Analytics: Enables statistical comparison of acute and time-dependent responses to IgG superfusion, supporting dose-response and kinetic profiling.
- Translational Research: Utilizes a disease-relevant cellular system with cross-species antigen homology, facilitating extrapolation to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for screening immunomodulatory compounds or biologics in cardiovascular autoimmune contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into autoantibody-mediated cardiomyocyte dysfunction, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible functional readouts that minimize assay variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying functionally active autoantibodies early, reducing late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of targets based on antibody-mediated functional effects in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiomyocyte isolation, calcium imaging, and contractility monitoring systems.
- Dependent on Langendorff perfusion equipment, fluorescent microscopy, and ion/wizard-based analysis software.
- Necessitates cross-team standardization for IgG purification, cell preparation, and stimulation protocols.
- Adaptation to other model systems may require validation of antigen homology and cellular responsiveness.
- Practical limitations include tissue access, cell viability windows, and the need for specialized perfusion and imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
IgG Isolation from Patient Samples
4:39
Isolation of Rat Cardiomyocytes
8:27
Fura-2 Staining of Cardiomyocytes
9:43
Recording of Cell Shortening and Ca2+ Transients
12:24
Results: The Measurement of an IgG Sample Containing Cardiodepressive Antibodies
13:15
Conclusion
