Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

설명된 실험의 전반적인 목표는 뉴런의 여러 위치에서 마이크로미터 미만 및 밀리초 미만의 해상도로 개별 신경 세포에 의한 막 전위 신호 통합 및 정보 처리를 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 멤브레인 전위 과도 현상에 해당하는 광 강도의 작은 분수 변화를 기록할 수 있도록 적절한 감도를 가진 이미징 설정을 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 슬라이스 표면에 가까운 단일 초점면에서 길고 손상되지 않은 과정을 가진 뉴런을 효과적으로 이미징하기 위해 적절한 해부학적 구조를 가진 뉴런을 선택합니다.

그런 다음 미리 선택된 뉴런에 전압 민감성 염료를 로드하여 막 전위 변화를 광학적으로 추적할 수 있습니다. 결과는 축삭돌기, 수상돌기 및 수지상 가시에서 막 전위 신호를 모니터링하여 개별 신경 세포에 의한 전기 신호 통합에 대한 정보를 얻는 이 접근 방식의 고유한 기능을 보여줍니다. 세포 신경 생리학에서.

기존 전기생리학의 두 가지 오랜 한계, 전극 측정의 낮은 공간 분해능, 축삭 담보 또는 수지상 가시와 같은 작은 구조에서 기록할 수 없는 기능 때문에 새로운 도구가 개발되고 있습니다. 이러한 단점을 극복하기 위해 패치 전극 접근법은 신경의 모든 부분에서 병렬 기록을 허용하는 광학 기술과 결합될 수 있습니다. 여기에서는 이러한 기술, 즉 단일 척추 분해능을 가진 멤브레인 전위 과도 현상의 다중 측면 광학 기록에 대해 설명합니다.

이 실험에서는 정립 현미경과 3대의 카메라를 사용하여 균일한 조명을 조정합니다. 먼저 레이저 빔 경로에 적절한 중성 밀도 필터를 삽입합니다. 다음으로, 표준 형광 슬라이드의 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.

모니터 화면에서 시야의 CCD 이미지를 관찰하면서 에피 형광 콘덴서의 적절한 액추에이터를 사용하여 석영 라이트 가이드의 수신단 위치와 라이트 가이드의 출력단 위치를 조정하여 시야의 중심적이고 균일한 조명을 달성합니다. 진동 소음을 확인하려면 표면에 형광등이 없는 표시가 있는 표준 형광 슬라이드를 사용하십시오. 연속 모드에서 neuro CCD로 광도를 기록합니다.

대물렌즈를 블랙 마크의 어두운 가장자리에 초점을 맞추면 2킬로헤르츠 프레임 속도에서 약 100밀리초 동안 광도를 기록합니다. 그런 다음 균일하게 조명된 영역에서 빛을 받는 약 20픽셀과 블랙 마크의 가장자리를 따라 약 20픽셀에서 빛을 받는 분수 광 강도 트레이스의 공간 평균을 표시합니다. 고대비 가장자리를 가진 픽셀의 공간 평균에서 과도한 노이즈는 시스템의 진동 노이즈를 반영합니다.

셔터를 방진 테이블에 장착하여 셔터를 열 때 광학 기록에서 진동 잡음이 발생하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이것은 중요한 단계입니다. 플라스틱 나사와 방진 소재를 사용하여 셔터를 장착하여 광학 녹음 시스템에서 포착할 수 있는 음향 진동 소음을 줄입니다.

진동을 차단하려면 이미지의 날카로운 가장자리를 덮고 있는 픽셀의 진동 소음이 촬영 노이즈보다 작아질 때까지 진동 차단 테이블을 조정합니다. 기계적 진동이 현미경 내시경으로 전달되지 않도록 테이블의 장비 와이어가 느슨해야 합니다. 이 절차에서는 회전 디스크 컨포칼 시스템으로 관심 있는 개별 신경 세포에서 EGFP를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 표준 절차에 따라 300-400미크론 두께의 뇌 절편을 준비합니다.

슬라이스에서 EGFP로 라벨링된 뉴런을 시각화합니다. 다음으로, 손상되지 않은 수지상 축삭돌기 나무가 있고 막전위 이미징을 위해 슬라이스 표면에 가깝게 평행하게 실행되는 프로세스가 있는 뉴런을 선택합니다. 그런 다음 약 15초 동안 음압을 가하여 팁의 유리 패치 피펫을 무염료 세포 내 용액으로 전극 테이퍼의 최대 2/3까지 채웁니다.

그 후, 세포 내 용액에 용해된 멤브레인 IMP 투과 전압 민감성 염료를 포함하는 용액으로 전극을 되채웁니다. 이제 염료를 전극에 로드한 후 1분 이내에 이전에 선택한 뉴런을 패치합니다. 피펫을 수조로 내리기 전에 약 10mm의 수은을 낮은 양압으로 가하고 전극을 슬라이스에 배치하는 동안 밀봉이 확립되기 전에 전극에서 염료가 누출되지 않도록 합니다.

전극이 세포 표면에 접촉하기 직전에 약 100mm의 수은을 고압으로 높입니다. 전체 세포 구성에서 밀봉을 설정하고 20-45분 동안 체세포 패치 피펫에서 체세포로 염료가 자유롭게 확산되도록 합니다. 염색된 확산 중에 전류 클램프 모드에서 유발된 활동 전위를 기록하여 뉴런의 생리학적 상태를 모니터링합니다.

또한 2킬로헤르츠의 프레임 속도와 중성 밀도 필터로 조정된 최대 광 강도의 일부에서 cell soma의 휴지광 강도를 기록하여 염색량을 모니터링합니다. 활동 전위가 확장되기 시작할 때까지 다운로드 프로세스를 계속하십시오. 염색이 끝나면 vol의 소마에서 패치 피펫을 조심스럽게 당겨 빼냅니다.tage clamp 구성 이 과정에서 전체 세포에서 외부 패치 구성으로의 전환이 이루어지도록 합니다.

그런 다음 실온에서 추가로 1.5-2시간 동안 슬라이스를 배양하여 전압에 민감한 염료가 신경 돌기로 퍼질 수 있도록 합니다. 상당한 양의 염료가 소마에서 수지상 및 축삭 돌기로 확산된 후에는 활동 전위의 파형이 완전히 복원되어야 합니다. 다음 단계에서는 저강도 형광 아래에서 염색 뉴런의 소마를 찾습니다.

중성 밀도 필터로 광도를 XY 스테이지를 사용하여 관심 물체를 시각화하는 데 필요한 최소한으로 줄이고, 형광 소마가 식별될 때까지 형광 뉴런이 포함된 슬라이스 영역을 스캔합니다. 염색된 세포의 솜씨를 현미경 필드의 중앙에 배치하고 DIC 아래에 염료가 없는 표준 패치 전극으로 뉴런을 재현합니다. 그런 다음 전압 이미징을 위해 CCD의 연속 기록 모드에서 10-40Hz의 프레임 속도로 저강도 형광 하에서 신경 세포 과정을 시각화합니다.

XY 스테이지 위치를 사용하여 이미징 영역의 중간에 있는 관심 뉴런 프로세스. 또한 현미경의 부분 폐쇄 필드 스톱 조리개를 사용하여 여기광으로부터 SOMA를 보호하여 광역학적 손상을 줄입니다. 다음으로, 개별 수지상 가지에서 역전파 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다.

그런 다음 축삭의 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 그 후, 수지상 가시에서 역전파 활동전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형의 정확한 재구성을 위해 적절한 프레임 속도를 사용합니다.

동시에 염료 표백 및 광역학적 손상을 최소화하기 위해 녹화 기간과 고강도 여기광에 대한 노출을 가능한 한 짧게 유지하십시오. 광 신호의 기록이 여기에 표시됩니다. 여기. 상단 패널은 축삭돌기가 기록 위치에 있는 염색된 뉴런의 고해상도 컨포칼 이미지를 보여줍니다.

중간 패널은 막 전위 이미징에 사용되는 CCD에 의해 얻어진 축삭돌기의 낮은 공간 해상도 형광 이미지를 보여주고, 하단 패널은 소마의 전극 기록과 A IS 및 rvi의 노드의 광학 기록을 보여줍니다. 원시 데이터 및 처리된 신호가 표시됩니다. 이 그림은 전압 과민한 염료 작용이 로드된 L 5 피질 뉴런의 축삭돌기에서 나오는 활동 전위 신호를 보여줍니다.

잠재적인 관련 신호는 10kHz의 프레임 속도로 기록되었습니다. 이러한 추적은 세 위치에서 일시적인 활동 전위를 나타냅니다. 하나는 소마에서 기록하는 전극입니다.

둘째는 축삭 언덕의 광학 기록이고, 셋째는 vie의 첫 번째 음표의 광학 기록이며, 다음은 동일한 세 위치에서 중첩된 신호입니다. 이 그림은 100 헤르츠에서 짧은 탈분극 전류 펄스에 의해 시작된 L 5 피질 뉴런의 수지상 아버의 여러 위치에서 4 개의 역전파 활동 전위 신호의 버스트를 보여줍니다. 여기에 표시된 것은 개별 수지상 척추의 활동 전위 신호입니다.

다음은 회전하는 디스크 컨포칼 이미지 스택에서 얻은 해부학적 재구성이고, 다음은 CCD 카메라로 얻은 동일한 영역의 형광 이미지입니다. 멤브레인 전위 이미징의 경우, CCD 이미지에 설명된 대로 위치 1에서 3까지의 후방 전파 활동 전위에 해당하는 형광 강도 추적이 오른쪽 패널에 표시됩니다. 하단 트레이스는 소마에서 기록하는 전극을 나타냅니다.

사전 기록 준비는 주사위가 원위 과정으로 퍼질 때까지 기다리는 시간을 포함하여 약 3시간이 걸립니다. 기록 시간은 준비물의 정상적인 런다운과 PO 광역학적 손상에 의해 제한됩니다. 광역학적 손상의 양은 여기광의 강도와 개별 기록 시도의 지속 시간 및 횟수에 비례합니다.

일부 실험에서는 1시간 또는 2시간에 걸쳐 50회 이상의 기록 시험을 수행할 수 있습니다. 다른 측정은 높은 여기(excitation), 광도(light intensity) 및 더 긴 기록이 필요하며, 광역학적 손상으로 인해 몇 번의 기록 시도만 가능합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 뇌 절편에 있는 개별 뉴런의 전체 축삭 및 말단 구조에서 전압 이미징을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.