Name: 패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 탐색하세요 패치 클램프 전기 생리학과 압력 마이오그래피를 사용하여 간선 평활근 세포에서 Kv7 칼륨 채널 활성을 측정하고 혈관 직경 변화와의 관계를 분석하는 방법을 배우세요.

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이 작품은 KLB와 미국 심장 협회 (09PRE2260209)와 BKM에 아서 J. 슈미트 재단의 사전 박사 장학금으로 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (NIH R01-HL089564)의 교부금으로 운용되었다.

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에서 설명한 방법과 실험 방법은 아주 강력하고 세부 사항에 세심한주의를 적용 할 경우 명확하고 재현 결과를 생성 할 수 있습니다. 좋은 electrophysiological 레코딩 및 수축 / 동맥 세그먼트의 팽창은 각각 셀 및 동맥 세그먼트의 건강에 따라 달라집니다. 셀 준비는 동일한 프로토콜을 사용하여, 날마다 다를 수 있습니다. 절연 솔루션은 최대 2 주까지 사용할 수 있지만 셀 준비의 품질은 두 결과의 일에 낮은 경우 새로운 절연 솔루션이 준비되어야한다. 우리는 효소 활동이 효소의 각각의 새 배치와 최적화를 필요로 일괄 배치되므로 절연 조건 (부화의 시간과 효소의 농도)에 따라 다를 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 쥐 장간막 동맥은 여기에 설명 된 세포 격리 프로토콜이 다른 혼합이나 동굴이있을 수 있습니다 다른 혈관 침대 혹은 다른 종에 대한 최적의 있지 않은 것으로 나타났습니다세포 외 기질의 구성 요소 ity. 각 혈관 준비 가장 건강 세포를 생산 조건을 식별 할 수있는 자신의 최적화가 필요합니다. 우리가 건강한...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 </td><td> S5886 </td><td> 해부 솔루션 : 145 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 140 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 10 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 140 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 145 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 145 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 </td><td> P5405 </td><td> 해부 솔루션 : 4.7 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 5.36 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 135 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 5.36 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 4.7 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 4.7 </td></tr><tr><td> 칼륨 EGTA </td><td> 시그마 </td><td> E4378 </td><td> 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 0.05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 시그마 </td><td> H9136 </td><td> 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 10 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 10 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 10 </td></tr><tr><td> 나트륨 수소 인산염 </td><td> 시그마 </td><td> S5136 </td><td> 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 0.34 </td></tr><tr><td> 칼륨 수소 인산 </td><td> 시그마 </td><td> P5655 </td><td> 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 0.44 </td></tr><tr><td> 염화 마그네슘 </td><td> 시그마 </td><td> M2393 </td><td> 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 1.2 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 1 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 1.2 </td></tr><tr><td> 칼슘 염화물 </td><td> 시그마 </td><tD&gt; C7902 </td><td> 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 2 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 0.05 </td></tr><tr><td> 인산 나트륨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP331-1 </td><td> 해부 솔루션 : 1.2 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 1.2 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 1.2 </td></tr><tr><td> 황산 마그네슘 </td><td> 시그마 </td><td> M2643 </td><td> 해부 솔루션 : 1.17 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 1.17 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 1.17 </td></tr><tr><td> 걸레 </td><td> 피셔 과학 </td><td> BP308 </td><td> 해부 솔루션 : 3 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 3 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 3 </td></tr><tr><td> Pyruvic 산 </td><td> 시그마 </td><td> P4562 </td><td> 해부 솔루션 : 2 에 대한 목욕 솔루션압력 myography : 2 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 2 </td></tr><tr><td> EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 이수화 </td><td> 연구 유기물 </td><td> 9572E </td><td> 해부 솔루션 : 0.02 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 0.02 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 0.02 </td></tr><tr><td> D-포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7021 </td><td> 해부 솔루션 : 5 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 10 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 20 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 10 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 5 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 5 </td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A3912 </td><td> 해부 솔루션 : 1 % 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 1 % </td></tr><tr><td> 피에이치 </td><td></td><td></td><td> Solutio을 해부N : 7.4 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 7.3 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 7.2 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 7.2 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 7.4 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 7.4 </td></tr><tr><td> Osmolarity </td><td></td><td></td><td> 해부 솔루션 : 300 전기 생리학에 대한 목욕 솔루션 * : 298 전기 생리학에 대한 내부 솔루션 : 298 근세포에 대한 절연 솔루션 * : 298 압력 myography을위한 목욕 솔루션 : 300 압력 myography에 대한 루멘 솔루션 : 300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 실험에 사용되는 솔루션의 구성 요소. </td></tr></tbody></table>

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 myography를 사용하여 간선 평활근 kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

저항 동맥의 벽 내의 평활근 세포의 수축이나 이완이 동맥 직경을 결정함으로써 혈관을 혈액의 흐름을 제어하고 조직 혈압에 기여한다. 수축 과정은 주로 이온 수송 및 채널의 다양한 의해 제어 차례에 cytosolic 칼슘 농도 ([칼슘 2 +] cyt)에 의해 조절된다. 이온 채널은 혈관 수축 또는 vasodilation에 영향을 미치도록 vasoactive 호르몬에 의해 활성화 신호 전달 경로의 일반적인 중간체 있습니다. 그리고 이온 채널은 종종 두 의도적으로 치료 대리인 또는 실수 (원치 않는 심장 혈관 부작용을 유발하는 등) (예 : 칼슘 채널 차단제가 vasodilation과 낮은 혈압을 유도하기 위해 사용)에 의해 타겟팅 할 수 있습니다. Kv7 (KCNQ) 전압 활성화 칼륨 채널은 최근에 중요한 생리 및 치료 targ으로 연루되어있다부드러운 근육 수축의 조절을위한 ETS. 생리적 신호 전달 모두와 치료 대리인의 행동에 Kv7 채널의 특정 역할을 명료하게하다하기 위해, 우리는뿐만 아니라 그대로 동​​맥의 맥락에서의 공헌을 평가로서 활동이 세포 수준에서 조절이 얼마나 공부를해야합니다. 쥐 창 자간 막 동맥 유용한 모델 시스템을 제공합니다. 동맥은 쉽게 해부하는 결합 조직의 청소 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 격리 된 동맥 근세포를 준비하는 데 사용하거나, cannulated 상대적으로 생리적 조건 하에서 혈관 수축 제라 / vasodilator 응답 측정을 위해 가압 될 수 있습니다. 여기 측정의 두 가지 유형에 사용되는 방법을 설명하고 실험 디자인 혈관 톤의 규정에 이러한 이온 채널의 역할을 명확하게 이해를 제공하기 위해 통합 될 수있는 방법의 예를 제공합니다.

압축시키는 것 / 확장시키는 반응 (압력 myography를 사용하여)의 측정 병렬 절연 동맥 근세포 (패치가 el​​ectrophysiological 기술 클램프 사용)에서 Kv7 (KCNQ) 칼륨 채널 활동의 측정은 혈관 평활근의 생리학에 Kv7 채널의 역할에 대한 중요한 정보를 공개 할 수 있습니다 약리학.

패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

저항 동맥 벽 내 평활근 세포의 수축 또는 이완은 동맥 직경을 결정하며, 이를 통해 ...의 흐름을 조절합니다.

본 절차의 전반적인 목적은 새로 분리한 장간막 동맥 평활근 세포에서 KV7 칼륨 채널의 활성을 측정하고, 이를 생리적 조건에서 기록된 동맥 직경 측정값과 연관시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐의 장간막 혈관 아케이드(vascular arcade)를 외과적으로 제거합니다. 두 번째 단계는 장간막 동맥 분절을 박리하고 세척하는 것입니다.다음으로, 일부 절편을 사용하여 개별 평활근 세포를 분리하고 KV7 칼륨 전류의 패치 클램프 전기생리학적 측정을 수행합니다. 마지막 단계는 온전한 동맥 절편을 캐뉼라화하여 KV7 칼륨 채널의 약리학적 조절제에 반응하는 동맥 수축 또는 이완의 압력 근도 측정(pressure myo measurements)을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 패치 클램프 전기생리학과 압력 근도 측정의 조합을 통해 KV7 칼륨 채널 활성의 증가 또는 감소가 장간막 동맥 수축에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다.세포주에서 발현된 클론 채널을 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 채널을 천연적으로 발현하는 배양되지 않은 세포로부터 전류를 기록하며, 동일한 세포에서 활성화될 수 있는 다른 종류의 칼륨 채널로부터 KV 전류를 분리할 수 있다는 점입니다. 압력 마이오그래피(pressure myography)를 통해 분리된 세포가 유래된 동일한 조직에서 기능적 반응을 기록할 수 있으며, 이 방법은 동맥 링(arterial rings)이나 동맥 스트립(arterial strips)과 같은 다른 준비물보다 더 민감하고 생리적입니다. 저희 연구실의 박사후 연구원인 Bareth Mani 박사가 동맥 캐뉼라 삽입 및 압력 마이오그래피 기술을 시연할 예정이며, 저희 연구실의 연구조교수 Luba Brueggeman 박사가 세포 분리 및 패치 클램프 절차를 시연할 것입니다.이 절차를 시작하려면, 외과용 가위를 사용하여 쥐 소장의 양 끝에서 10~12 cm 구간을 절단합니다. 그다음 부착된 혈관과 함께 소장을 분리합니다. 이어서, 분리한 소장 구간을 핀으로 고정합니다.상장간막동맥의 주 가지가 중앙에 오고 그 후속 분지들이 중앙에서 방사형으로 퍼지도록 장간막을 챔버의 가까운 쪽에 펼칩니다. 그 다음, 조명 해부 현미경으로 관찰하며 장 분절 부분에만 핀을 꽂습니다. 미세 핀셋과 가위를 사용하여 장에 인접한 2차에서 4차 동맥 주변의 지방 조직과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.인접한 정맥을 잡아 지방 조직과 결합

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연구

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Biology

생물학

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

KV 채널 장애는 심장 arrhythmias과 연결되어 있습니다. 우리가 KV 채널 보조의 subunit의 녹아웃 마우스에서 심방과 심실 cardiomyocytes의 분리에 대한 체계적인 프로토콜을 활용 이러한 arrhythmias로 이어질 분자 메커니즘을 연구하기 위해. 절연 cardiomyocytes는 다음 즉시 세포 electrophysiological 연구, 생화학 또는 immunofluorescence (IF) assays에 사용하실 수 있습니다.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

압력 myography는 가압 할 때 지속적인 수축을 개발하는 작은 동맥의 vasoactivity을 평가하는 데 사용됩니다. 이 원고는 쥐, vasoactivity 혈관 직경에 관내 압력의 영향에서 작은 장간막 동맥의 고립 된 세그먼트에서 평가하기위한 세부 프로토콜을 제공합니다.

압력 Myography를 사용하여 저항 장간막 동맥에서 근육 조직 대응 및 Vasoactivity 평가

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

이 원고는 arterioles, electrophysiological 칼슘 이미징 및 압력 myography 연구에 사용 될 수 있는 쥐 망막에서의 격리에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

이 문서의 주요 목표는 미세 전극 impalement방법을 사용하여 중간 대뇌 동맥에서 막 전위 (Vm)를 기록하는 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다. 굴절된 중간 대뇌 동맥은 근진한 톤을 얻기 위해 평형화되고, 혈관 벽은 높은 저항 성 미세 전극을 사용하여 찔려있습니다.

축수 된 중간 대뇌 동맥에서 멤브레인 전위를 기록하는 마이크로 전극 Impalement 방법

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Tensometric Small Volume Chamber Myography 를 이용한 마우스 흉부 대동맥의 내피 의존성 혈관 이완 측정

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