패치 클램프 전기 생리학 및 압력 Myography를 사용하여 간선 평활근 Kv7 칼륨 채널 기능을 탐색

본 실험 절차의 전반적인 목표는 갓 분리한 장간막 동맥 평활근 세포에서 KV seven 칼륨 채널의 활성을 측정하고, 이를 생리적 조건에서 기록된 동맥 직경 측정값과 연관시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐에서 장간막 혈관 아케이드(vascular arcade)를 외과적으로 제거합니다. 두 번째 단계는 장간막 동맥의 분절을 박리하고 세척하는 것입니다.

다음으로, KV7 칼륨 전류의 패치 클램프 전기생리학적 측정을 위해 일부 분절을 사용하여 개별 평활근 세포를 분리합니다. 마지막 단계는 KV7 칼륨 채널의 약리학적 조절제에 반응하여 동맥 수축 또는 이완을 측정하는 압력 마이오그래피(pressure myography) 측정을 위해 온전한 동맥 분절을 캐뉼라(cannulation)하는 것입니다. 최종적으로, 패치 클램프 전기생리학과 압력 마이오그래피의 조합을 통해 KV7 칼륨 채널 활성의 증가 또는 감소가 장간막 동맥 수축에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다.

세포주에서 발현된 클론 채널을 사용하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 채널을 천연적으로 발현하는 비배양 세포로부터 전류를 기록한다는 점과 동일한 세포에서 활성화될 수 있는 다른 종류의 칼륨 채널로부터 KV 전류를 분리할 수 있다는 점입니다. 압력 근도 측정법(pressure myography)을 통해 분리된 세포가 유래된 동일한 조직에서 기능적 반응을 기록할 수 있으며, 이 방법은 동맥 링이나 동맥 스트립과 같은 다른 표본 준비 방식보다 더 민감하고 생리적입니다. 제 실험실의 박사후 연구원인 Bareth Mani 박사가 동맥 캐뉼라 삽입 및 압력 근도 측정 기술을 시연할 예정이며, 제 실험실의 연구조교수 Luba Brueggeman 박사가 세포 분리 및 패치 클램프 절차를 시연할 것입니다.

이 절차를 시작하려면, 외과용 가위를 사용하여 쥐 소장의 양 끝단에서 10~12cm 길이의 분절을 절단합니다. 그런 다음 부착된 혈관과 함께 소장을 분리합니다. 이어서, 분리한 소장 분절을 핀으로 고정합니다.

상장간막동맥의 주분지가 중앙에 위치하고 이후 단계의 분지들이 중앙에서 방사형으로 뻗어 나가도록 챔버의 가까운 쪽에 장간막을 펼칩니다. 그런 다음 조명 해부 현미경을 통해 관찰하며 장 분절 부위에만 핀을 고정합니다. 미세 핀셋과 가위를 사용하여 장에 인접한 2차에서 4차 분지 동맥 주변의 지방 조직과 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다.

인접한 정맥을 잡아 지방 조직과 결합 조직의 제거를 용이하게 하고 동맥이 불필요하게 늘어나는 것을 방지합니다. 이제 장간막 동맥의 분절 2~3개를 2 mL의 얼음처럼 차가운 분리 용액이 담긴 35 mm 조직 배양 접시에 옮깁니다. 그 후 접시를 얼음 위에 놓고, 화염 연마된 팁이 장착된 P스는 파이펫을 사용하여 장간막 동맥 분절을 3~4 mm 길이의 조각으로 자릅니다.

동맥 분절을 37 °C로 예열한 분리 용액 2 mL가 들어 있는 유리 바이알로 옮깁니다. 그 다음 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 30분 후, 파스퇴르 피펫을 사용하여 37 °C 분리 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.

따뜻한 효소 용액 2 mL를 추가한 후, 37 °C에서 35분 동안 배양합니다. 효소 용액에서 35분간의 배양을 마친 직후, 바이알을 얼음 위에 놓고 효소 용액을 흡입하여 제거한 다음, 차가운 분리 용액 2 mL를 추가합니다. 이 과정을 4회 반복합니다.

그런 다음 1 mL의 얼음처럼 차가운 분리 용액에서, 연마된 후방 피펫을 사용하여 동맥 분절을 부드럽게 10~20회 반복적으로 파이펫팅하여 개별 장간막 동맥 평활근 세포를 분리합니다. 세포 현탁액 한 방울을 35 mm 디쉬에 떨어뜨려 현미경으로 관찰함으로써 근세포의 외관을 주기적으로 확인합니다.

건강한 MA SMC는 매끄럽고 길쭉한 외형을 보여야 합니다. 다음으로, 연마된 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 100 to 200 µL의 세포 현탁액을 기록 챔버로 옮기고 세포가 15분 동안 부착되도록 둡니다. 이 단계에서 패치 피펫 팁을 amphotericin B가 없는 내부 용액에 담가 피펫 팁을 채웁니다.

그 다음, 튜브로 연결된 10 milliliter 주사기를 사용하여 반대쪽 끝에 흡입력을 가하는 동안 상단에서 파이펫 용액이 담긴 terin B를 첨가합니다. einor 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하여 파이펫의 약 절반이 용액으로 채워질 때까지 흡입합니다. 파이펫을 가볍게 톡톡 두드려 기포를 제거합니다.

그 후, 피펫을 전극 홀더에 삽입합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 길쭉한 모양의 심근세포 표면까지 내립니다. 피펫의 저항이 6~10 MΩ까지 증가하면, 흡입을 가하여 기가실(giga seal)을 형성합니다.

동시에, 막 천공이 일어나기를 기다리는 동안 유지 전압을 0 mV로 설정하십시오. 다음으로, +10 mV와 -10 mV로 100 ms의 전압 단계를 가합니다. 증폭기를 사용하여 전체 세포 커패시턴스의 출현과 동시에 발생하는 빠른 피펫 커패시턴스 과도 현상을 보정하십시오.

2~10 pA의 일시적이고 작게 유지되는 양성 전류의 순도와 진폭은 기능적인 KV7 채널의 존재를 나타냅니다. Amphotericin B를 이용한 천공이 성공하면 접근 저항이 35 MΩ 이하로 감소합니다. KV7 전류-전압 관계를 기록하려면, KV7 채널의 개방 확률이 최소인 -84 mV부터 개방 확률이 고점에 도달하는 +16 mV까지의 범위에서 5초간 전압 단계(voltage steps)를 가합니다. 각 테스트 전압에서 5초가 지난 후, -4 mV의 유지 전압으로 10초 동안 되돌립니다.

이 절차에서는 미리 제작된 미세 나일론 봉합사 두 개를 양쪽에 느슨하게 걸어줍니다. 유리 캐뉼라 옆에서 미세 핀셋으로 절제된 장간막 동맥 분절의 한쪽 끝을 잡고, 이를 절제 챔버에서 압력 근이식 챔버로 조심스럽게 옮깁니다. 그다음, 조명이 설치된 해부 현미경을 통해 관찰하며 동맥 분절의 한쪽 끝을 잡고 왼쪽 유리 캐뉼라 위로 부드럽게 밀어 넣습니다.

나일론 봉합사를 사용하여 끝부분을 고정합니다. 그런 다음 장착된 혈관의 내강에 유체를 부드럽게 흘려보내 혈액과 잔해물을 제거합니다. 이후 왼쪽 주사기로 연결되는 밸브를 닫아 이쪽이 정적인 유체 기둥을 형성하게 하여 오른쪽에서 압력을 조절할 수 있도록 합니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 이동 가능한 오른쪽 유리 캐뉼라를 동맥 분절에 더 가깝게 배치하고 분절의 오른쪽 끝을 캐뉼라 위로 당겨 고정합니다.

마지막으로, 나일론 봉합사로 동맥 분절을 고정하고 남은 봉합사 실을 클립으로 잘라냅니다. 이제 압력 마이크로그래프 현미경 위의 스테이지에 압력 그래프 장치를 장착합니다. 압력 컬럼을 그래프 챔버의 우측에 연결한 다음, 챔버 위에 커버를 덮습니다.

10 mL 주사기를 15분에 걸쳐 서서히 들어 올려 P1 압력 변환기가 80 mmHg를 나타낼 때까지 혈관의 누출 여부를 확인하십시오. 필요에 따라 캐뉼라 사이의 거리를 조정하십시오. 이때 압력이 가해진 동맥 분절이 거의 직선을 유지하며, 결찰 부위에서 어깨 모양의 패턴을 형성하도록 거리를 조정해야 합니다. 60 mM KCl을 30초 동안 일시적으로 관류하여 장착된 혈관의 생존력을 확인하십시오. 생존 가능한 혈관은 KCl 첨가 시 빠르게 수축하며, 세척 후 즉시 확장됩니다.

다음으로, 농축된 시험 물질을 배스 용액(bath solution)에 추가한 후, 챔버 끝부분 근처에서 피펫으로 부드럽게 반복적으로 흡입 및 배출하여 시험 물질을 배스 용액에 혼합함으로써 10 milliliter 챔버 내에서 적절한 최종 농도가 되도록 합니다. 시험 물질 추가 후 용기 직경의 부피 변화는 실시간 비디오 영상으로 모니터링할 수 있으며, 실험이 진행되는 동안 이미지 분석 창에 기록될 수도 있습니다. 이 그림은 단일 장간막 동맥 근세포(mesenteric artery myocyte)에서 처리 전(검은색 표시)과 100 nanomolar zinc perion 존재 하에 안정화된 후(빨간색 표시)의 전압 단계에 반응하여 기록된 일련의 전류 트레이스들을 보여주며, 여기에는 대조군과 100 nanomolar zinc perion에 대한 대표적인 전류가 나타나 있습니다.

회색 막대는 평균 전류 진폭이 측정된 시간 간격을 나타냅니다. 전류-전압 그래프의 경우, 계단식 전압은 오른쪽에 화살표 머리로 표시되어 있습니다. 이것은 -20 mV의 연속 전압 클램프로 측정된 100 nM zinc ion에 의한 KV7 전류 증가의 시간 경과입니다. 여기에 100 nM zinc ion 처리 전, 처리 중, 그리고 10 µM의 KV7 채널 차단제 XC 9 9 1 처리 중에 기록된 KV7 전류 밀도에서 도출된 평균 전류-전압 곡선이 제시되어 있습니다. 100 pM arginine vasopressin으로 사전 수축된 장간막 동맥의 zinc ion 유도 이완 결과입니다.

이 그림은 100 pM arginine vasopressin을 처리한 후, 이어서 100 nM 아연 이온을 처리했을 때 혈관 외경의 변화에 따른 시간 경과를 보여줍니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 세포 분리 또는 동맥 수축 및 확장 반응의 압력 근도 측정(pressure myographic measurement)을 위해 동맥을 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 갓 분리한 동맥 근세포에서 다른 전류와 구분하여 KV seven 전류를 기록하는 방법도 알게 될 것입니다.