Name: 귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 배우세요 성어 Danio rerio의 귀 세포를 분리하여 패치 클램프 기법으로 전압 게이트 채널의 생물물리학적 특성을 분석하는 방법을 학습하세요. 이 기법은 청각 및 평형 감각 연구에 활용됩니다.

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1. 사전 실험 준비 <ol><li> 여섯 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 100 ML NZR (정상 zebrafish 벨소리의), (B) 50 ML NZR + Tricaine (MS222), (C) 10 ML NZR + BSA, (D) 100 ML의 LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션), (E) 10 ML LoCaS + papain, (F) 100 ML K + - 내부 솔루션입니다. 솔루션 (가), (B), (D)와 (F) 4 ° C.에서 최대 1 개월에 저장할 수 있습니다 솔루션 (C)하며 (e)에서 실험의 날을 준비해야합니다. 모든 솔루션은 실험을 시작하기 전에 실온에서해야합니다. </li><li> 라벨 약 중간 솔루션 (A), (C), (D)로하고 (E) 4 35mm 페트리 요리를 채 웁니다. </li><li> Sylgard (다우 코닝, 미들랜드, MI)와 60mm 페트리 접시를 입력 한 다음 생선이 끝난 팁 않고 똑바로 앉을 수 그것을에 구멍을 절단하여 해부 접시를합니다. </li><li> 유리의 끝 부분에 개 머리 접착 고치 끝에서 두 개 이상의 셀 절연 도구를 준비superglue과 파스퇴르 피펫은 머리가 약 0.5 cm하여 피펫의 끝을 지났 확장 할 수 있도록합니다. 래브라도 리트리버의와 Weimaraners 같은 부드러운 부드러운 털로 덮인 개에서 머리카락이 잘 작동합니다. </li></ol> 2. 청각 및 Vestibular 미궁의 절연 <ol><li> NZR + Tricaine를 포함하는 비커에 빠져​​있는 성인 zebrafish를 희생. 모든 opercular 움직임​​이 정지 할 때까지 시각적으로 아가미를 모니터링 할 수 있습니다. 물고기를 제거하고 신선한 NZR와 린스하기 전에 추가로 10 분 동안 기다리십시오. 이러한 절차는 기관 동물 케어의 승인을 페퍼 다인 대학위원회 (IACUC)를 사용하지만, 승인을 자신의 기관에서 취득해야했습니다. </li><li> 에 물고기를 핀 머리에서 거리의 절반에 하나의 3 분 등쪽 - 복부 축으로 각 눈 소켓 세 번째 핀을 통해 하나의 표준 재봉 스트레이트 핀 (약 2.5 cm 길이)를 삽입하여 요리 등의 측면을 해부 에 도시 된 바와 같이 꼬리에그림 1A. </li><li> 줌 (0.62-5 배) 10 배 접안 렌즈가 장착 스테레오 해부 현미경에서 약 점에서 두개골 지붕을 제거하여 뇌와 척수의 짧은 세그먼트를 노출 봄 가위 (정밀 과학 도구 카탈로그 번호 15000-02)를 사용 앞으로 생선의 코에 아가미의 수준에 꼬리 0.5 cm. 척수를 잘라 척수 신경 및 기타 첨부 파일을 절단하면서 고급 집게 (고급 과학 도구 카탈로그 번호 11251-30)으로 뇌를 들어, 뇌를 제거하고 (그림 1B) 폐기합니다. </li><li> 남아있는 두개골 캡슐의 복부 반은 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 &quot;그릇&quot;을 형성한다. 각 내이 (内耳) 등 rostrally 측면 위치 utricle의 otoliths (그림 1C 및 4A)의 꼬리 끝 부분에 대칭있는 lagenas과 sacculi의 눈에 잘 띄는, 흰색, 불투명 otoliths을 관찰합니다. </li><li> 모든 복부와 측면 부착을 절단하여 뼈의 그릇을 제거TS 부드럽게 고급 집게로 머리에서 그 생각을 지울 리프팅 동안. LoCaS을 (인물 1D 및 4B)가 포함 된 페트리 접시에 놓으십시오. </li><li> 고급 집게 두 쌍을 사용하여 두 뼈의 측면 가장자리를 잡고 있으며 중앙에 포셉의 포인트를 삽입하고 반쪽를 떼어 내려고하면 왼쪽과 오른쪽 절반을 분리, 분해 또는 대안을 당겨 그 중간 선에서 그릇을 분리 균열 분리. 고급 포셉 (그림 2)를 사용하여 뼈에서 두 labyrinths를 제거합니다. </li><li> 반원의 운하, utricles, sacculi 및 lagenas (그림 4C) : 청각 및 vestibular 최종 기관을 식별 할 수 labyrinths을 검사합니다. 각 otolith 아래의 분홍빛이 도는 지역은 세포를 포함하는 maculae 있습니다. 마찬가지로, 반원의 운하의 ampullae 내부 분홍색의 띠는 세포이있는 cupula를 식별합니다. </li><li> 조심스럽게 고급 집게를 사용하여 lagena과 utricle에서 otoliths를 제거 ( <strong&gt;도 2 및도 4C). 그것은 이렇게하면 saccular 세포에 손상을 줄 수 있으므로 saccule에서 otolith을 제거 할 필요가 없습니다. </li></ol> 3. 헤어 셀 절연 <ol><li> 플라스틱 전송 피펫을 (피셔 과학 카탈로그 번호 13-711 - 오전 9시)를 사용하여, 포함 된 음식에 최종 장기를 이동 LoCaS + papain는 유체 이송의 볼륨을 최소화. </li><li> 상온에서 삼십분이 솔루션에서 이러한 구조를 품다. </li><li> 잠복기의 끝 부분에 NZR + BSA를 포함하는 요리로 구조를 이동하고 적어도 30 분 동안이 솔루션에 품다. 세포는 최대 4 시간이 솔루션에 건강 유지되지만 (다음 단계 참조) 분리 후 1 ~ 2 시간 후에 저하됩니다. </li><li> 세포 분리를위한 준비에 NZR를 포함하는 요리로 최종 장기 중 하나를 이동합니다. </li><li> lagenas 및 utricles를 들어, 부드럽게 분홍빛이 도는 상피 TI의 maculae - 시트를 발사하는 강아지 털을 사용하여세포를 (그림 3A)를 포함 ssue. maculae는 건져 할 수있는 sacculi의 otoliths 아래에서 (개 머리를 사용하여), 그리고 반원의 운하의 ampullae 내부의 위치에서 cupulae. </li><li> 단계 1.4에서 조리 두 셀 절연 도구 사용하여 세포를 (그림 3B)를 포함 파편 필드를 생성 할 수있는 망막 황반 또는 cupula을 씹다. 세포에게 그것을 이동하기 전에 접시의 바닥에 정착 할 최소한의 시간이 소요됩니다. </li><li> 위상 대비 광학 장착 역 현미경의 무대에 요리를 변경합니다. 40X 배율에서 세포를 관찰하고 형태의 다양성을 확인합니다. 다른 사람들이 길고 얇은 반면 대부분의 세포는 아보카도 모양입니다. 혀끝의 머리 번들의 존재는 세포로를 식별 및 위상 - 밝기는 자신의 건강을 실현할 수 있습니다. 절연 세포의 Photomicrographs는 그림 5에 표시됩니다. </li></ol> 4. Zebrafish 헤어 셀을 클램핑 패치 <ol><li> perfo를위한 준비장소 5 MG amphotericin B (시그마 A4888) 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 입력 : 정격 패치 녹음 5,6는 다음과 같이 amphotericin 함유 내부 솔루션을 준비합니다. amphotericin의 모든 해산 될 때까지 10~20초에 대한 즉시 와동이 솔루션입니다. 두 번째 microcentrifuge 튜브에 다음 피펫 625 μl K는 + - 내부 솔루션입니다. 위와 같이 + - 내부 솔루션 K와 소용돌이에 amphotericin 솔루션 10 μl를 추가합니다. 재고 amphotericin 솔루션은 몇 시간 지속 하나 시간 후 최종 솔루션이 삭제됩니다. </li><li> 다단 풀러 (셔터 P-1000)를 사용하여 BF 150-86-10 붕규산 유리 (셔터 계측기)에서 패치 피펫을 제조. 피펫은 약 2 μm의 직경 팁이 있어야하며 표 1에서 솔루션 MΩ 1-3의 저항을 갖게됩니다. 다음과 같이 작업이 잘되어 있다는 풀러의 설정 : 열 = 램프 minus10는 = 0, 속도를 당겨 = 18, 지연 = 1, 압력 = 600. 의 모양좋은 피펫의 끝은 그림 5의 삽입 C의 사진에서 분명하다. 그들은 electrophysiological 레코딩을하는 동안 최소 액세스 저항을 제공하기 때문에 갑작스런 &quot;총알 모양의 &#39;피펫이 선호됩니다. </li><li> amphotericin 함유 K + - 내부 솔루션으로 반 녹화 전극을 채우기 위해, 28 게이지 Microfil의 주사기 바늘 (세계 정밀 계측기 MF28G-5)를 사용합니다. </li><li> 패치 클램프 증폭기의 headstage에 부착 전극합니다. -10 뮤직 비디오, 10 Hz에서 10 밀리 전압 단계를 적용하고이 셀 근처의 녹음 요리의 맨 아래로 공기 / 솔루션 인터페이스를 통해 maneuvered되고 같이 전극에 긍정적 인 압력을 유지하고 있습니다. </li><li> 건강한 찾고 셀에 직교 전극을 배치합니다. 그것이 밖으로 흐르는 솔루션에서 벗어나되도록 전극이 충분히 셀 근처에있는 경우, 신속하게 전극에 약간의 진공을 적용, 압력을 반대로 그 위에 셀 &quot;점프&quot;까지. 즉시 일에 흡입을 중단전자 전극과 전극의 내부에 -70 mV의 개최 가능성을 적용 할 수 있습니다. 몇 초 내에 gigaohm 씰이 형성됩니다. </li><li> 곧 인감 형성 한 후 표시되는 전압 단계의 시작 및 종료의 용량 현재의 과도을 관찰합니다. 과도가 (약 10 분) 최대 크기에 크기에 성장 보면서 amphotericin에 의해 전극 아래에 멤브레인의 천공을 감시하고 있습니다. </li><li> , 건강한 셀에 전체 셀 (구멍) 구성의 설립을 확인 전압의 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing을 적용하여 외부 K + 전류를 유도합니다. 대부분의 세포는 눈에 잘 띄는 외부 전류를 (그림 6 참조)가 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 4는 세포 분리의 단계에서 찍힌 사진을 보여줍니다. 패널에서이 lagenas, saccluli 및 utricles와 관련된 otoliths은 throu 볼 수 있습니다GH는 뼈의 얇은 층을 overlies 것을. 이러한 불투명 한 구조 해부의 후속 단계 동안 동물에서 최종 장기의 안전한 제거에 도움 편리한 랜드 마크를 제공합니다. 패널 B는 그대로 labyrinths과 utricles, lagenas 및 sacculi의 눈에 잘 띄는 otoliths를 포함 뼈의 &quot;그릇&quot;을 보여줍니다. 패널 C는 뼈에서 제거되었습니다 미로를 보여줍니다. lagena에서 부채꼴 가장자리와 큰 otolith, utricle의 saccule과 콩 모양 otolith의 고드름 모양의 otolith을 확인합니다. 크기와 lagena으로부터 격리 세포에서 볼 형태의 다양성의 일부는 그림 5에 도시된다. 건강한 세포는 쉽게 날카로운 경계가있는 밝은 상으로 확인된다. 세포 모양은 약 2 클래스로 나눌 수 있습니다 : 아보카도 모양 (아보)과 긴 얇은 (thn) 각 그룹 내에서 세포의 크기가 현저하게 달라질 수 있지만 (예를 들어 아보 1 아보 3 비교). 삽입이의 클러스터를 보여줍니다에 세 세포가 완전히 서로 분리되지 않았습니다. 삽입 B에있는 세포의 블랙 색상과 세부적인 외관은 쉽게 죽은로 셀을 식별합니다. 삽입 C는 이러한 세포에서 녹화에 적절한 형태와 크기를 도시 한 패치 피펫의 끝을 보여줍니다. 그림 6에 표시된 현재의 흔적은 그림 5와 같이 아보 2와 비슷한 lagena 셀에 부과 잠재력 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 얻었다. 다양한 크기와 모양의 세포의 현재 반응은 널리 전압 개폐 채널의 보완에 다양성을 제안 다를 수 있습니다. 1-3 그림 : 세포의 분리의 단계를 설명하는 만화. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> 그림 1. 두개골 capsu의 제거zebrafish에서 귀에 labyrinths을 포함하는 르.. 요리를 해부에 zebrafish 등쪽면을 희생 핀. B는. 오픈 두개골은 제거하고 뇌를 폐기하십시오. C. utricles, lagenas 및 sacculi. D의 otoliths을 관찰합니다. labyrinths를 포함하는 두개골 캡슐의 복부 부분을 제거합니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> 그림 2. 두개골 캡슐에서 labyrinths의 제거.. 그 중간 선에서 두개골 캡슐을 분리 균열. B. 뼈에서 labyrinths를 제거합니다. C는. 집게를 사용하여 lagenas과 utricles에서 otoliths를 제거합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> 그림 3. labyrinths에서 세포의 분리.. 부드럽게 교장 발사개 머리 culae. B. 두 개 머리카락과 maculae을 씹다. C.이 패치 클램프에 대한 격리 된 세포를 사용합니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> 그림 4. 이미지는 개별 셀의 고립의 단계 중에 찍은. 뇌의 제거 후 A.이 두 lagenas 및 sacculi (화살표)와 utricles (화살촉)과 관련된 otoliths를 시각적으로 할 수 있습니다. B.은 복부의 제거 후 동물의 내이 (内耳) 기​​관을 포함하는 두개골 캡슐의 일부. B의 오른쪽 반으로 만화는 왼쪽 utricle, lagena과 saccule의 위치를 식별합니다. 점선은 왼쪽 미로의 대략적인 위치를 나타냅니다. C. 오른쪽 미로 (중간보기) D : C에서 미로의 주요 부분을 보여주는 만화 그리기. : 앞 반원형 운하, B : 수평 운하, C : 뒤 운하, D : utricular otolith, E : saccular otolith, F : lagenal otolith. D의 스케일 바는 A와 B에 대한 1mm, C 및 D. 0.5 mm를 나타냅니다 <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> 그림 5 형태의 다양성을 보여주는 lagena에서 절연, 건강한 세포, 아보 :. 아보카도 모양의 세포, thn : 긴 얇은 세포. 삽입 세 불완전하게 격리 세포의 클러스터, 삽입 B : 죽은 세포, 삽입 C : zebrafish 세포에서 electrophysiological 레코딩에 사용되는 패치 전극의 끝. 스케일 바 = 20 μm의 주요 그림 및 모든 insets에 적용됩니다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> 패치에 기록 그림 6. 요즘에는 헤어 셀을 고정. 셀에 평균 응답 (유사 t-70 mV의 개최 가능성에서 70 뮤직 비디오까지 -140 뮤직 비디오에서 10 MV 단위로인가 전압 단계의 세 프레젠테이션에 그림 5에서 O 아보 2). 더 depolarized 가능성에 나타나는 운영을 중지시키지 전류를합니다. 전압 단계 magnitudes는 흔적의 일부 옆에 표시됩니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

최종 기관과 세포의 부드러운 치료에주의 해부 건강, 손상 및 생리 학적 활성 세포의 성공적인 고립 중요합니다. 다음 사항을 준수하는 것은 성공을 보장합니다 <ol><li> 이 작은 물고기 (길이 2-2.5 cm)에서 건강한 세포를 얻을 쉽습니다. 큰 물고기 해부 과정이 불분명 시각화 많은 지방 방울을 갖추고 있습니다. </li><li> 세포를 ... 위에 가로 눕다 otoliths를 제거 할 때주의가 필요합니다. 집게로 otoliths를 잡을 때 셀을 터치하지 마십시오. </li><li> 최고의 결과는 maculae와 cupulae가 상피에서 triturated 시트 및 셀로 떠낸 때 얻을 수 있습니다. </li><li> 우리는 인간의 속눈썹에게로 테이퍼 덜 유연하지 않은 7을 사용 등의 다른 방법에 우수 할 셀을 씹다 할 수있는 개 머리의 사용을 찾으십시오. </li><li> 패치 고정, t에 긍정적 인 압력의 응용시공기 / 솔루션 인터페이스가 끝이 깨끗하게 유지하는 것이 중요하다 통해 통과로 그는 전극. 전극에 &quot;점프&quot;할 셀을 활성화 할 수있는 긍정적 인 압력의 출시도 중요합니다. 이 방법은 따라서 셀 gigaohm 밀봉을 형성 가능성을 증가 멀리 끝에서 amphotericin 함유 솔루션의 작은 볼륨을 삭제합니다. 우리 실험에서는 대신보다 전통적인 전체 셀 구성으로 인해 세포의 취약성의 구멍 패치 녹화 기술을 사용합니다. gigaohm 씰의 손실에 자주 결과 &quot;전체 셀을 이동 &#39;하려고했습니다. </li></ol> 여기에 설명 된 방법은 동물 당 건강한 세포 수백 얻을 수 있습니다. 기술은 실온에서 수행하고 해부 현미경 이외의 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 할 수 있습니다 목성의 이전 보고서는 복부 접근 방법 8을 사용 zebrafish의 내이 (内耳)의 절개를 설명합니다. 이 작성자는 아까 그 바 말인데을 보여줍니다전체, paraformaldehyde - 고정 귀에 장기 ction. 우리는 독자가 우리의 방법과 비교를 위해이 동영상을 감상하는 것이 좋습니다. 여기에 제시된 방법 중 하나 장점은 생리적 조사에 유용 라이브 세포의 획득입니다. 이러한 세포의 사용은 정전 용량 측정 할 11,12을 만들어 세포 공명 9,10, 모니터 신경 전달 물질 자료를 공부하도록 확장 할 수 있습니다 (여기를 참조) 전압 개폐 채널을 공부하는 패치 클램프 실험에서의 사용 외에,에 의해 유도 neuromodulation 조사 리간드 게이트 채널 13 활성화뿐만 아니라 청각과 균형 14 모두에 영향을 미칠 돌연변이를 사용 수집 할 수있는 정보의 풍부한를 활용할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 솔루션 이름 </td><td> 조리법 </td></tr><tr><td> (A) NZR (일반 Zebrafish 벨소리의) (MM)을 </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl 2, 3 포도당, 5 오세영 + - HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR + 0.02 % 3-아미노 산 에틸 에스테르 메탄 술폰산 (시그마 A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0.4 % 소 혈청 알부민 (시그마 A2153). </td></tr><tr><td> (D) LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션) (MM)을 </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0.05 CaCl 2, 0.05 MgCl 2, 3 포도당, 30 그렇단 +-HEPES, pH를 7.35. </td></tr><tr><td> (E) LoCaS + papain </td><td> LoCaS + 0.05 % L-시스테인 (시그마 C1276) + 0.2 % papain (시그마 P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-내부 솔루션 (MM)을 </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH를 7.3. </td></tr></tbody></table> 표 1. 솔루션.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 zebrafish에서

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

종의 다양한 절연 감각 세포의 전압 개폐 채널 패치 클램프 분석은 이전에 1-4 설명이 동영상은 zebrafish의 세포에 그러한 기술의 첫 번째 응용 프로그램을 나타냅니다되었습니다. saccule, lagena, utricle과 반원의 운하 : 여기 우리는 귀에 최종 기관에서 모두 건강하고, 손상 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 또한, 우리는 헤어 셀 크기와 형태의 다양성을 보여하고 얻을 수 패치 클램프 녹음의 종류의 예를 제공합니다. 다른 이상이 zebrafish 모델 시스템의 사용의 장점은 청력과 균형 모두에 영향을 미칠 zebrafish 돌연변이의 가용성 때문이다. 유전자 변형 라인과 유전자 분석 및 조작, 세포 절연 및 electrophysiological 방법을 사용 다른 기술의 사용과 함께 역할 세포 P에 큰 통찰력을 촉진한다 여기에서 소개이러한 감각 modalities을 중재에 놓여 있었다.

이 동영상의 목적은 성인 zebrafish의 내부 귀 기관에서 건강 손상 세포를 획득하고 자신의 전압 개폐 채널의 biophysical 속성을 특성화하기위한 패치 클램프 연구를 위해 사용에 대한 절차를 설명하는 것입니다.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

다양한 종에서 분리된 감각모세포의 전압 개폐 채널에 대한 패치 클램프 분석이 이전에 기술된 바 있으나, 본...

본 절차의 목적은 성체 제브라피시의 청각 및 전정 말단 기관에서 패치 클램프에 사용할 수 있는 건강하고 온전한 유모 세포를 얻는 방법을 시연하는 것입니다. 이는 전압 개폐 채널의 생물물리학적 특성을 규명하기 위한 연구를 목적으로 합니다. 먼저 물고기의 뇌를 제거한 다음, 미로 기관이 포함된 뇌갑의 복측 부분을 추출함으로써 이를 수행합니다.두 번째 단계는 말초 기관인 sacculus, utricle 및 반고리관이 포함된 미로를 분리하기 위해 골성 외이도(bowl of bone)를 분쇄하는 것입니다. 다음으로, 강아지 털을 사용하여 모세포가 포함된 상피 세포층을 말초 기관으로부터 들어 올려 분리합니다. 마지막 단계는 두 개의 강아지 털로 상피 세포층을 세밀하게 분리하여 개별 모세포를 고립시키는 것입니다.결과적으로, 전압 개폐 채널의 특성을 규명하기 위해 분리된 유모세포에서 패치 클램프 기록을 수행할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 유전적 조작이 용이한 모델 생물인 제브라피쉬로부터 생존 가능한 유모세포를 얻는 방법을 제시한다는 점입니다. 이 방법은 청각 및 전정 생리학 분야의 핵심 질문, 예를 들어 청각과 균형을 매개하는 세포에서 신경전달물질의 방출을 조절하는 메커니즘을 이해하려는 연구 등에 답하는 데 유용하게 활용될 수 있습니다.첨부된 원고에 따라 6가지의 서로 다른 용액을 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 다음으로 35mm 페트리 접시 4개에 라벨을 붙이고, 첨부된 원고에 명시된 용액을 접시의 약 절반 정도까지 채우십시오. 그 후, 경화된 실가드(sil guard)가 채워진 60mm 페트리 접시에 물고기 모양의 홈을 파서 해부 접시를 준비하십시오.이렇게 하면 해부 중에 동물이 넘어지는 것을 방지할 수 있습니다. 개 털의 모낭 끝 부분을 순간접착제를 사용하여 유리 파스타 피펫 끝에 붙여 세포 분리 도구를 최소 두 개 준비하며, 이때 털이 피펫 끝 너머로 약 0.5 centimeters 정도 돌출되도록 합니다. 이제 일반 제브라피쉬 링거 용액(normal zebra fish ringers 또는 NZR)과 trica가 담긴 비커에 담가 성체 제브라피쉬 한 마리를 희생시킵니다.모든 아가미 덮개의 움직임이 멈출 때까지 시각적으로 관찰하십시오. 최소 10분을 더 기다린 후 물고기를 꺼내 신선한 NZR로 헹구십시오. 그 후, 물고기의 등 쪽이 위로 향하게 하여 해부 접시에 놓으십시오.각 안와에 표준 바느질 핀을 하나씩 꽂고, 세 번째 핀은 등-배 축에 꽂습니다. 실체 현미경 하에서 머리에서 꼬리까지 거리의 약 3분의 1에서 2분의 1 지점에서, 스프링 가위를 사용하여 아가미 수준에서 코 방향으로 약 0.5 centimeters 떨어진 지점부터 두개골 지붕을 제거하여 뇌와 척수의 짧은 분절을 노출시킵니다. 그런 다음 척수를 절단하고, 미세 핀셋으로 뇌를 들어 올리면서 신경과 기타 부착물을 절단합니다.그 후, 뇌를 제거하여 폐기합니다. 두개골 캡슐의 남은 복측 부위는 내이 기관을 포함하는 그릇 형태를 이룹니다. 각 내이의 4분지 지점에 대칭적으로 위치한 legina와 sculli의 뚜렷하고 하얀 불투명한 OTA 이석과 측면으로 배치된 utricle 이석을 관찰하십시오.더 많이 계수합니다. 이러한 구조들은 미세 핀셋과 스프링 가위를 사용하여 미로를 온전하게 제거하는 데 도움이 되는 유용한 지표가 됩니다. 머리에서 조심스럽게 들어 올리면서 모든 복측 및 측면 부착물을 절단하여 뼈의 오목한 부분을 제거합니다.그다음 이를 저칼슘 용액 또는 low cas가 담긴 페트리 접시에 넣으십시오. 보울의 중앙선을 따라 쪼개고, 미세 핀셋의 끝을 중앙에 넣어 양쪽 절반을 벌려 우측과 좌측 절반을 분리하십시오. 그런 다음 뼈에서 두 미로를 제거하십시오.미로를 검사하여 청각 및 전정 말단 기관을 확인하십시오. 반고리관, 난형낭, 구형낭 및 정낭이 이에 해당합니다. 미세 핀셋을 사용하여 정낭과 난형낭에서 이석을 조심스럽게 제거하십시오.본 절차에서는 말단 기관을 locas와 propane이 포함된 디쉬로 옮깁니다. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 이 구조물들을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면, 구조물들을 NZR과 BSA가 포함된 디쉬로 옮겨 최소 30분 동안 배양합니다.세포 분리를 위해 추가 준비를 합니다. 다리(legina)와 같은 말단 기관 하나를 NZR이 담긴 접시에 옮깁니다. 이 접시를 스테레오 줌 해부 현미경의 스테이지 위에 놓습니다.개 털을 사용하여 유모세포가 포함된 분홍색 상피 조직 시트인 macular를 조심스럽게 들어 올립니다. mace는 sculli와 uracil에서 제거할 수 있으며, kae는 반고리관 내부의 위치에서 분리할 수 있습니다. 이전에 준비한 두 개의 세포 분리 도구를 사용하여 macular를 으깨어 유모세포가 포함된 파편 영역(debris field)을 생성합니다.디쉬를 옮기기 전, 세포가 바닥에 가라앉도록 최소 5분 동안 유지합니다. 다음으로, 위상차 현미경이 장착된 도립 현미경의 스테이지로 디쉬를 옮깁니다. 40배 배율로 세포를 관찰합니다.세포 형태의 다양성에 주목하십시오. 일부 세포는 아보카도 모양인 반면, 다른 세포들은 길고 가늘게 나타납니다. 정단모 묶음(apical hair bundles)의 존재는 이것이 유모세포임을 나타내며, 위상차 밝기는 세포의 건강 상태를 보장합니다.천공 패치 기록(perforated patch recordings)을 위해, 먼저 1.5 mL 원심분리 튜브에 5 mg의 amphotericin B를 넣어 amphotericin 함유 용액을 준비합니다. 그 다음 100 µL의 DMSO를 첨가하고, 모든 amphotericin이 용해될 때까지 튜브를 즉시 10~20초 동안 볼텍싱합니다. 이어서 두 번째 마이크로 원심분리 튜브에 625 µL의 칼륨 이온 내부 용액을 피펫으로 취해 넣습니다.그런 다음 포타슘 이온 내부 용액에 amphotericin 용액 10 µL를 첨가하고 10~20초 동안 더 볼텍싱합니다. 붕규산 유리 모세관 튜브가 포함된 필라멘트로 패치 피펫을 제작합니다. 다단계 풀러(multi-stage puller)를 사용하여, 피펫의 팁 직경은 약 2 µm, 저항은 1~3 MΩ 사이가 되도록 합니다.전기생리학적 기록 시 접근 저항을 최소화하기 위해 끝이 뭉툭한 총알 모양의 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 그 다음, 28게이지 마이크로필 시린지 바늘을 사용하여 패치 피펫의 절반을 amphotericin이 포함된 칼륨 이온 내부 용액으로 채웁니다. 패치 클램프 기록이 가능하도록 이 피펫을 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 고정합니다.먼저, 전극을 공기-용액 계면을 통해 내려 세포 근처의 기록 디쉬 바닥까지 내리면서 전극에 양압을 가합니다. 다음으로, 전극을 건강해 보이는 세포에 수직으로 배치합니다. 전극이 충분히 가까워져 세포가 유출되는 용액으로 인해 멀어지기 시작하면, 세포가 전극 위로 달라붙을 때까지 빠르게 압력을 반전시켜 전극 내에 약간의 진공 상태를 만듭니다.전극의 흡인을 즉시 중단하여 세포와 기가옴 씰(giga ohm seal)이 형성되도록 합니다. 전극에 10 millivolts의 반복적인 과분극 전압 단계를 인가하고 정전 용량성 전류 과도 현상을 관찰하십시오. 과도 현상의 크기가 최대치에 도달할 때까지 amphotericin으로 유도된 막 천공 상태를 계속 모니터링하십시오.건강한 세포에서 천공 패치 구성이 제대로 형성되었는지 확인하려면, 과분극 및 탈분극 전위 단계의 자극을 가하여 전압 개폐 전류를 유도하십시오. 대부분의 유모 세포는 지속적인 탈분극 동안 빠르게 비활성화되는 뚜렷한 외향 전류를 나타냅니다. 이 그림은 뇌를 제거한 후의 뇌갑 복측 부분을 보여줍니다.골성 분지를 제거한 후, 그 위에 놓인 얇은 뼈를 통해 tulo, genus, sculli와 관련된 이석뿐만 아니라 두 개의 난형낭과 관련된 이석을 확인할 수 있습니다. 이석의 존재는 미로의 위치를 식별하는 데 도움이 됩니다. 삽화의 점선은 왼쪽 미로의 대략적인 둘레를 나타냅니다.미로(labyrinth)를 분리하면 삭(sacculus), 난형낭(ellipsoid), 이석기관(utricle) 및 반고리관(semicircular canals)과 같은 청각 및 전정 말단 기관을 확인할 수 있습니다. 도식은 이러한 구조들의 위치를 보여주며, A, B, C는 반고리관입니다. D는 이석기관(utricle), E는 삭(sacculus), F는 난형낭(ellipsoid)입니다.모양의 다양성은 lega에서 분리된 세포들을 보여주는 이 그림에서 분명하게 나타납니다. 세포들은 대략 가느다란 형태나 아보카도 모양의 두 가지 클래스로 나뉩니다. 이와 대조적으로, 건강한 세포들은 윤곽이 뚜렷하고 모 bundle이 명확하며 위상차로 밝게 보입니다.삽입도 B에 표시된 사멸 세포들은 검은색의 과립형 외관을 보입니다. 이 그림은 -70 mV의 유지 전위에서 -140 mV부터 +70 mV까지 10 mV 증분으로 인가된 세 번의 전압 단계 제시에 대한 세포의 평균 반응을 보여줍니다. 불활성화 전류는 더 탈분극된 전위에서 나타남에 유의하십시오.숙련된 경우, 절차 시작 후 90분 만에 전기생리학적 기록을 측정할 수 있습니다. 또한, tri 단계를 연기하고 말단 기관을 적절한 BS 용액에 보관하면, 해부 시작 후 최대 4시간까지 건강한 세포를 얻을 수 있습니다. 이러한 준비 과정은 널리 알려진 제브라피시 유전자 변이와 결합하여 청각 불균형 메커니즘의 기초가 되는 분자적 요인을 조사할 수 있는 독특한 모델 시스템을 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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