Name: 질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 배우세요 마우스 심장 조직에서 염색질 결합 단백질을 분리하고 정량적 무표지 질량 분석법으로 심장 질환의 핵 프로테옴 특성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 심장 생리학에서 단백질 역할을 이해하는 데 기여합니다.

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Vondriska 연구소는 NIH와 UCLA에서 Laubisch 기금의 국립 심장 폐 혈액 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다. EM은 UCLA의 생리학에서 제니퍼 S. Buchwald 대학원 동지의 수상자이다, HC는 미국 심장 협회 사전 박사의 원정이 수상자이다, MP는 NIH 루스 Kirschstein 포스트 박사의 원정이받는 것입니다, 그리고 SF가의 수신자입니다 NIH K99 수상.

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<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
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<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

핵 절연을위한 두 가지 방법은 이미 검토 한 : 27 하나는 수성 자당 / 소금 용액에 조직을 homogenizing의 비 수성 용매에 동결 건조 된 조직을 homogenizing의 Behrens 기술과 두 번째, 우리가 사용하는의 수정입니다 다음 차동 또는 밀도 기울기 원심 분리에 의해. 조직 샘플에서 산 추출하여 핵의 Subfractionation은 histones을 분석되는 원본을 목표로 1960, 28 년부터 사용 된 염색질을 공부하기위한 중요한 도구입니다. 산 추출 프로토콜은 핵심 nucleosomal histones 구성 요소를 정화의 목표를 ​​위해 개발 된 29이 이전 연구의 한계는 비 히스톤 단백질 구성, 그리고 염색질 수정에 대한 정보의 부재이다;. 우리는 현재의 프로토콜로이 문제를 해결했습니다 핵 및 염색질의 독특한 생물학적 subfractions을 특성화하십시오.병렬로 세제 추출 또는 염색질의 산...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Dulbeco 수정일 독수리 중 </td><td> Invitrogen </td><td> 11,965 </td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 펠릿 </td><td> 로슈 </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 μm의 스트레이너 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotome </td><td> 라이 </td><td></td></tr><tr><td> 100CX 전송 전자 현미경 </td><td> JEOL USA 주식회사 </td><td></td></tr><tr><td> 꾀꼬리 </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> 히스톤 H2A 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin p62 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> 아데닌 nucleo조수 전송 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC-9299 </td></tr><tr><td> bip (빨리) 항체 </td><td> 산타 크루즈 (Santa Cruz) </td><td> SC-1050 </td></tr><tr><td> Tubulin 항체 </td><td> 시그마 </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> 히스톤 H3 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin 항체 </td><td> 셀 시그널링 </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 항체 </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 항체 </td><td> 온도 피셔 </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoma 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hypoxia inducible 인자-1 항체 </td><td> Novus 체액 </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA 단백질 분석 </td><td> 열 과학 </td><td> 23,227 </td></tr><tr><td> 위상 열을 역방향 </td><td> 새로운 OBJective </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks 브라우저 </td><td> 열 과학 </td><td></td></tr></tbody></table>

질병의 염색질 proteomes의 정량 분석

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

핵에서 누구 기능을 가장 밀접한 유전자 조절과 연결되어 proteomes을 거주. 성인 포유류의 cardiomyocyte의 핵은 binucleated 세포의 높은 비율 1 DNA의 주로 heterochromatic 상태에 따라 고유하며, 개발 중에 계면의 영구적 인 상태에 성인 핵을 렌더링 cardiomyocyte의 비 분리 자연 2. 전사 규제와 병은 잘이 단백질이 질병 중에 발생하는 전사 프로그램에 변경 사항을 관리하는 방법이 오르간, 3-5에서 공부하지만 상대적으로 미개척 남아는 DNA 포장과 표현에 대한 책임 핵 단백질에 의해 연주 역할이며,되었습니다. 6 개발에 세계 심장 질환은 남성과 여성 모두에 대한 사망률의 최고의 원인입니다. 핵 단백질이 질병의 진행을 조절하는 협력 방법에 대한 일곱 통계는 현재 치료 O를 발전을위한 중요합니다습니. 질량 분석법은 병 어떻게 이러한 단백질의 풍부한 변경을위한 핵 프로테옴와 상대 정량화의 편견 주석을 허용 이러한 문제에 대응을위한 이상적인 도구입니다. 최근까지 포유류의 핵 단백질 단지, 8-13 여러 proteomic 연구가되어있는 동안 14 심장 핵 프로테옴을 검토 한 연구가있다, 그것은 오히려 핵 하위 구획의 수준에서 프로테옴을 둘러보다, 전체 핵을 고려 . 많은 부분에서 15 일이 부족 심장 핵을 분리의 어려움 때문입니다. 심장 핵은 myocyte 수축 변하는 자신의 전반적인 모양. 16 또한, cardiomyocytes 볼륨 17으로 40% 미토콘드리아이라는 범위, 그들이 endoplasmic 소포체에서 여러 확장을 통해 연결되어 할 수있는 강성과 고밀도 고를 - 마이 오신 장치에서 발생하는 necessita다른 세포 소기관에서 떨어져 핵의 농축 tes. 여기 생물학적 관련성이 높은 구획에 심장 핵 농축 및 추가 분류를위한 프로토콜을 설명합니다. 또한, 신진 대사 라벨이 적합하지 않을 다양한 동물 모델 및 장기 시스템의 생체 실험의 의무 분수는 - 기술의 라벨이없는 정량 대량 spectrometric 해부에 대한 세부 방법.

그림 4는 상대적으로 정량화이 양식의 유틸리티를 강조 표시합니다. 왼쪽 패널에 표시되는 단백질 HMGB1 (데이터베이스 검색을 통해 확인)에 속하는 것으로 지정되어 개별 monoisotopic 펩타이드 피크는 (다른 마우스에서 중첩)입니다. 각 피크는 기본적으로 주어진 펩타이드에 대한 추출 이온 크로마토 그래프는 다른 마우스에서 제공합니다. 세 생물 각 그룹에 대한 복제와 함께 기초, 심장 비대 및 심장 마비 :이 그룹은 세 가지 생리 상태를 나타냅니다. 곡선 아래 영역을 통합함으로써, 상대적으로 풍부한가 계산 될 수있다. 중앙 패널에서 이러한 abundances의 평균이 표시됩니다. 이 HMGB1 단백질의 풍부한이 질병의 과정 중에 변경되는 분석이 유형에서 분명하다. 대조적으로, 하단 패널은 질병으로 변경되지 않습니다 히스톤 H4의 예를 보여줍니다. 두 경우 모두, 펩티드 같은 phenot의 동물에서 오는ypic 상태의 샘플 준비 및 LC / MS / MS의 재현성을 보여 유사한 용출 프로파일과...

질량 분광법의 발전은 조직의 호스트에 단백질 표현 및 수정의 높은 처리량 분석을 허용하고 있습니다. subcellular 분류 및 질병 모델, 분광 및 생물 정보학은 생물 시스템에 새로운 속성을 표시 할 수 있습니다 양적 질량과 결합. 여기에 설명 된 방법은 심장 질환의 설정에 염색질 - 관련 단백질을 분석하고 다른 사람에게 쉽게 적용 할 수 있습니다<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간의 질병의 모델.

질병의 염색질 Proteomes의 정량 분석

핵에는 유전자 조절과 가장 밀접하게 연관된 기능을 수행하는 프로테옴이 존재합니다. 성체 포유류 심근세포 핵은 ...로 인해 독특합니다.

본 절차의 전체적인 목표는 마우스 심장에서 크로마틴 결합 단백질을 분리하는 것입니다. 이는 먼저 심장을 균질화한 다음, 설탕 밀도 구배 원심분리를 통해 심장 핵을 분리함으로써 수행됩니다. 그 다음으로, 핵질을 크로마틴 분획으로부터 분리합니다.그 다음, DNA에 느슨하게 결합된 단백질을 농축하기 위해 크로마틴 펠렛에서 단백질을 추출합니다. 마지막으로, DNA에 강하게 결합된 단백질을 농축하기 위해 다른 크로마틴 펠렛에서 단백질을 추출합니다. 최종적으로, 정량적 무표지 질량 분석법을 통해 서로 다른 생리적 조건 하에서 핵 프로테옴의 특성을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 크로마틴 리모델링이 심비대 및 심부전에 어떻게 기여하는지와 같은 심장 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 성체 마우스를 희생시키고 심장을 적출한 후, ice cold PBS로 헹굽니다. 그런 다음 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 혼합물이 포함된 2 mL의 용해 버퍼가 들어 있는 유리 호모게나이저에 넣고 균질화합니다.용해물을 100 micron 체에 걸러 여과액을 1.5 milliliter 튜브에 수집하며, 별도의 지시가 없는 한 이 시점부터 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 샘플을 4 °C에서 4,000 RPM으로 5분 동안 원심분리하십시오. 세포질이 포함된 상층액을 수집하여 -80 °C에서 보관하십시오.200 µL의 용해 버퍼(lysis buffer)에서 펠렛을 재현탁합니다. 새 튜브에 1 mL의 수크로스 버퍼(sucrose buffer)를 넣고, 전이 피펫을 사용하여 재현탁된 펠렛을 수크로스 패드 위에 조심스럽게 층을 이루어 올린 후, 4 °C에서 5,000 RPM으로 10분 동안 원심분리합니다. 상단의 얇은 막과 멤브레인이 포함된 수크로스 패드를 제거합니다.핵이 포함된 남은 펠렛을 200 µL의 얼음처럼 차가운 PBS-EDTA로 헹구고, 핵이 포함된 펠렛에 200 µL의 detergent extraction buffer를 넣은 후 샘플을 10초씩 두 번 볼텍싱합니다. 샘플을 얼음에 10분 동안 두고, 이후 4 °C에서 13,000 RPM으로 5분간 원심분리합니다. 핵질 단백질이 포함된 상층액을 제거하여 -80 °C에 보관합니다.펠렛을 얼음처럼 차가운 P-B-S-E-D-T-A로 헹구고 300 µL의 Tris, S-D-S-E-D-T-A 버퍼에 재현탁합니다. 샘플을 10초씩 3~6회 초음파 처리합니다. DNA를 분쇄

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

여기, 우리는 chromatin immunoprecipitation (칩) 및 칩 seq 라이브러리 준비 프로토콜 낮은 풍부한 닭 배아 샘플에서 글로벌 epigenomic 프로 파일 생성을 설명 합니다.

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

여기, 우리는 최적화 된 높은 처리량 칩 시퀀싱 프로토콜 및 냉동된 종양 조직 및 세포에서 게놈 넓은 chromatin 상태 패턴의 결정에 대 한 전산 분석 파이프라인을 설명합니다.

종양 조직에 높은 처리량 칩 시퀀스를 사용 하 여 Chromatin의 게놈 넓은 매핑 위한 통합된 플랫폼

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

우리는 3차원 염색질 상호 작용을 사용하여 게놈 전체 협회 연구 (GWAS)에 의해 확인된 비 코딩 이체의 기능적인 연루를 확인하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

크로마틴 구성의 전산 분석을 사용하여 알츠하이머 병 변이체를 대상 유전자에 매핑

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

배우세요 마우스 심장 조직에서 염색질 결합 단백질을 분리하고 정량적 무표지 질량 분석법으로 심장 질환의 핵 프로테옴 특성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 심장 생리학에서 단백질 역할을 이해하는 데 기여합니다.

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