Name: 의 양육 및 분사 Manduca sexta 애벌레 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 배우세요 Manduca sexta 애벌레를 이용한 세균 병원성 평가 방법을. 살균된 알에서 4령까지 양육하고 혈강에 직접 주사하여 곤충 사망 시간을 기록함으로써 세균 독성을 분석합니다. 이 기법은 새로운 곤충 병원체 발견과 다양한 세균 균주 간 독성 차이 규명에 활용됩니다.

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저자는 Goodrich-블레어 연구실 과거 회원 감사 할 : 사만다 오차드 (Orchard), 킴벌리 Cowles, 에린 허버트 - 트란, 그렉 리차드, 메건 Menard, 그리고 Youngjin 공원이 프로토콜의 발전에 기여. 이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 IOS-0950873 및 건강 NRSA 교제 FAI084441Z의 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다.

1. 곤충 달걀 살균 및 양육 <ol><li> 900-1,000 ML H 2 O.에서 제공되는 한천의 첫 autoclaving 15g으로 음식을 준비 즉시 잘 실험실 믹서기에서 166g의 밀 배아식이 요법과 조화를 이루고있는 autoclaving, 혼합. 4에 알루미늄 호일에 음식을 전송 한 후 냉각 할 수있는 요리 (또는 요리)에 넣어, 단단히 포장 및 저장 ° C. </li><li> 도착시, M. 멸균을 때때로 교반 90mm 필터 종이 유리 필터 홀더와 진공 플라스크 장치에서 2-3 분에 0.6 %의 표백제 솔루션 250 ML과 sexta 달걀. </li><li> 세탁 당 250 ML 멸균 증류수 H 2 O로 표백 솔루션과 세척 계란 3-4 회를 배출하는 진공을 사용합니다. </li><li> 페트리 접시 뚜껑에 배치 신선한 90mm 필터 종이에 계란을 전송하고 건조 할 수 있도록 할 때까지 함께 그들은 더 이상 스틱 (20-30 분 정도). </li><li> 각 용기에 약 40 알을 배치, 곤충 음식을 플라스틱 용기의 바닥에 달걀을 전송(그림 1A). 달걀은 습기 유발 곰팡이 오염을 방지하기 위해식이 요법과 구분됩니다. 8 시간 짙은의 photoperiod : 16 시간의 빛으로 26 알 ° C를 유지합니다. 계란은 부화하기 전에 노란색 - 흰색으로 밝게합니다. </li><li> 부화가 완료되면 조심스럽게 아래 (그림 1B)에 다이어트를 통해 새로운 용기로 약 25 애벌레를 각각 전송합니다. 그것은 자신의 약한 초기 개발 단계에서 그들에게 손상을주지 않도록 집게를 사용하여 긴 검은 뿔 각 유충을 데리러하는 것이 중요합니다. 위와 같이 2 일 품다. 애벌레의 죽음이이 단계에서 특이한이지만, 죽은, 또는 가능성, 발달 저하 애벌레가 관찰 될 수 있습니다. 이러한 곤충들은 더 연구에서 제외하고 냉동 희생해야합니다. </li><li> 사람을 잡아 먹는 행동, 음식의 작은 조각 (그림 1C)과 개별 용기에 전송 애벌레를 피 이상으로 품다합니다. 곤충 개발을 모니터링, 음식을 교체 및 청소 배설물은 으세요매일 컨테이너의 t가 세 번째 애벌레의의 털을 갈다 (보통 6-9일 부화 후) 받아야까지. 이 곤충 몸 (그림 1D)를 따라 줄무늬의 각 proleg 및 증가 부각에 검은 색 훅 같은 crochets의 모습을 특징으로, 4 일 instar 애벌레의 단계입니다. 애벌레의 크기는 상당히 다양하지만, 일반적으로 4 번째 instar 단계를 입력시 0.15-0.4 g 무게 수 있습니다. 유사한 크기의 애벌레가 분사에 대한 선택해야합니다. </li></ol> 2. 사출에 대한 박테리아의 작성 <ol><li> 당신은 테스트하고자하는 성장 단계에 표준 절차에 따라 테스트 할 수있는 박테리아 변종 (들)을 성장. </li><li> 각 박테리아 스트레인의 펠렛 500 μl은 실온에서 13,000 rpm으로 microcentrifuge에서 2 분 동안 회전하여 테스트 할 수 있습니다. </li><li> 한 ML 멸균 1X 인산염의 Resuspend 세포가 위 다시 생리 버퍼 (PBS) 및 펠릿. </li><li> 0.5 ML 멸균 1X PBS 및 MEA에 Resuspend 세포정지 있는지 광학 밀도 (OD). 필요한 경우, 동일한 OD에 대한 모든 정지를 희석. 원하는 경우 멸균 성장 매체는 또한 1X PBS 대신에 세포 resuspension 및 희석에 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 제 4 회 Instar의 애벌레의 주입 <ol><li> 각 희석에 대한 새로운 피펫 팁을 사용하여 멸균 1X PBS에서 96 잘 microtiter 플레이트 6 우물에서 처음으로 세균 변형의 일련 10 배 dilutions (그림 2A)를 준비합니다. 각 잘에 세포 현탁액의 최종 볼륨이 분사 (곤충 당 10 μl) 플러스 판 20 μl inoculum (단계 3.2 3.7 참조​​)에 필요한 볼륨을 초과해야합니다. </li><li> 적절한 성장 매체를 포함하는 페트리 접시 상단의 5 dilutions (10 -6까지 10 -2)에 대한 현장 10 μl 각. 장소는 중앙 (그림 2B)으로 확산되도록 판을 기울입니다. </li><li> 에 얼음 용기에 곤충식이 요법과 배설물 및 장소 곤충을 제거약 5 분 거리에 있습니다. </li><li> 3 회 70-100% 에탄올의 2 튜브의 각, 멸균 H 2 O (그림 2C) 중 하나 튜브 다음을 린스하여 주사기 바늘을 소독하다. 액체의 볼륨이 잠기 바늘​​에 충분해야합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 현미경으로 희석 세포 현탁액을 Quantitate. 원하는 inoculum에 따라 잘 맞는 microtiter (그림 2D)에서 10 μl를 그립니다. </li><li> 견본이 곤충 95 % 에탄올로 표면, 그리고 복부 prolegs 중 하나 뒤에 (이하 45 °) 각도 곤충에 10 ML의 세포 현탁액을 주사. 펑크 용기를 내서 않도록주의를 타고 그냥 표피 층 (그림 2E) 아래의 내용을 삽입. hemolymph의 일부 손실 (일반, 녹색 파란색 액체)이 정상이지만, 사출 사이트에서 새로운 미립자과 노란색 액체가 내장 주사를 나타내는 수 있습니다. 이 경우 곤충를 희생하고 다시 할 수있는 새로운 애벌레를 얻을를 넣습니다. </li><li> 첫 번째 주입 그룹의 각 남아있는 곤충에 대한 단계 3.6을 반복합니다. 니들 살균은 오염이 발생하지 않는 한 박테리아의 동일한 희석과 변형을 주입 각각의 곤충 사이에 필요하지 않습니다. 또한, 반복 디스펜서는 샘플 사이에 주입 볼륨에서 더 일관성에 사용할 수 있습니다. </li><li> 박테리아의 첫 번째 변형 각 곤충을 주입 한 후,이 시간이 접시의 중앙에 세포 현탁액을 찾는하고 아래 방향으로 그 흐름 (그림 2 층) 주셔서 단계 3.2를 반복합니다. 적절한 온도에서 번호판을 배양하고 inoculum를 열거하는 식민지를 계산합니다. 이 두 번째 도금 단계는이 문서의 첫 번째와 두 번째 platings 사이의 서로 다른 식민지 번호 될 것 같은 샘플은, 주입 과정에서 오염되지 않은 것을 확인하는 데 사용됩니다. </li><li> 반복 실험에서 박테리아의 각 변형에 대해 3.8으로 3.1 단계를 반복합니다. 마지막으로, 동생이야를 사용하여 멸균 1X PBS로 3-5 벌레를 삽입부정적인 제어 그룹으로 구출 바늘. 8 시간 짙은의 photoperiod : 16 시간의 빛으로 26 ° C에서 곤충을 품다. </li><li> 주사 후 시간이 지남에 따라 곤충 생존을 모니터링합니다. 곤충 죽음을 자극시 자원 봉사 운동의 부족으로 특징입니다. 곤충은 종종 죽기 전에 감염 동안 식욕 감소, 설사 (물, 노란색 배설물), 및 / 또는 물 손실을 ( &quot;땀&quot;) 전시, 이러한 특성은뿐만 아니라 지적 가치가있을 수 있습니다. </li></ol>

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</ol>

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M.의 직접 분사 여기를 설명 entomopathogenic 박테리아와 sexta의 유충은 박테리아 독성을 분석 할 수있는 간단하고 효과적인 수단으로 제공하고 있습니다. 방법은 다른 실험 과목 및 / 또는 조건에 맞게도 매우 적응합니다. 박테리아는 주입하기 전에 여러 가지 준비 할 수 있습니다. X의 경우 nematophila은 중간 로그 단계로 영양이 풍부한 Luria-Bertani (LB) 배지에서 자란 야생 형 세포는 주사로 다음 30 시간 내에 대부분의 또는 모든 곤충을 죽이고, 일반적으로 가장 악성이다. 고정 단계에서 세포는 종종 유충을 죽일 이상 5-10 시간을. 성장 단계는 독성 영향을 미칩니다 있지만, 주입 세포의 총 수는 전형적인 inocula 20에서 20,000 CFU까지로, 16 덜 중요한 것 같습니다. 사실, Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 경우, 5 CFU처럼 일부는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 90mm 필터 종이 </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 필터 홀더 </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta 계란 </td><td> 캐롤라이나 생물학 공급 </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> 집시 나방의 다이어트 + 한천 </td><td> MP의 Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5 온스 플라스틱 용기 및 뚜껑 </td><td> 솔로 컵 회사 </td><td> URC55-0090 Pl4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1온스 플라스틱 용기 및 뚜껑 </td><td> DART 컨테이너 주식회사 </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137mm NaCl, 2.7 MM KCl, 8 MM이 그렇단 HPO 4, 1.46 MM KH 2 PO 4, pH를 7.4 </td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,208 </td><td> 30 게이지, 0.375 &quot;길이, 포인트 스타일이 </td></tr></tbody></table>

의 양육 및 분사<em&gt; manduca sexta</em박테리아 독성을 평가하기&gt; 애벌레

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

일반적으로 담배 hornworm으로 알려진 Manduca sexta는, 담배, 토마토 등의 solanaceous 식물에 공급, 상당한 농업 해충으로 간주됩니다. M.의 민감도 entomopathogenic 박테리아 종 1-5,뿐만 아니라 곤충의 면역 체계 6-8에 대한 사용 가능한 정보의 부의 다양한 sexta의 유충, 그리고 보류중인 게놈 시퀀스 9는 호스트 미생물의 상호 작용을 연구에 사용에 대한 좋은 모델 생물 확인 pathogenesis 중. 또한, M. sexta의 애벌레는 다른 민감한 곤충 종의 실험실 상대적으로 조작 및 유지 관리가 비교적 크고 용이합니다. 그들의 대형도 감염에 대한 호스트 응답의 분석을위한 효율적인 조직 / hemolymph 추출을 용이하게한다. 여기에 제시된 방법은 M.의 hemocoel에 박테리아의 직접 분사 (혈액 캐비티)에 대해 설명합니다 sexta의 애벌레. 이 방법단순히 주사 후 곤충 죽음에 시간을 모니터링하여 다양한 세균 종, 변종, 또는 돌연변이의 독성 특성을 분석하고 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 일반적으로 곤충에 항목을 얻을 수있는 수단으로 선충류 벡터와 연결 Xenorhabdus 및 Photorhabdus 종의 pathogenicity을 연구하기 위해 개발되었습니다. Entomopathogenic의 nematodes은 일반적으로 자연 소화 나 호흡 구멍을 통해 애벌레를 감염, 그리고 곤충 hemolymph (혈액) 즉시 (10) 내로의 공생 박테리아 내용을 놓습니다. 여기에 설명 된 분사 방법은 따라서 곤충에 박테리아와 선충류의 효과를 uncoupling, 선충류 벡터의 필요성을 무시합니다. 이 방법은 nicking 11 구두 독성 assays 12을 포함 entomopathogenesis을 분석하는 기존의 다른 방법을 사용 불가능 inoculum, 내 전염성 물질의 정확한 열거 (전지 또는 단백질)을 할 수 있습니다 <e직접 분사 방식은 전체 셀 inocula의 독성을 해결 반면, m&gt;는. 또한, 경구 독성 assays는 유충의 소화 시스템에 도입 분비 독소의 독성을 해결합니다. 여기에 설명 된대로 직접 분사 방식의 유틸리티는 곤충 사망률을 모니터링하여 세균 pathogenesis를 분석하는 것입니다. 그러나,이 방법은 쉽게 M.에 감염의 효과를 연구에 사용하기 위해 확장 할 수 있습니다 sexta 면역 시스템입니다. 벌레가 체액과 세포 반응 모두를 통해 감염에 응답합니다. 체액 반응은 박테리아 - 관련 패턴 인식 등 다양한 항균 펩티드의 후속 생산 7이 포함되며, 이러한 펩티드를 인코딩 유전자의 표현은 RNA 추출 및 정량 PCR 13을 통해 직접 감염 이후에 모니터링 할 수 있습니다. 감염에 대한 세포 반응은 유괴, 캡슐화, 그리고 hemocytes 6 전염성 대리인의 phagocytosis를 포함 </sup&gt;. 이 응답을 분석하기 위해 주입 곤충 해부와 현미경 13, 14으로 시각화 할 수 있습니다.

곤충 사망률 분석의 대표 예는 그림 3에 그려져 있습니다. 이 실험에서, 곤충이 중 야생 유형 (ATCC19061) 또는 중순 로그 단계 (변형 당 n은 = 6 곤충)로 성장 Xenorhabdus nematophila의 감쇠 돌연변이 스트레인 (lrp 13)의 약 50 식민지 성형 단위 (CFU)를 주입했다. 곤충은 약 72 시간에 관찰, 각 timepoint에서 아직 살아 주입 곤충의 %가 기록되었습니다. 이 경우, 감쇠 변형은 곤충 살해 명확한 지연을 전시, 야생 형 스트레인 전에 어떤 돌연변이에 감염된 유충의 죽음에, 30 시간의 후 분사 내의 모든 6 애벌레를 죽였어. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4295/4295fig1.jpg" /> 그림 1.</stron...

방법은의 hemocoel에 entomopathogenic 박테리아의 직접 분사을 이용하여 여기에서 설명한<em&gt; Manduca sexta</em&gt; 곤충 애벌레.<em&gt; M. sexta</em&gt; 상업적으로 사용할 수 있고 잘 공부 벌레입니다. 따라서,이 방법은 하나 또는 두 파트너의 관점에서 호스트 박테리아의 상호 작용을 분석에 대한 간단한 접근 방식을 나타냅니다.

의 양육 및 분사<em&gt; Manduca sexta</em박테리아 독성을 평가하기&gt; 애벌레

일반적으로 담배뿔나방으로 알려진 Manduca sexta는 담배 및 가짓과 식물을 섭식하는 주요 농업 해충으로 간주되며...

본 절차의 전체적인 목적은 모델 생물인 manduka seca를 사용하여 곤충 유충에 대한 세균의 병원성을 평가하는 것입니다. 이는 먼저 멸균된 알에서 곤충 유충을 배양하여 발달 4령 단계까지 성장시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 주입을 위한 세균 샘플을 준비합니다.다음으로, 박테리아를 4령 manduka seca 유충에 주입합니다. 마지막 단계로, 주입 후 시간이 경과함에 따라 곤충의 폐사 여부를 모니터링합니다. 최종적으로 곤충이 폐사할 때까지의 시간을 기록하여 박테리아의 독성을 평가하는 데 사용합니다.이 방법은 새로운 곤충 병원균의 발견과 박테리아 종 또는 균주 간의 독성 차이 규명을 포함하여, 공생 분야의 핵심적인 측면들을 다루는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 900~1000 mL의 물에 15 g의 auger를 넣고 오토클레이브로 멸균합니다. 멸균 직후에오거(auger)를 166 g의 밀 배아 식이(wheat germ diet)와 혼합합니다. 실험실용 블렌더를 사용하여 혼합된 곤충 식이를 접시에 붓습니다. 식힌 후, 접시에 담긴 식이를 알루미늄 호일 조각으로 옮깁니다.단단히 감싸서 4 °C에서 보관하십시오. 도착 후, M sex to eggs를 90 mm 필터 페이퍼가 장착된 유리 필터 홀더와 진공 플라스크 장치에 넣으십시오. 그런 다음 0.6% 표백액 250 mL를 알 위에 붓고, 가끔씩 저어주며 2~3분 동안 처리하십시오.이제 진공 펌프를 켜서 표백액을 빼내고, 멸균된 알을 1회당 250 milliliters의 멸균 증류수로 3~4회 세척합니다. 다음으로, 90 millimeter 크기의 새 거름종이를 페트리 접시 뚜껑에 넣은 후, 알을 거름종이로 옮겨 클린벤치 내에서 서로 달라붙지 않을 때까지 건조합니다. 이제 여러 개의 플라스틱 용기에 고정된 고무 마개 위에 미리 준비한 곤충 배지를 올리고, 각 용기에 약 40개의 알을 옮겨 담되, 수분으로 인한 진균 오염을 방지하기 위해 알이 배지에 직접 닿지 않도록 분리하여 배치합니다.알을 16시간의 명기(light period)와 8시간의 암기(dark period)로 구성된 광주기 조건 하에 26 °C에서 유지합니다. 부화가 완료되기 전, 알은 황백색으로 밝아집니다. 핀셋을 사용하여 각 유충의 긴 검은색 뿔 부분을 잡고, 바닥에 먹이가 준비된 새 용기에 유충을 각각 약 25마리씩 조심스럽게 옮깁니다.유충을 알과 동일한 조건에서 이틀 동안 배양합니

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

투명 zebrafish의 배아는 다음과 같은 시각화하는 유용한 모델 호스트와 타고난 면역 세포와 세포 세균성 병원체 간의 기능상 학습 상호 작용을...

세포내 세균성 병원균과 Zebrafish 태아의 감염

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곤충<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 세균 Pathogenesis를 조사 할 수있는 강력한 감염 모델로

출처: Bernut, A. 외, 얼룩말피시 배아에서 Mycobacterium absrumus 의 발병기전 해독 및 영상 분석. J . Vis. Exp. (2015).이 영상은 감염된 제브라피시 배아에서 Mycobacterium abscessus 를 분리하고 정량화하는 프로토콜을 시연합니다. 이 절차는 배아 안락사, 조직 용해, 균질화를 통해 박테리아를 방출한 후, 원심분리 및 계면활성제 완충제 내 재현탁을 포함합니다. 마지막으로, 박테리아 현탁액을 연속적으로 희석하여 항생제 보조 한천에 도판한 후 배양하여 집락 형성과 정량화를 가능하게 합니다.

제브라피시 배아에서 박테리아 분리 및 배양하여 감염 용량 평가

이 비디오는 큰밀랍나방인 Galleria mellonella의 유충에서 Mycobacterium bovis 감염 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. Mycobacterium bovis BCG의 생물 발광 균주를 유충의 혈림프에 주입하여 감염을 확립하고, 감염 진행 상황을 연구하기 위해 미리 정의된 간격으로 생물 발광을 측정합니다.

곤충 유충에서 세균 감염 모델을 확립하는 기술

이 비디오는 Bacillus Calmette-Guérin, BCG, 럭스에 감염된 곤충 유충을 사용하여 생체 내 박테리아 부담을 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 유충 균질화, 루시페라제 기질 처리, 박테리아 부담과 상관관계가 있는 상대적 광 단위를 결정하기 위한 생물 발광 측정이 포함됩니다.

곤충 유충에서 루시페라아제를 발현하는 박테리아의 생체 내 부담 측정(Measurement of the In vivo Burden of Bacteria Expressing Luciferase in an Insect Larva)

여기, 우리 갤러리아 mellonella 애벌레를 사용 하는 구강 관리 모델에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 특성화 하는 방법을 타고 난 면역 반응 유도. 이 프로토콜을 사용 하 여, 실제적인 경험 없이 연구원 G. mellonella 강제로 메서드를 사용할 수 있게 됩니다.

갤러리아 mellonella 구강 관리 모델 Study Commensal-Induced 타고 난 면역 반응에

여기에서 우리는 크리켓 계란을 주입하는 프로토콜을 제시, 크리켓의 많은 실험에서 기초 방법 역할을하는 기술, 포함하되 이에 국한되지 않음, RNA 간섭 및 게놈 조작.

그릴루스 바이마쿨라투스 계란 주입

이 문서는 모기 midgut 경작 미생물의 격리 및 식별, 모기 창자 박테리아의 항생제 고갈을 포함하여 개별 모기 창자 박테리아의 효력을 조사하고, 1개의 특정 박테리아 종을 재소개하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석

이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 도구와 함께 작동하도록 최적화된 Culex quinquefasciatus 태아를 위한 미세 주입 절차를 기술합니다. 이 기술은 이 저학질병 벡터에 있는 유전 기술을 구축하는 데 사용될 수 있는 사이트 특정, 유전성, 생식선 돌연변이를 효율적으로 생성할 수 있습니다.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

초파리 멜라노가스터 성인 파리는 숙주 항미생물 선천적 면역 반응 및 미생물 감염 전략의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 모델 유기체로서 광범위하게 활용되고 있다. D. melanogaster 유충 단계를 추가 또는 대안 모델 시스템으로서 촉진하기 위해, 애벌레 주입 기술이 기술된다.

초파리 멜라노가스터 유충 주입 프로토콜

배우세요 Manduca sexta 애벌레를 이용한 세균 병원성 평가 방법을. 살균된 알에서 4령까지 양육하고 혈강에 직접 주사하여 곤충 사망 시간을 기록함으로써 세균 독성을 분석합니다. 이 기법은 새로운 곤충 병원체 발견과 다양한 세균 균주 간 독성 차이 규명에 활용됩니다.

의 양육 및 분사

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