손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

본 실험 절차의 전반적인 목표는 감염성 뉴런 노로바이러스 입자를 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 바이러스 접종액의 10배 희석액을 준비합니다. 두 번째 단계는 바이러스 접종액 희석액을 RAW 264.7 단층 배양 세포로 옮긴 후, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 흔들어주며 배양하는 것입니다.

다음으로, 접종물을 흡입하여 제거한 후 C plaque agarose와 2X MEM을 1:1 비율로 혼합하여 덮어주고, 조직 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막 단계로, 뉴트럴 레드(neutral red) 염색액을 덮어준 뒤 조직 배양 인큐베이터에서 1~3시간 동안 플레이트를 배양합니다. 최종적으로, agarose 오버레이를 제거하지 않은 상태에서 뉴트럴 레드 염색액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 라이트 박스를 사용하여 플라크 수를 측정합니다.

감염성 바이러스 입자를 정량화하는 이 방법은 분변으로 배출되는 감염성 입자의 양이나 어떤 조직이 감염을 지원하는지와 같이 노로바이러스 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 분석 과정 전반에 걸쳐 건강하고 생존 가능한 세포를 유지하는 데 어려움을 겪습니다. 이전 경험이 없는 사람들에게는 거울 노로바이러스의 플라크 분석법을 이해하는 것이 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

본 분석을 성공적으로 완료하려면 적절한 세포 수, 정확한 온도 및 정밀한 핸들링이 누적적으로 이루어져야 플라크를 용이하게 관찰할 수 있습니다. 먼저, 광학 현미경으로 세포 단일층을 관찰하여 세포의 형태를 확인하십시오. 대부분의 세포가 둥근 모양으로 보여야 합니다.

세포가 과증식하지 않도록 주의하십시오. 일반적으로 과증식한 세포는 플라크를 형성하지 않습니다. Murn neurovirus 플라크 분석을 위해 거의 합류(confluent) 상태에 도달한 175 cm² 조직 배양 플라스크의 raw 2 6 4 0.7 세포를 준비합니다. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 세포에 10 mL의 신선한 DMEM 10을 첨가합니다. 다음으로, 세포 스크래퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 긁어내고, 10 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입한 다음 플라스크 바닥에 대고 분사합니다. 이 과정을 최소 3회 반복하여 세포 덩어리를 모두 풀어줍니다.

스톡 플라스크에 적합하도록 합니다. 세포 현탁액 1~2 mL를 취하여 DMEM 10 33~34 mL가 들어있는 새로운 175 cm² 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양한 후 다시 계대 배양합니다.

분석을 위해 플레이트에 세포를 파종할 때, 세포 현탁액의 밀도를 DMEM 10에서 1×10⁶ viable cells/mL로 조정한 후, 이 현탁액 2 mL를 직경 3.5 cm의 6-well plate의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 즉시 플레이트를 손으로 10회 흔들어 세포가 웰 내에 고르게 분산되도록 합니다.

세포가 웰 중앙에 뭉칠 수 있으므로 플레이트를 기울이지 마십시오. 그 후, 세포가 부착될 수 있도록 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 최소 4시간 또는 가급적이면 하룻밤 동안 보관하십시오. 바이러스 접종액은 MNV 감염 조직의 균질물 또는 MNV 감염 마우스의 분변 샘플로부터 얻을 수 있습니다. 조직 샘플을 사용하는 경우, 멸균 실리카 비드와 1 mL의 DMEM 10이 들어 있는 2 mL 스크류 캡 튜브에 완두콩 크기의 조직 조각을 넣고 균질화하십시오.

자성 교반기를 6,000 RPM에서 1분 동안 사용합니다. 분변 시료를 사용하는 경우, 동일한 방식으로 분변 펠릿을 3개 이하로 균질화하고, 균질화된 시료를 -80 °C에서 냉동 보관한 뒤 플라그 분석 당일에 접종균을 해동합니다. 리피팅 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 DMEM five 1.35 mL를 분주한 다음, 플레이트의 첫 번째 웰에 세 번째 바이러스 접종균 0.15 mL를 파이펫으로 넣습니다.

첫 번째 10⁻¹ 희석액 0.15 milliliters를 흡입하여 플레이트의 두 번째 웰로 옮겨 10⁻²로 희석함으로써 10배 연속 희석을 수행합니다. 그런 다음 두 번째 웰의 희석액으로 동일한 과정을 반복하여 10⁻³로 희석합니다. 시료에 따라 10⁻⁹까지 추가 희석이 필요할 수 있음에 유의하십시오.

단계별 희석액이 준비되면, 60~80% 합류도를 보이는 2 64 0.7 세포 플레이트에 샘플 이름과 사용된 희석 배수를 표시합니다. 그다음, 플레이트 중 하나의 배지를 흡입하거나 털어내어 모두 제거하고, 웰에 희석된 샘플 0.5 milliliters를 첨가합니다. 중복 웰에 대해서도 동일하게 반복한 후, 다음 낮은 희석 단계로 진행합니다.

세 가지 희석액을 모두 한 플레이트에 두 번씩 분주한 후, 플레이트를 앞뒤로 기울여 모든 세포가 충분히 덮이도록 합니다. 다음 세포 플레이트에도 동일한 과정을 반복합니다. 모든 플레이트의 처리가 완료되면, 분당 약 18회 진동으로 설정된 로킹 장치(rocking apparatus) 위에 플레이트를 올려놓고 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그동안 미리 준비하거나 멸균한 agar 병을 전자레인지에 넣어 녹입니다.

그 다음, 녹인 agarose를 42 °C 항온수조에 넣어 온도를 맞춥니다. 이어서, 멸균된 2X XMEM 배지와 녹인 agarose를 멸균된 병에 1:1 비율로 혼합합니다. 이 오버레이 용액이 담긴 병을 사용 직전까지 37 °C 항온수조에 보관합니다.

1시간의 배양 기간이 끝나면, 각 웰에서 접종액을 흡입하여 제거하고, 피펫 팁을 각 웰의 벽면에 대고 오버레이 용액 2 mL를 천천히 가합니다. 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 상온에서 약 10분 동안 오버레이가 응고되도록 둡니다. 그 후, 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 48시간 동안 배양합니다.

배양 기간이 끝난 후, 플레이트에 플라크가 형성되었는지 확인합니다. 플라크가 보이지 않을 경우, 플레이트를 다시 배양기에 넣고 4시간 후에 다시 확인합니다. 필요에 따라 이 과정을 반복하되, 총 배양 시간은 72시간을 초과해서는 안 됩니다.

먼저, 뉴트럴 레드(neutral red) 염색액을 준비합니다. 그다음 본 프로토콜에서는 각 웰에 뉴트럴 레드 용액 2 mL를 첨가하며, 이때 aros 플러그는 제거할 필요가 없습니다. 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 시간이 경과한 후, 웰에 중성 적색 용액을 유지한 상태에서 플레이트에 플라크가 형성되었는지 확인합니다. 염색이 뚜렷하지 않은 경우, 최대 3시간까지 한 시간씩 더 배양합니다. 플라크가 보이면 어로즈 플러그가 흐트러지지 않도록 주의하며 중성 적색 용액을 흡입 제거한 후, 플라크 수를 측정합니다.

플레이트를 검사하여 플라크가 명확하게 분리된 희석 배수를 찾습니다. 플레이트를 라이트 박스 위에 놓고, 중복 계산을 방지하기 위해 계산한 플라크에 점을 표시하면서 플라크 수를 셉니다.

그런 다음 다른 희석 배수의 바이러스가 포함된 웰에서 계수를 반복하고, 밀리리터당 플라크 형성 단위(plaque forming units per milliliter)로 바이러스 역가를 계산합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라, 이 대표 이미지는 감염 전의 단일층을 보여줍니다. raw 2 6 4 0.7 세포를 하룻밤 동안 배양한 후 광학 현미경의 20배 배율로 촬영하였습니다.

이 이미지는 플라크 형성 후의 동일한 단일층을 보여줍니다. 감염 48시간 후 세포를 0.01% 중성 적색 용액으로 염색하고 4배율 광학 현미경으로 관찰하였습니다. 로마 숫자 I, II, III은 관찰 가능한 세 개의 플라크를 나타냅니다.

이 이미지는 플라크 분석 프로토콜 종료 시점의 플레이트를 보여주며, 로마 숫자로 표시된 3가지 10배 희석 웰이 각각 두 개씩 배치되어 있습니다. 1번과 4번은 10⁻¹ 희석액에, 2번과 5번은 10⁻² 희석액에, 그리고 3번과 6번은 10⁻³ 희석액에 해당합니다.

샘플의 바이러스 역가는 아래에 표시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하고, 용액을 적절한 온도로 평형화하며, 세포 단층이 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 플라크 분석법을 수행하고 mi neurovirus 감염성 입자를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 Mira 노로바이러스를 다룰 때는 본 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 가운을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 하며, 폐기물은 해당 지역 생물안전위원회가 설정한 지침에 따라 적절하게 처리해야 함을 잊지 마십시오.