Name: 손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 손쥐 노로 바이러스(MNV) 감염 입자를 정량화하는 상패 분석법을 이용한 바이러스학 연구 방법입니다. 이 기술은 다양한 생물학 및 환경 샘플에 적용 가능하여 감염성 바이러스 측정에 필수적입니다.

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우리는 중요한 의견과 제안을위한 Wobus 연구소의 회원 감사드립니다. CEW의 실험실에서 일이 미시간 대학, 바이오 방어를위한 우수의 NIH / NIAID 지역 센터와 신흥 전염병 연구 (경찰과) 프로그램, 지역 V &#39;위대한에서 경력 개발 기금에서 시작 - 자금에 의해 추진하는 사업 호수 &#39;경찰과 (NIH 상 1-U54-AI-057153)와 NIH R01 AI080611. MBG-H. 미시간 대학에 실험 면역학 (NIH T32 A1007413-16)와 미생물 Pathogenesis에있는 분자 메커니즘 (NIH T32 A1007528) 교육 교부금의 지원을받는되었다. JBC는 Coordenação 드 Aperfeiçoamento 드 Pessoal 드 Nível 수 페리 어 (망토), 브라질리아, 브라질의 지원을받는되었다.

1. 264.7 RAW 대 식세포 셀 라인의 배양 <ol><li> 10 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML)로 높은 혈당 DMEM으로 구성되어 DMEM-10 미디어 RAW 264.7 세포 (ATCC, 카탈로그 # 티비 - 71), 10 MM HEPES을 유지 , 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신, 1 MM 비 필수 아미노산, 2 MM L-글루타민. 세포는 일반적으로 병 당 미디어의 35 ML을 포함 175cm이 조직 문화 플라스크에 유지하고 37 incubated 아르 ° C 5 % 조직 문화 인큐베이터에서 CO 2. 그러나, 어떤 크기의 병은 병의 크기에 적합한 미디어의 볼륨와 함께 사용할 수 있습니다. </li><li> 셀을 분할하려면 기존의 미디어를 대기음, 셀에 신선한 DMEM-10 미디어 10 ML을 추가 한 다음 셀 스크레이퍼를 사용하여 플라스크의 바닥에서 세포를 다 쳤어요. 다음, 10 ML의 피펫으로 세포를 그림으로써 동질적인 솔루션으로 세포를 resuspend하고 강제 피펫 팁 PR을 통해 세포를 쥐어술병의 바닥에 대한 essed. 최소 3 배 세포가 더 이상 덩어리 때문에 함께이 작업을 반복합니다. 하나의 세포 현탁액가 생성되었는지 빛 현미경으로 확인합니다. 새로운 175cm 두 플라스크에 세포 현탁액의 2 ML (1시 5분 희석 또는 ~ 2x10 7 세포), 미디어의 최종 볼륨을 최대 가지고 - 그리고 1 ML (1시 10분 희석 또는 ~ 1x10 7 세포)를 전송 35 ML. </li><li> 분할 세포가 (~ 1x10 8 셀 total/175 cm 2 플라스크)은 거의 합류 할 때 : 1시 5분 희석로 시작하는 경우 1시 10분 희석, 또는 모든 이일으로 시작하는 3 일 경우. 분할 세포하기 전에 세포 형태를 확인 빛 현미경을 사용하십시오. 세포의 대부분은 둥근 모양과 활성화해서는 안됩니다. 활성 세포는 가늘고 긴 형태 부속과 과립 및 / 또는 확장 수 있습니다. 이러한 세포는 일반적으로 액자를 형성하지 않는 셀 ...보다 빨리 자라다하게하지 마십시오. 통로 번호 추적 유지하고 자주 세포의 낮은 통로 나누어지는을 해동하여 다시 시작. (우리는 컷 - 오프로 통과 30 사용). </li></ol> 2. MNV Inoculum와 RAW 264.7 세포를 감염 <ol><li> 종자 RAW 264.7 1x10 6 가능한 셀 / DMEM-10 미디어 ML의 밀도에서 6 잘 플레이트 (3.5 cm 직경)로 세포, 각도이 정지 2 ML를 추가합니다. 그것은 손 적어도 10 번으로 판을 흔들거나 ~ 10 분에 흔들 장치를 사용하여 하나 고르게 우물에서 셀을 배포하는 것이 중요합니다. 소용돌이 접시를이 잘의 중심에 클러스터 셀의 원인이되므로하지 마십시오. 장소 플레이트 조직 문화 인큐베이터로 (37의 ° C 5 % CO 2). 세포가 37 ° C.에서 하루 아침에 적어도 4 시간에 첨부 할 수 있도록 허용 셀은 60해야 - 80 % 상패 분석​​을위한 합류하고 잘 걸쳐 균일하게 분포. </li><li> 다음 날, 조직 문화에 MNV에 감염된 세포에서 또는 MNV에 감염된 생쥐의 균질 조직 또는 배변 샘플에서 할 수있는 바이러스 inoculum을 준비합니다. 조직 샘플을 사용하여 완두콩 크기의 파이조직의 eces은 조직 균질를 (; 로슈 예 MagnaLyser)를 사용하여 DMEM-10의 1 ML에 무균 실리카 구슬을 포함하는 2 ML 나사 캡 튜브에 균질하고 있습니다. 배변 샘플의 경우, 더 이상의 3보다 배변 펠릿은 1 ML 미디어에서 균질해야합니다. 모든 샘플은 다음 냉동 (-80 ° C에서)과 상패 분석​​을 수행하기 전에 한 번 해동 있습니다. </li><li> DMEM / 높은 포도당, 5 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML), 10 MM의 HEPES, 100로 구성되어 완벽한 DMEM-5 미디어에서 바이러스 inoculum의 10 배 dilutions을 준비 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 1 MM 비 필수 아미노산, 2 MM L-글루타민. </li><li> 열 배나 시리얼 dilutions가 24 잘 접시에 준비가되어 : A 중계 피펫은 여러 우물에 1.35 ML 미디어를 분배하는 데 사용됩니다, 10 -1 희석는 미디어의 1.35 ML 및 바이러스 함유 시료의 0.15 ML을 혼합하여 만든되고 그런 다음 10 -1 희석의 0.15 ML은 10 -2 dilutio를 만들기 위해 미디어 1.35 ML에 추가됩니다N 등. 이 팁 당신이 새로운 희석 할 때마다 변경하는 것이 중요합니다. 멀티 채널 피펫은 당 잘 0.15 ML의 총 볼륨을 (그림 3A 참조) 전송 24 잘 접시의 잘 하나에이 팁 피팅을 한 번에 여러 개의 샘플의 dilutions를 만들기 위해 사용할 수 있습니다. </li><li> 조직 homogenates 및 배변 내용에 대한 일반적인 희석 범위는 10 -1 10 -3입니다. 그러나 이러한 샘플에서 액자는 조직 배양 샘플에서 해당에 비해 작은 경향이 있습니다. 또한, 일부 경우에 배변 샘플 1:100 희석 따라서 액자를 계산 할 수있는 능력을 방해, 충분히 세포 monolayer가 중단 될 수 있습니다 대소변의 독성 구성 요소를 희석하기 위해 필요합니다. 조직 문화 lysates의 희석 범위는 바이러스 수명주기 동안 관심의 시점에 따라 달라집니다. 10 -9까지 가서 Dilutions은 감염의 정상에 필요할 수 있습니다. </li><li> 시리얼 dilutions가 준비되고 나면, 6 잘 판에 레이블을s는 샘플 이름과 도금되는 dilutions와 RAW 264.7 monolayers을 (섹션 2.1에서) 포함. 한 번에 한 판, 이거 flicking하거나 aspirating하여 모든 미디어를 제거합니다. 바로 다음에 희석 샘플의 0.5 ML를 추가합니다, 그럼 다음 희석로 이동하기 전에, 중복도를 반복합니다. 모든 3 dilutions는 모든 셀이 적용되었습니다 보장하기 위해 손으로 앞뒤로 한 판, 틸트 판에 추가됩니다되면. 세포 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 한 번에 하나의 판을 처리합니다. </li><li> 각도에 dilutions의 0.5 ML를 추가 한 후에 수직 플레이트를 스택과 실온에서 1 시간 사람들을 품다. 볼륨은 각 잘에 추가 완전히 monolayer를 커버하기에 충분하지 않으므로, 접시 부드럽게 손으로 모든 10-15 분에서 앞뒤로 기울거나 흔들 장치 (분 당 ~ 18 진동)에 배치해야합니다. 이 말리는의 세포를 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 낮은 녹는 점 아가로 오스 (SeaPlaque) 오버레이 준비 <ol><li> 1 시간에 부화가 완료되기 전에 플레이트의 총 볼륨에 필요한 오버레이의 양을 계산할 수 있습니다. 필요한 볼륨 / 잘 또는 12 ml/6-well 판 2 ML 있습니다. 아가로 오스 (섹션 3.2 참조) 별도의 미디어를 (섹션 3.3 참조) 준비합니다. </li><li> 아가로 오스를 준비하려면 유리 병에 증류수 (3 % w / V)의 100 ML의 총 볼륨에 SeaPlaque 아가로 오스의 3 G를 일시 중지합니다. 20-30 분 동안 압력솥. (아가로 오스는 이미, 전자 레인지에 재 용해 아가로 오스 손 전에 준비 된 경우.)은 아가로 오스가 너무 뜨거운 경우 ° C 사용하기 전에 물을 욕조에이 세포를 죽일 것이기 때문에 42 SeaPlaque 아가로 오스를 평형하는 것이 중요합니다. 수위 원치 않는 응고를 방지 할 수있는 아가로 오스의 수준 이상 동일해야합니다. </li><li> 미디어를 준비하려면 구성되어 배 가상 미디어, 100 ML을배 가상, 10 % (V / V) 낮은 내 독소 태아 소 혈청 (&lt;10 EU / ML), 10 MM의 HEPES, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 4 MM L-글루타민. ° C 물 목욕 37에 미디어를 평형. </li><li> 감염된 세포 monolayers을 오버레이 바로 앞에 1:1 비율로 SeaPlaque 아가로 오스와 멸균 병에 함께 배 가상 미디어를 모두 섞는다. 200 개 이상의 ML 오버레이가 필요한 경우 분할 다중 병에 볼륨 37에 유의 ° C 물 목욕 사용할 준비가 될 때까지. </li><li> 1 시간의 부화 (섹션 2.7 참조​​)의 끝 부분에 각도의 inoculum을 대기음. 천천히 각 우물의 벽을 피펫 팁을 배치하여 각 우물의 가장자리에 오버레이 2 ML를 추가합니다. 최대 5 개의 접시에이 세포 밖으로 건조하지 않고 동시에 처리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 오버레이 조직 문화 인큐베이터에 수직 플레이트를 걸기 전에 실온에서 약 10 분 동안 더욱 강화 할 수 있습니다. 5% CO 2에서 37 ° C에서 48 시간에 대한 번호판을 품다. </li><li> 후부화 기간이, 액자는 육안으로 희미하게 볼 수 있으므로, 액자의 존재에 대한 흠없는 접시를 확인합니다. 더 액자가 표시되지 않는 경우, 추가 4 시간에 품다 다시 확인합니다. 그러나, 최대 부화 시간은 72​​ 시간을 초과 할 수 없습니다. </li></ol> 4. 중립 레드 염색에 의한 액자의 시각화 <ol><li> - 1X PBS의 모든 97 ML (조직 배양 등급, MG 2 +로, 액자를 시각화하기 위해 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션은 중성 붉은 색의 3 ML (시그마, 카탈로그 # N2889 DPBS에서 0.33 % w / V)를 추가하여 준비가되어 있습니다 칼슘 2 + - 무료, Gibco는 카탈로그 # 10010). 12 ML 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션이 각 6 잘 판에 필요한 : 실험에 필요한 중립적 인 붉은 색 얼룩 솔루션의 볼륨을 계산합니다. 그런 다음 각 잘에 2 ML를 추가합니다. 일부 상패 분석​​ 프로토콜은 아가로 오스 플러그는 우물에서 제거 할 필요가 있지만,이 프로토콜에 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션은 오버레이에 직접 추가됩니다. </li><li> 에서 한 시간 후액자가 여전히 우물의 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션으로 표시되는 경우 37 ° C에서 cubation가 확인합니다. 액자는 쉽게 명백하지 않은 경우, 착색 다른 시간 동안 지속 할 수 있습니다. 액자가 표시 될 때까지 잠복기가 계속합니다. (참고 :. 이상 3 시간에 착색이 최적 아니며, 어떤 액자가 착색의 3 시간 후 긍정적 인 제어 예제에서 볼 수없는 경우, 상패 분석​​이 제대로 작동하지) 착색가 완료되면 중립 붉은 얼룩 솔루션을 기음 , 아가로 오스 플러그를 보장하는 것은 방해 한 다음 액자를 계산으로 진행되지 않습니다. </li><li> 가벼운 상자를 거꾸로 판을 배치하고 중복 카운트를 방지하기 위해 계산 액자에 점을 표시하여 액자를 계산합니다. (함께 액자의 융합 대한 시각적 증거를 즉 없음) 액자가 명확하게 구분되어 우물에 액자를 계산하기 위해 희석을 선택합니다. 가능하면, 두 dilutions에 액자를 계산합니다. 그렇게 상패 크기 MNV의 변종 바이러스 inoculum 사이에 다를 수 있습니다하는 것이 중요합니다, 그리고에 따라 달라집니다상패 분석​​ 중에 RAW 264.7 세포의 상태. </li><li> 더 액자는 잘에서 볼 수 없습니다, 각 샘플에 바이러스 존재 또는 바이러스의 양 상패 분석​​의 검출의 제한 속도를 넘지이 없었다합니다. 이 경우 우물은 다른 상패 함유 우물과 비슷한 색으로 붉은 색을 얼룩. 주어진 희석에있는 너무 많은 바이러스 입자가 될 때 액자의 부재도 관찰된다. 이 전체 monolayer의 용해에 이르게하고 우물은 색 노란색 / 주황색 표시됩니다. </li><li> 바이러스 titers을 계산합니다. 하나의 희석에 우물 모두에서 액자의 수를 추가하고 희석 요소 (예 : 1 ML이 우물은 0.5 ML에 감염되는 경우)에 의해 곱합니다. 이 1 ML의 inoculum 볼륨에서 플라크 형성 단위의 양 (PFU)를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 10 -2 희석의 그림 4에, 잘 하나 ( &quot;II&quot;로 표시) 14 액자을 가지고 있으며 다른 우물 ( &quot;V&quot;표시) 17 액자 있습니다. 따라서, 바이러스 titer는 14됩니다X10 2 + 17x10 2 = 3100 (3.1x10 3) PFU / ML. </li></ol> 5. 대표 결과 전염성 MNV-1 입자는 그림 1에 개략적으로 설명한대로 상패 분석을 사용하여 정량화 할 수 있습니다. 그림 2A 방금 전에 감염에 대한 RAW 264.7 세포 monolayer로 잘 보여주고, 그림 2B는 I, II는 로마 숫자로 표시 셋 보이는 액자를 보여줍니다 동안 잘와 III. 분석의 각 단계는 그림에 묘사 된 아르 F. 그림 3A를 통해 3A는 바이러스 함유 시료의 10 배 희석 시리즈의 준비를 보여줍니다. 그림 3B는 6 잘 접시의 우물을 복제 할 수 dilutions의 전송을 보여줍니다. 그림 3C는 1 시간 동안 실온에서 inoculum와 RAW 264.7 세포를 배양하는 데 사용되는 흔들 장치를 보여줍니다 그림 3D는 세포가 SeaPlaque과 중첩되고 보여줍니다. 가상그림 3 층이 세포는 나중에 0.01 % 중립적 인 붉은 색 솔루션을 48 시간 물들하는 장면이 동시에 혼합. 그림 3E는 오버레이 더욱 강화 할 수 있도록 실온에서 판을 보여줍니다. 1-3 시간에 세포를 얼룩과 중립적 인 붉은 얼룩 솔루션을 aspirating 후, 액자가 표시되어 있으며 (그림 4) 계산 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> 그림 1. MNV 상패 분석 프로토콜의 도식. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> 그림 2. 감염 이전과 액자 형성 후 monolayer의 잘 대표 이미지. A) RAW 264.7 세포는 20x 배율에서 가벼운 현미경으로 야간 및 이미징 배양 하였다. B) 셀은 48 H 후 0.01 % 중성 붉은 색 솔루션을 물들되었습니다감염 연구하고 4X 배율에서 가벼운 현미경으로 시각화. 로마 숫자 I, II, 및 III 세 보이는 액자를 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> 그림 3. 다른 상패 분석 단계의 대표 이미지. A) MNV-1 inoculum는 10 배 dilutions에 준비가되어 있습니다. B) Inoculum는 중복 우물의 세포 monolayers에 추가됩니다. C) 셀 및 inoculum은 실온에서 1 시간에 락 음악으로 incubated 수 있습니다. D) 셀 SeaPlaque 아가로 오스와 배 가상 미디어의 1:1 혼합물 중첩되어 있습니다. E) 플레이트는 오버레이가 더욱 강화 할 수 있도록 실온에서 10 분 동안 incubated 수 있습니다. 중립 붉은 얼룩 솔루션 48 시간이 후 감염 세포의 F) 얼룩. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> 셀 monol의 그림 4. MNV-1 양식 액자에어. 여기에 표시하면 부화의 1 시간 후 중성 붉은 얼룩 솔루션 물들 액자를 보여, 48 시간 게시물 감염 대표 상패 분석​​ 판입니다. 판은 세 10 배 dilutions의 중복 우물을 보여줍니다. I와 IV가 10-1 희석에 해당하는 로마 숫자로 표시 웰스, II와 V는 10-2 희석에 해당하는, III와 VI가 10-3 희석에 해당합니다. 샘플의 바이러스 titer는 (계산에 대한 자세한 내용은 4.5 절 참조) 아래 표시됩니다.

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</ol>

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여기에 제시된 MNV-1에 대한 상패 분석​​ 방법은 전염성 MNV 입자를 정량화하는 방법이다. 그림 3에 도시 된 검정 단계를 수행하여 하나는 재현 바이러스 titers를 얻을 수 있습니다. 분석의 검출의 제한은 사용 시작 희석에 따라 달라집니다. 위의 설명에 따라 샘플의 1시 10분 희석로 시작하면, 상패 분석의 검출 한계는 10 PFU (즉, 10 -1 희석에 표시 한 명판)입니다. 각 플라크가 하나의 바이러스를 대표하기 때문에, 상패 분석은 절연 액자를 선택하고 그들에게 이전 한 기술 전파에 의해 MNV의 clonal 인구를 정화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 상패의 purifications는 혼합 바이러스 집단에서 개별 바이러스 인구를 구분하는 데 사용할 수 있습니다. MNV 감염의 검출을위한 상패 분석을 사용의 한계는 모든 MNV의 변종이 액자 4 대를 형성한다는 것입니다. 그러나, inabili을 극복 할 수도 있습니다직렬 조직 배양 7이 바이러스를 passaging하여 액자를 형성하는 동물로부터 분리 일부 MNV의 변종의 타이. 상패 분석에 대한 대안은 TCID 50 기술 3, 4를 통해 전염성 입자를 측정하는 것입니다. 이 분석은 엔드 포인트 dilutions와 MNV 4 완료 일주 소요에 따라 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 단정 지을. 상패 분석보다 느린 것뿐만 아니라, TCID 50 검정는 또한 문자를 구분하지 않습니다 (감지 한계 = 200 TCID 50 / ML) RAW 264.7 세포 4 조직 샘플의 독성으로 인해. 프로토콜에서 중요한 단계 프로토콜을 통해 설명되어 있지만, 다음 절 문제 해결을 촉진 할 수있는 요약을 제공합니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 RAW 264.7 세포가 바이러스 복제를 지원하는 분석을 통해 가능한 상태로 유지하는 것입니다. 이 수빛 현미경을 통해 분석의 각 단계에서 모니터링 할 수. 세포 생존 능력은 두 가지 방법으로 보장되어 있습니다. 첫째, 치료가 접시를 처리하는 동안 셀 아웃 리곤하지 않도록해야합니다. 따라서, 접시는 한 번에 하나씩 주사 감염 기간 동안 뻔하며, 처리되지 않습니다 때마다 유지 폐쇄해야합니다. 둘째, 솔루션은 세포에 추가하면 ~ 37 ° C.에 equilibrated해야 또한, 세포의 활성화를 제한하는 낮은 독소 혈청 (&lt;10 EU / ML)가 포함 된 미디어를 유지하는 RAW 264.7 세포의 전반적인 건강에 중요합니다. 통로 30 이상 세포를 사용하는 경우 또한, 우리는 상패 분석​​의 높은 실패율을 관찰했습니다. 이 가능성이 실험실에서 실험실에 따라 다를 수 있지만, 더 높은 통로 RAW 264.7 세포를 사용하여 특히, 재현 titers을 보장하기 위해 (예를 들어, 알려진 바이러스 titer와 샘플) 긍정적 인 제어를 포함하는 것이 중요합니다. 높은 통로 세포의 사용을 제한하기 위해, 일찍 무슨 일이야? 병을 고정 할 것이 좋습니다RAW 264.7 세포의 수령과 자주 얼어 붙은 병에서 새로운 문화가 시작시 GE 세포. 셀 변경 등, 세포 형태의 변화를 준수 (예 : 원형에서 가늘고 긴과 분산)를 위해 실패와 같은 특성, 또는 mycoplasma 오염이 감지되었습니다 전시 때 낮은 통로 세포 문화와 다시 시작하면 도움이 될 것입니다. 에주의를 지불 할 또 다른 중요한 점은 피펫 팁이 샘플 사이의 dilutions 동안 변경되어 있는지 확인하는 것입니다. 이 정확한 시리얼 dilutions을 보장 함과 샘플 사이의 교차 오염을 방지 할 수 있습니다. 동일한 샘플의 시리얼 dilutions가 우물에 추가 할 때 같은 피펫 팁을 다시 사용할 수있는 프로토콜의 한 단계입니다. 이 경우, 하나는 가장 희석 inoculum에서 최소로 시작하고 새로운 희석을 그릴 때 힘차게 아래로 피펫과해야합니다. 상패 분석​​ 프로토콜은 몇 가지 수정으로 수정할 수있는 것입니다. t 변경 할 수있는 하나 수정여기에 중복에 우물을 inoculating 충분한 세포가 아닌 각 희석 만 한 우물을 예방하는 것입니다. inoculum 볼륨이 0.5 ML이기 때문에 그러나, 액자의 수는 PFU / ML에 정상화하기 위해 2 인자를 곱한해야합니다. 상패 분석도 MNV의 복제를 지원 할 수 있습니다 다른 자기편 세포 라인에 사용하기 위해 구성 될 수 있으며, 이것은 손쥐 microglial BV-2 세포주 8 설명되어 있습니다. 구현 될 수있는 다른 수정은 다른 바이러스 개발 상패 분석​​ 프로토콜에 대해 설명 된 적응합니다. MNV의 경우, 다음과 같은 수정은 이미 성공적으로 구현 된, 메틸 대신 바다 플라크의 셀룰로오스 아가로 오스 9, 크리스탈 바이올렛 또는 그 대신 중립적 인 빨간색 10, 11의 푸른 메틸렌과 세포의 착색의 사용. 기타 상패 - 성형 바이러스를 수량화하기 위해 필요한 또는 oth에 사용으로 전반적으로,이 프로토콜을 쉽게 적용 할 수 있습니다그 일반적으로 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 유용한 도구 만들기, RAW 264.7 세포에서 lytic 감염을 일으킬 응급실 바이러스.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DMEM / 높은 포도당 </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2X 가상 </td><td> Gibco </td><td> 11,935 </td></tr><tr><td> 100x 페니실린과 스트렙토 마이신 </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 MM 비 필수 아미노산 </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 100 HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 MM (100x) L-글루타민 </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> 바다 플라크 아가로 오스 </td><td> Lonza </td><td> 50,100 </td></tr><tr><td> 중립 레드 0.33 % </td><td> 시그마 </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 10,010 </td></tr><tr><td> 1.0 mm의 지르코니아 / 실리카 비즈 </td><td> BioSpec 제품 </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> 모델 35 속도 로커 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> 마그나 Lyser 악기 </td><td> 로슈 </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> 원시 264.7 세포주 </td><td> ATCC </td><td> 티비-71 </td></tr><tr><td> 조직 문화 인큐베이터 </td><td> 산요 </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

Plaque Assay for Murine Norovirus

손쥐 노로 바이러스 (MNV)는 효율적으로 조직 배양 1, 2에서 자랍니다 노로 바이러스의 종류의 유일한 회원입니다. 세포 용해 및 cytopathic 효과 (CPE) 손쥐 수지상 세포 나 대 식세포 1 MNV-1 감염 동안 관찰합니다. MNV-1이 속성은 상패 분석 1 수행하여 주어진 예제에서 전염성 입자의 수를 수량화하는 데 사용할 수 있습니다. 플라크 분석은 세포를 lyse하고 액자 3이라고 합류 셀 monolayer에 구멍을 형성 MNV-1의 능력에 의존합니다. 여러 개의 기술은 조직 배양, 수확 조직, 임상, 환경 샘플에서 바이러스 감염을 감지하는 데 사용하지만, 모든 측정 전염성 입자의 수 (예 : qRT-PCR). 할 수 있습니다 전염성 바이러스 입자를 수량화 할 수있는 방법 중 하나는 아래에 상세하게 설명 될 것이다 상패 분석 3을 수행하는 것입니다. MNV 플라크 분석에 변형 형석입니다MNV 항원이 세포 monolayers 4 immunostained되어 escent 초점을 분석. 바이러스 항원 표현이 플라크 형성을 앞에 때문에이 분석은 빠르게 할 수 있습니다. 또한 액자를 형성 할 수없는 바이러스를 titrating하는 데 유용합니다. 그러나, 형광 초점 분석은 항체과 집중 - 성형 단위를 계산하는 현미경으로 상패 분석​​의 이외의 추가 리소스를 필요로합니다. 전염성 MNV도 50 % 조직 문화 Infective 선량 (TCID 50) 3 결정하여 정량화 할 수 있습니다. 이 분석은 엔드 포인트 적정 (5)에 의해 주사 조직 배양 세포의 50 %에 CPE를 생산하는 데 필요한 바이러스의 양을 측정합니다. 그러나, 감지의 제한이 상패 분석 (4)에 비해 높다. 이 문서에서는, 우리는 효과적으로 생물학적 또는 환경 샘플 1, 4, 6 제시 전염성 MNV 입자의 수를 결정하는 데 사용할 수있는 상패 분석 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바 있습니다허용 세포 (RAW 264.7 대 식세포 손쥐 세포)의 monolayer의 예방하​​기 위해 사용됩니다 MNV 함유 샘플의 10 배 시리얼 dilutions의 준비에 SED. 바이러스는 주어진 기간 동안 세포 monolayer에 연결하도록 허용하고 아가로 오스와 세포 배양 매체의 혼합과 셀을 포함하기 전에 흡입합니다. 먼에 위치한 셀에 확산을 제한하는 동안 한천은 주변 세포에 바이러스 자손의 확산을 수 있습니다. 따라서, 감염된 세포 lysed과 monolayer에서 양식 구멍 액자로 알려져 있습니다. 바이러스의 충분한 보급되면, 액자는 중립적 인 빨강, 메틸렌 블루, 또는 크리스탈 바이올렛과 ​​같은 염료와 셀의 표시 다음 착색된다. 낮은 dilutions에서 각 상패는 이웃 세포로 확산 한 전염성 바이러스 입자와 자손에서 유래 된 것입니다. 따라서, 액자의 수를 계산하는 것은 하나가 undiluted 샘플 3 현재 상패 - 성형 단위 (PFU)를 계산 할 수 있습니다.

여기 효율적으로 세포 배양에 복제 유일한 노로 바이러스입니다 손쥐 노로 바이러스 (MNV)의 전염성 입자를 정량화하는 방법을 설명합니다. 플라크 분석은 손쥐 대 식세포에 대한 MNV의 tropism을 활용하고 MNV를 포함하는 생물이나 환경 샘플에서 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.

마우스 노로바이러스(Murine norovirus, MNV)는 조직 배양에서 효율적으로 증식하는 노로바이러스(Norovirus) 속의 유일한 구성원입니다 1, 2. 세포 용해 및 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)는 ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 감염성 뉴런 노로바이러스 입자를 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 바이러스 접종액의 10배 희석액을 준비합니다. 두 번째 단계는 바이러스 접종액 희석액을 RAW 264.7 단층 배양 세포로 옮긴 후, 실온에서 1시간 동안 플레이트를 흔들어주며 배양하는 것입니다.다음으로, 접종물을 흡입하여 제거한 후 C plaque agarose와 2X MEM을 1:1 비율로 혼합하여 덮어주고, 조직 배양 인큐베이터에서 48시간 동안 플레이트를 배양합니다. 마지막 단계로, 뉴트럴 레드(neutral red) 염색액을 덮어준 뒤 조직 배양 인큐베이터에서 1~3시간 동안 플레이트를 배양합니다. 최종적으로, agarose 오버레이를 제거하지 않은 상태에서 뉴트럴 레드 염색액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 라이트 박스를 사용하여 플라크 수를 측정합니다.감염성 바이러스 입자를 정량화하는 이 방법은 분변으로 배출되는 감염성 입자의 양이나 어떤 조직이 감염을 지원하는지와 같이 노로바이러스 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 분석 과정 전반에 걸쳐 건강하고 생존 가능한 세포를 유지하는 데 어려움을 겪습니다. 이전 경험이 없는 사람들에게는 거울 노로바이러스의 플라크 분석법을 이해하는 것이 어려울 수 있으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.본 분석을 성공적으로 완료하려면 적절한 세포 수, 정확한 온도 및 정밀한 핸들링이 누적적으로 이루어져야 플라크를 용이하게 관찰할 수 있습니다. 먼저, 광학 현미경으로 세포 단일층을 관찰하여 세포의 형태를 확인하십시오. 대부분의 세포가 둥근 모양으로 보여야 합니다.세포가 과증식하지 않도록 주의하십시오. 일반적으로 과증식한 세포는 플라크를 형성하지 않습니다. Murn neurovirus 플라크 분석을 위해 거의 합류(confluent) 상태에 도달한 175 cm² 조직 배양 플라스크의 raw 2 6 4 0.7 세포를 준비합니다. 플라스크에서 배지를 흡입하여 제거한 후, 세포에 10 mL의 신선한 DMEM 10을 첨가합니다. 다음으로, 세포 스크래퍼를 사용하여 플라스크 바닥에서 세포를 긁어내고, 10 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 흡입한 다음 플라스크 바닥에 대고 분사합니다. 이 과정을 최소 3회 반복하여 세포 덩어리를 모두 풀어줍니다.스톡 플라스크에 적합하도록 합니다. 세포 현탁액 1~2 mL를 취하여 DMEM 10 33~34 mL가 들어있는 새로운 175 cm² 플라스크에 넣습니다. 플라스크를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 조직 배양 인큐베이터에서 2~3일 동안 배양한 후 다시 계대 배양합니다.분석을 위해 플레이트에 세포를 파종할 때, 세포 현탁액의 밀도를 DMEM 10에서 1×10⁶ viable cells/mL로 조정한 후, 이 현탁액 2 mL를 직경 3.5 cm의 6-well plate의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 즉시 플레이트를 손으로 10회 흔들어 세포가 웰 내에 고르게 분산되도록 합니다.세포가 웰 중앙에 뭉칠 수 있으므로 플레이트를 기울이지 마십시오. 그 후, 세포가 부착될 수 있도록 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 최소 4시간 또는 가급적이면 하룻밤 동안 보관하십시오. 바이러스 접종액은 MNV 감염 조직의 균질물 또는 MNV 감염 마우스의 분변 샘플로부터 얻을 수 있습니다. 조직 샘플을 사용하는 경우, 멸균 실리카 비드와 1 mL의 DMEM 10이 들어 있는 2 mL 스크류 캡 튜브에 완두콩 크기의 조직 조각을 넣고 균질화하십시오.자성 교반기를 6,000 RPM에서 1분 동안 사용합니다. 분변 시료를 사용하는 경우, 동일한 방식으로 분변 펠릿을 3개 이하로 균질화하고, 균질화된 시료를 -80 °C에서 냉동 보관한 뒤 플라그 분석 당일에 접종균을 해동합니다. 리피팅 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에 DMEM five 1.35 mL를 분주한 다음, 플레이트의 첫 번째 웰에 세 번째 바이러스 접종균 0.15 mL를 파이펫으로 넣습니다.첫 번째 10⁻¹ 희석액 0.15 milliliters를 흡입하여 플레이트의 두 번째 웰로 옮겨 10⁻²로 희석함으로써 10배 연속 희석을 수행합니다. 그런 다음 두 번째 웰의 희석액으로 동일한 과정을 반복하여 10⁻³로 희석합니다. 시료에 따라 10⁻⁹까지 추가 희석이 필요할 수 있음에 유의하십시오.단계별 희석액이 준비되면, 60~80% 합류도를 보이는 2 64 0.7 세포 플레이트에 샘플 이름과 사용된 희석 배수를 표시합니다. 그다음, 플레이트 중 하나의 배지를 흡입하거나 털어내어 모두 제거하고, 웰에 희석된 샘플 0.5 milliliters를 첨가합니다. 중복 웰에 대해서도 동일하게 반복한 후, 다음 낮은 희석 단계로 진행합니다.세 가지 희석액을 모두 한 플레이트에 두 번씩 분주한 후, 플레이트를 앞뒤로 기울여 모든 세포가 충분히 덮이도록 합니다. 다음 세포 플레이트에도 동일한 과정을 반복합니다. 모든 플레이트의 처리가 완료되면, 분당 약 18회 진동으로 설정된 로킹 장치(rocking apparatus) 위에 플레이트를 올려놓고 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 그동안 미리 준비하거나 멸균한 agar 병을 전자레인지에 넣어 녹입니다.그 다음, 녹인 agarose를 42 °C 항온수조에 넣어 온도를 맞춥니다. 이어서, 멸균된 2X XMEM 배지와 녹인 agarose를 멸균된 병에 1:1 비율로 혼합합니다. 이 오버레이 용액이 담긴 병을 사용 직전까지 37 °C 항온수조에 보관합니다.1시간의 배양 기간이 끝나면, 각 웰에서 접종액을 흡입하여 제거하고, 피펫 팁을 각 웰의 벽면에 대고 오버레이 용액 2 mL를 천천히 가합니다. 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해 플레이트를 덮고 상온에서 약 10분 동안 오버레이가 응고되도록 둡니다. 그 후, 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 48시간 동안 배양합니다.배양 기간이 끝난 후, 플레이트에 플라크가 형성되었는지 확인합니다. 플라크가 보이지 않을 경우, 플레이트를 다시 배양기에 넣고 4시간 후에 다시 확인합니다. 필요에 따라 이 과정을 반복하되, 총 배양 시간은 72시간을 초과해서는 안 됩니다.먼저, 뉴트럴 레드(neutral red) 염색액을 준비합니다. 그다음 본 프로토콜에서는 각 웰에 뉴트럴 레드 용액 2 mL를 첨가하며, 이때 aros 플러그는 제거할 필요가 없습니다. 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.배양 시간이 경과한 후, 웰에 중성 적색 용액을 유지한 상태에서 플레이트에 플라크가 형성되었는지 확인합니다. 염색이 뚜렷하지 않은 경우, 최대 3시간까지 한 시간씩 더 배양합니다. 플라크가 보이면 어로즈 플러그가 흐트러지지 않도록 주의하며 중성 적색 용액을 흡입 제거한 후, 플라크 수를 측정합니다.플레이트를 검사하여 플라크가 명확하게 분리된 희석 배수를 찾습니다. 플레이트를 라이트 박스 위에 놓고, 중복 계산을 방지하기 위해 계산한 플라크에 점을 표시하면서 플라크 수를 셉니다.그런 다음 다른 희석 배수의 바이러스가 포함된 웰에서 계수를 반복하고, 밀리리터당 플라크 형성 단위(plaque forming units per milliliter)로 바이러스 역가를 계산합니다. 서면 프로토콜의 지침에 따라, 이 대표 이미지는 감염 전의 단일층을 보여줍니다. raw 2 6 4 0.7 세포를 하룻밤 동안 배양한 후 광학 현미경의 20배 배율로 촬영하였습니다.이 이미지는 플라크 형성 후의 동일한 단일층을 보여줍니다. 감염 48시간 후 세포를 0.01% 중성 적색 용액으로 염색하고 4배율 광학 현미경으로 관찰하였습니다. 로마 숫자 I, II, III은 관찰 가능한 세 개의 플라크를 나타냅니다.이 이미지는 플라크 분석 프로토콜 종료 시점의 플레이트를 보여주며, 로마 숫자로 표시된 3가지 10배 희석 웰이 각각 두 개씩 배치되어 있습니다. 1번과 4번은 10⁻¹ 희석액에, 2번과 5번은 10⁻² 희석액에, 그리고 3번과 6번은 10⁻³ 희석액에 해당합니다.샘플의 바이러스 역가는 아래에 표시되어 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 샘플 간의 교차 오염을 방지하기 위해 희석 단계마다 피펫 팁을 교체하고, 용액을 적절한 온도로 평형화하며, 세포 단층이 마르지 않도록 주의하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청한 후에는 플라크 분석법을 수행하고 mi neurovirus 감염성 입자를 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.생물안전작업대(biosafety cabinet)에서 Mira 노로바이러스를 다룰 때는 본 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 가운을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 하며, 폐기물은 해당 지역 생물안전위원회가 설정한 지침에 따라 적절하게 처리해야 함을 잊지 마십시오.

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.

감염성 Murine 노로 바이러스의 역방향 유전학 중재 복구

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

이 동영상은 인간 장내 세균에 결합하는 인간 노로바이러스 유사 입자(VLP)를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 박테리아 현탁액은 VLP와 혼합되고 배양되어 VLP-박테리아 복합체가 형성될 수 있도록 합니다. 그런 다음 복합체를 형광단 태그가 지정된 VLP 특이적 항체로 라벨링한 다음 유세포 분석 기반 시각화 및 정량화를 통해 VLP 결합 박테리아의 비율을 식별합니다.

인간 노로바이러스 VLP와 장내 세균의 결합을 정량화하기 위한 분석

Plaque assay는 바이러스 정량화를 위한 황금 표준으로, 호스트 세포 단층의 entrapping overlays를 활용하여 바이러스 역가를 측정합니다. 전통적으로 다양한 반고체 오버레이가 사용되어 왔지만, 여기에서는 반고체 오버레이를 여러 바이러스 계열 중에서 새로운 액체 미정질 셀룰로오스와 비교하는 플라크 기술을 보여줍니다.

사용하여 전통과 소설 오버레이 시스템 : 플라크 분석 실험을 통해 바이러스 농도 결정

여기에서는 역전사-정량적 PCR을 사용하여 환경 및 음용수에서 엔테로바이러스와 노로바이러스를 정량화하는 절차를 제시합니다. EPA Method 1615의 표준화된 절차를 통해 지하수에서 바이러스가 회수되는 평균 비율은 소아마비 바이러스의 경우 20%, 쥐 노로바이러스의 경우 30%였다.

엔테로 바이러스 및 문화와 RT-qPCR에 의해 물에서 노로 바이러스의 발생의 EPA 방법 1615 측정. 파트 III. RT-qPCR에 의한 바이러스 검출

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

환경적으로 단단한 표면에서 노로바이러스를 검출하고 정량화하기 위해 매크로폼 기반 샘플링 방법론이 개발되고 평가되었습니다.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

여기 두 개의 프로토콜 특정 성장 율 및 상 패 분석 결과 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여로 타 바이러스의 셀 바인딩 기능에 대 한 다른 측정 한 선물이. 이러한 프로토콜으로 타 바이러스 변종 고기에 차이 확인 수 있습니다.

특정 성장 속도로 타 바이러스의 세포 바인딩 기능에 대 한 분석

이 프로토콜의 목적은 진핵 병원체 인간 노로바이러스의 결합을 박테리아에 정량화하는 것이다. 초기 바이러스-박테리아 부착 분석을 수행한 후, 유동 세포측정은 집단 내에서 바이러스 결합 박테리아를 검출하는 데 사용된다.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

학습하세요 손쥐 노로 바이러스(MNV) 감염 입자를 정량화하는 상패 분석법을 이용한 바이러스학 연구 방법입니다. 이 기술은 다양한 생물학 및 환경 샘플에 적용 가능하여 감염성 바이러스 측정에 필수적입니다.

손쥐 노로 바이러스에 대한 상패 분석

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