Zebrafish 태아의 대사 프로필 분석

다음 프로토콜의 전반적인 목표는 특정 유전적 또는 생리학적 변화에 대한 반응으로 제브라피시 배아의 대사 프로필을 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 선택적 약리학적 화합물을 사용하여 특정 유전적 또는 생리학적 경로를 조절함으로써 달성됩니다. 다음으로, 원하는 발달 단계에 도달했을 때 대조군에서 기저 호흡을 측정하고 해마 XF 24 분석기를 사용하여 배아를 처리했습니다.

그런 다음 생체 내에서 발달 중인 제브라피시에서 대사 프로파일을 연구할 수 있고 이러한 프로파일이 배아 발달 중 특정 유전자를 표적으로 하여 조절될 수 있음을 보여주는 데이터 결과를 얻어 호흡 매개변수를 계산합니다. 세포 기반 분석 또는 호흡의 간접 측정과 같이 이미 사용 가능한 기술과 관련하여 세포의 주요 이점은 우리가 전체 유기체, 전체 배아를 다루고 있어 미토콘드리아 호흡의 모든 측면을 볼 수 있다는 것입니다. 이 기술은 전체 동물의 호흡과 미토콘드리아 기능을 측정하여 신진대사의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

치료를 시작하려면 0.2 밀리 몰 1, 페닐 2, 테오 uia에서 C 2 교잡 또는 오일 레드 O 염색에 대한 수정 후 제브라 피쉬 배아를 수집합니다. 색소 형성을 방지하려면 약 26시간 동안 배아를 배양해야 합니다. 해마 XF 24 분석기를 사용하기 전에 차량 전용 제어 장치와 함께 적절한 최종 농도로 원하는 화학 물질을 첨가하고, 산소 및 수소 플루오로 힘을 수용하는 보정을 실행하여 24웰 XF 24 islet plate를 준비합니다.

먼저 700마이크로리터의 E 3개 매체를 각각 추가합니다. 그런 다음 20개의 웰에 하나의 배아를 추가하여 표본이 측정 챔버에 남아 있는지 확인합니다. 분석 전반에 걸쳐 각 웰의 상단에 작은 구멍 캡처 화면을 적용합니다.

10개의 웰은 C로 표시된 배아를 대조하는 데 사용되며 10개의 웰은 T로 표시된 처리된 배아를 위해 사용됩니다. 블랙 박스는 배아가 없는 웰을 나타내며, 이는 플레이트 전체의 온도 변동을 제어하는 데 사용됩니다. 이제 플레이트를 해마 분석기에 로드합니다. 호흡을 측정하려면 기초 호흡 최대 호흡 프로그램을 사용하여 기초 호흡을 설정하십시오.

2분씩 3회 측정하고, 각 측정 사이에 1분씩 기다렸다가 최종 농도 2.5마이크로몰에서 커플러 FCCP의 미토콘드리아 양성자 4회에서 다음으로 측정합니다. 기저 호흡을 확립한 후 측정 주기를 5-8회 반복합니다. A TP 회전율 Proton 누출 프로그램을 사용하여 모든 리가 마이신 및 TP 합성효소 억제제의 25마이크로몰에서 TP 회전율을 측정하고 측정 주기를 8회 실행합니다.

그런 다음 결과 호흡 값을 사용하여 liga와 매개 호흡 및 기저 호흡의 차이를 계산합니다. 복합 억제제인 로테논 25마이크로몰을 첨가하여 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 프로그램이 완료되었을 때 로톤을 추가한 후 올림과 매개 호흡 및 호흡의 차이를 계산하여 비결합 호흡을 결정합니다.

Seahorse 분석기는 10개의 대조군과 10개의 화학적으로 처리된 배아의 평균값을 계산하여 오일을 수행합니다. 지질 침착을 분석하기 위한 빨간색 o 염색. 처리된 배아와 처리되지 않은 배아가 수정 후 50시간이 지나면 가는 집게를 사용하여 코팅하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 PBS의 4% 파라폼 알데히드로 고정합니다.

배아를 PBT에서 5분 동안 한 번 씻은 다음 60%2개의 프로판올로 1시간 동안 배양한 다음 0.3%오일 레드 O와 60%2개의 프로판올로 배아를 잠시 헹굽니다. 60%2개의 프로판올로 배아를 두 번 헹구고 PBT를 한 번 마지막으로 배아를 30에서 50으로 옮긴 다음 여기에 표시된 대로 사진을 위해 75%글리세롤로 이동합니다. 특정 효소 억제제로 배아를 처리하면 호흡이 약 2배 증가했는데, 이는 특히 두부와 귀 소포 아래에 있는 지질 침착의 증가와 관련이 있었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 동일한 발달 단계에서 배아를 대상으로 작업하는 것이 중요합니다.

대조 배아와 돌연변이 또는 약리학적으로 처리된 배아 간의 미토콘드리아 호흡을 비교할 때 발달이 약간 지연될 수 있는 경우 특히 그렇습니다. 따라서 이 기술의 개발로 신진대사 분야의 연구자들은 제브라 피쉬를 척추동물 모델로 사용하여 전체 동물의 호흡과 미토콘드리아 기능을 탐구할 수 있게 되었습니다.