Name: 전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 배우세요 전체 혈액 표현형 분석을 통한 주요 말초 혈 백혈구 인구 열거 방법입니다. 다중 중심 임상 시험에서 유동 세포측정법을 활용하여 면역 반응을 추적하고 정확한 세포 농도 측정이 가능합니다.

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우리는이 방법, 원고 및 비디오의 개발에서의 도움을 제시카 존스, 에리카 클락, 콘 스턴스 Ducar, 도나 스미스, 로이 루이스, 릴리 Apedaile, 조앤 Wiesner, 데빈 아담스, 코리 McBain와 스티븐 Voght 감사드립니다. 이 작품은 빌과 멜린다 게이츠 재단 CAVD 보조금 38,645 (MJM)와 건강 교부금의 국립 연구소 UM1 AI068618 및 AI069481 U01 (MJM)에 의해 지원되었다. EA-N. NIH 그랜트 T32 AI007140에서 지원됩니다. 우리는 그들의 관대 한 장비 기증을 위해 제임스 B. 펜들턴 자선 신탁 감사드립니다.

참고 : 빛의 형광 - 복합 항체를 보호하기 위해 라이트와 바이오 안전 캐비넷의 모든 단계를 수행합니다. 1. 항체 염색법 패널 준비 <ol><li> 항체 염색법 패널은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 항체 농도는 전체 피와 적정에 의해 정의하고 동일한 유동 세포 계측법 장비와 스테인드 phenotyping 샘플을 취득하는 데 사용됩니다 절차를 사용해야합니다. </li><li> 적절한 착색의 titers가 결정되면 잠금 캡 튜브에서 하나의 혼합으로 모든 항체가 조화를 이루고 있습니다. 100 μl에 총 볼륨을 가져다 흐름 세척 버퍼 (2 % 열 inactivated 태아 소 혈청과 Dulbecco의 PBS)를 추가합니다. 물들되는 샘플 수에 대한 혼합물을 확장. 이 혼합물은 최대 8 주까지에 대해 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 더럽히는 것 <ol><li> 수집 된 혈액은 광고에 다른 목적을 위해 사용하는 경우시간에 민감한 절차 남아있는 혈액 수행하는 동안이 분석에 dition은 따로 나누어지는을 설정할 수 있습니다. 나누어지는이 중요한 세포의 손실없이 venipuncture 후 4 시간 동안 실온에서 최대 저장할 수 있습니다. </li><li> 그대로 비드 펠렛은 Trucount 튜브 및 라벨 샘플 묻은되는 식별 할 수있는 튜브의 하단에 있다는 것을 확인합니다. HVTN 임상 실험에서 실험 데이터 관리 시스템 (프론티어 과학 기술 연구 재단, 애 머스트, NY)은 스테인드 샘플을 라벨 및 추적하는 데 사용됩니다. </li><li> 많은 번호와 모든 시약의 유효 날짜를 기록합니다. 튜브의 가방에있는 제조업체에서 제공 Trucount 관 구슬 카운트 번호를 기록하고, 가방에있는 많은 번호가 튜브에 많은 번호를 일치하는지 확인하십시오. </li><li> 정확하게 단지 금속 리테이너 위에 Trucount 튜브에 전체 혈액의 100 μl를 피펫에 pipetting 반대로 사용합니다. 관의 측면 아래로 번짐의 피를 사용하지 마십시오. </li><li&gt; Trucount 튜브에 일반 (앞으로) pipetting 기술, 혼합 항체 염색법 패널의 피펫 100 μl를 (표 1 참조)를 사용. 약 15 초 혼합하기위한 낮은 속도로 관과 소용돌이를 캡. 시각 비드 펠렛이 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 검사한다. </li><li> 어둠 속에서 실내 온도 (15-30 ° C)에서 15 분 동안 Trucount 관을 품다. </li><li> 필요한 경우, diH 2 O.를 사용하여 1X에 10 나누어지는 × FACS Lysing 솔루션을 희석 900 μl 1 × 튜브에 FACS Lysing 솔루션을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혼합하는 약 15 초에 낮은 속도로 철저하게 관과 소용돌이를 캡. 실험실 필름과 관 및 봉인에 위치를 잠금으로 단단히 뚜껑을 아래로 밀어 넣습니다. </li><li> -65에서 튜브를 저장 ° C -95 ° C의 예제는 중앙 분석 실험실로 배송이나 집에 분석을위한 준비가 될 때까지. 샘플은 적어도 4 주 동안이 단계에서 안정적입니다. imme을 배송 또는 시금 경우diately,이 단계는 생략 할 수 있습니다. </li></ol> 3. 해운 참고 : 다음 지침은 구체적으로 국제 항공 및 운송 협회 (IATA) 규정에 따라 운송 카테고리 B 면제 생물학적 물질을위한 SAF-T-박 주식회사에서 절연 배송 시스템을 사용합니다. 착색이 발생한 같은 위치에 샘플을 분석하는 경우, 섹션 4로 이동합니다. <ol><li> 샘플은 즉시 염색 후 배송하거나 일단은 -65에서 얼 ° C -95 ° C 사이 스테인드 표본 상자에 호일과 장소에 완전히 각 관을 넣어. 흡착제로 leakproof 폴리 가방 내부에 스테인드 표본 상자를 놓으십시오. </li><li> 가방에 가능한 한 공기와 같은과 Tyvek 가방과 인감에 leakproof 폴리 가방과 내용을 넣으십시오. </li><li> 내부 갈색 상자 안에 표본 패키지 (보조 포장 내부의 표본) 놓습니다. </li><li> 내부 갈색 B를 배치스티로폼 상자 내부의 소는 변화를 방지하기 위해 들여 쓰기로 확보. </li><li> 드라이 아이스 (약 8kg)와 스티로폼 상자를 작성하고 가슴에 단단히 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 안전하게 테이프 배송 상자와 배는 생물 물질로 적절한 드라이 아이스 (UN1845) 표시가있는 카테고리 B은 (UN3373), IATA PI-650 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 수령시, 샘플이 -65에 저장됩니다 ° C -95 ° C에 그들이 분석까지. </li></ol> 4. 해동 및 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 흐름 cytometer에 수집 전에 어둠 속에서 실온에서 해동은 냉장고에서 스테인드 샘플을 제거합니다. 하나 이상의 샘플에 대한 데이터를 수집하면 튜브가 1 시간 이상 각각에 대해 실온에서 앉아하는 일이 없도록 해동 망설으로 모든 튜브에 대한 프로세스를 표준화. </li><li> 샘플은 같은 BD LSR 적절한 필터가 장착 된 네 레이저 흐름 cytometer를 사용하여 취득해야합니다II. 데이터 수집 4 표준 cytometer 보정 및 형광 보상 방법을 사용하십시오. </li></ol> 참고 : 컬렉션 5 중 앞으로 분산 또는 측면 분산 형 임계 값을 설정하지 마십시오. Trucount 비즈는 구슬의 일부는 분석을하는 동안 설명 할 수하지 원인이 이러한 매개 변수에 대한 낮은 임계 값 설정 아래 떨어질 수 있습니다. 임계 값을 설정하려면 악기가 필요한 경우, 가장 낮은가요 시안 채널 임계 값을 설정합니다. 패널 물들 CD45 +의 백혈구는 시안이 긍정적인가되며, Trucount 구슬도 앰 시안 채널에 형광 때문에,이 적절히 수집 할 모든 관련 데이터를 허용해야합니다. <ol start="3"><li> 흐름 cytometer에로드하기 전에 5 초에 소용돌이 샘플 튜브를. Trucount 구슬은 여러 채널에서 높은 형광. PE Cy5와 APC (두 colo에 대한 높은 더블 긍정적 인 인구를 찾아서 게이트 수집하는 동안 구슬을가장 쉽게 세포에서 구슬을 구분하는 RS)은 장비에 따라 달라질 수 있습니다. 최소한 2 만 구슬이 획득되기 전까지는 중단 게이트로 구슬 문을 선택하고 기록 데이터입니다. </li><li> 이러한 FlowJo (Treestar, 애쉬 랜드, OR)와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 그림 1은 대표적인 제어 혈액 추첨 다른 백혈구 인구의 분석에 활용 게이팅 구조를 보여줍니다. </li></ol> 5. Trucount 계산 <ol><li> 각 Trucount 튜브는 형광 구슬의 동결 건조 된 펠렛이 포함되어 있습니다. 관에 액체를 추가하고 vortexing 후, 구슬 동일하게 시료 전체에 분산 될 것입니다. 펠렛의 구슬의 수는 많은 번호로 약간 다르며 튜브의 저장소 가방에서 찾을 수 있습니다. </li><li> 게이트는 Trucount 비즈와 세포 인구 각 인구에 대한 이벤트 카운트를 결정하기 위해 그림 1과 같이. 이벤트의 수를 비교 전N 관 원래 구슬의 총 개수에 구슬 문은 다음 각 인구의 절대 농도 (즉, 세포 / μl)를 결정하는 데 사용할 수있는 샘플 수집의 비율을 결정 할 수 있습니다. 세포 농도 (# 세포 / μl 전체 혈액) = [/ # 인구 이벤트 (# 비드 이벤트 / # 펠렛의 총 구슬)] / 100 μl 다음 방정식이 목적을 위해 사용할 수 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> 그림 1. 게이팅 제도는 건강한 자원 봉사의 대표 데이터를 보여주는 주요 백혈구 인구의 분석에 활용. A) Trucount 비즈는 (i) 출입을 금지하고 세포에서 제외됩니다. 과립 성 백혈구 (II)이 구분되어 있으며 lympohcytes와 단핵 세포는 3 popluations로 구분됩니다 : CD14부정적인 림프구 (3) 모든 CD14 음성 세포 (IV), 비 림프구 (V). B) CD14 부정적인 림프구는 CD4 + T 세포 (바이올렛), CD8 + T 세포 (VII), B 세포 (VIII), CD56 밝은 NK 세포 (IX), CD56 희미 NK 세포 (X) 및 CD56 부정적인 NK 세포를 구별 할 게이트 아르 (사이). C) 모든 CD14 음성 세포는 골수 양 (XII) 및 plasmacytoid (XIII) 수지상 세포를 구별 할 수 출입을 금지합니다. D) 비 lympocytes은 비 고전 (XIV), 중급 (XV), 그리고 클래식 (XVI) 단핵 세포를 구별 할 수 출입을 금지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 1 (예를 들어, NKT 세포 나 호중구)에 표시되지 않습니다보다 구체적인 셀 집합은 우리가 제시 패널을 사용하여 구별 할 수 있으며, 게이팅 스키마는 확장 또는 특정 학습 요구를 충족하도록 수정할 수 있습니다. 표시 특정 게이팅 단계는이 방법의 특징이다. 특히 메모, 포함 게이트 및제외 게이트는 Trucount 구슬 주위에 그려 서로의 상단에 위치, 계산을위한 게이트 구슬을 한, 하나는 세포 분석 (그림 1A)에서 비즈를 제외 할 수 있습니다. 사람들이 CD45 표현과 사이드 분산은 (그림 1A) 종종 필요가 있습니다를 사용하여 앞으로 분산과 측면 산란, 게이팅 셀에게이 말초 혈 mononuclear 세포에로도, 때문에 림프구, 단핵 세포, 그리고 과립 성 백혈구는 쉽게 전체 혈액에 구별되지 않습니다. CD45과 측면 분산을 사용하여 림프구와 단핵 세포 분리 할 수 없습니다 오염 과립 성 백혈구가 (원) 높은 CD16 표현 (그림 1C와 그림 1D)에 의해 일부 플롯에서 구별됩니다. 오염 과립 성 백혈구의 수는 일반적으로 작고, 그들은 단핵 세포와 NK 세포 게이팅을 방해하지 않습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 보고서에서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 신선한 전체 혈액의 백혈구 인구를 열거위한 구슬 기반의 방법을 제시하고 중앙 샘플 분석 multicenter 임상 시험에서의 사용에 대한 매개 변수가 필요 다룹니다. 이 방법은 토대로 및 BD Trucount 프로토콜을 최적화 multicenter 임상 실험 환경에서의 신뢰성 사용할 수 있습니다. 착색 분석은 간단하다하고 가능한 혈액 처리 연구실 기술자가 수행 할 및 분석을위한 중앙 검정 실험실에 샘플을 동결하고 배송하기 위해 만들어 수행 할 수있는 약 45 분 정도 소요됩니다. 분석은 시간과 비용이 많이 PBMC 처리의 필요성을 제거하고 표준 phenotyping의 assays보다 훨씬 적은 양을 사용하여 전체 혈액의 약 100 μl가 필요합니다. 또한, 신선한 전체 혈액을 사용하여,이 분석은보다 정확하게 세포의 생체 상태를 묘사 및 일부 세포 유형에 관찰 cryopreservation의 해로운 효과를 제거S 1-3. 이 염색 방법은 세포 농도...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 절대 계산 튜브를 Trucount </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> 10X FACS는 솔루션을 Lysing </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> 절연 카테고리 B &amp; 면제 운송 시스템, </td><td> SAF-T-박 </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 단클론 항체 AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> 3 번 CD FITC 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCp - 사 5.5 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 알렉사 형석 700 단클론 antibo마구 </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR ECD 단클론 항체 </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 단클론 항체 v450 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 단클론 항체 </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

전체 혈액 phenotyping 분석을 사용하여 multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

말초 혈 백혈구의 Cryopreservation 널리 임상 실험에 면역 반응 평가를위한 세포를 보존하기 위해 사용하고 면역 평가의 용이성 및 표준화를위한 많은 장점을 제공하지만,이 과정의 해로운 효과는 같은 과립 성 백혈구와 같은 일부 세포 집합, B 세포에 관찰 된 수 있습니다 , 1-3 및 수지상 세포. 신선한 백혈구를 시금하면 세포의 생체 상태에서의보다 정확한 사진을 제공하지만, 종종 큰 임상 시험의 맥락에서 수행 할 수 어렵습니다. 신선한 세포 assays은 시간이 오래 걸릴 경우, 자신의 응용 프로그램으로 인해 실험실 직원의 필요한 노동 시간에 비현실적 일 수 자원 봉사 약속과 시간대에 의존하고. 또한, 재판이 여러 센터에서 실시하는 경우, assays을 수행하기 위해 필요한 자원과 훈련 연구소는 임상 사이트에 충분한 가까이에 위치 할 수 없습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 devel이예와 같은 assays보다 더 강력한 세포 유형 특정 정보를하였으며, 표현형과 말초 혈 내의 주요 백혈구 인구를 열거, Trucount 튜브 (산호세, CA Becton 디킨슨)와 함께 사용할 수있는 11 색 항체 염색법 패널을 oped 완전한 혈액 카운트 (CBC) 또는 몇 세포 유형에 얼룩 Trucount 관을위한 상용 가능한 패널 assays. 착색 절차는 간단합니다, 신선한 전체 혈액의 약 100 μl가 필요하고 가능한 표준 혈액 처리 연구소가 수행 할 수있게 약 45 분 정도 소요됩니다. 그것은 BD Trucount 튜브 기술 데이터 시트 (에서 적응 <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">버전 2,010분의 8</a> ). 착색 항체 칵테일은 중앙 검정 실험실에서 대량으로 사전에 준비 사이트 처리 실험실로 배송 될 수 있습니다. 스테인드 튜브가 해결 될 수 있습니다및 다색의 유동 세포 계측법 분석을위한 중앙 분석 실험실에 배송을 위해 냉동. 이 착색 패널에서 생성 된 데이터는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 백혈구 농도의 변화를 추적 할 쉽게 더 관심의 특정 세포 유형의 활성화 상태를 평가하기 위해 개발 될 수 사용할 수 있습니다. 이 보고서에서 우리는 신선한 전체 혈액 및 multicenter 임상 실험을 지원하는 중앙 검정 실험실에서 이러한 스테인드 샘플을 분석하는 단계에 착색을 수행 할 혈액 처리 연구실 기술자가 사용하는 절차를 보여줍니다. 비디오 정보는 HIV 백신 평가판 네트워크 (HVTN)에 임상 시험 혈액 추첨의 컨텍스트에서 수행되기 때문에 절차.

이 보고서에서, 우리는 주요 타고난 및 적응 백혈구 인구를 열거하는 신선한 전체 혈액에서 수행 phenotyping 분석의 착색 및 분석 단계를 보여줍니다. 우리는 multicenter 임상 실험의 맥락에서이 절차를 수행하기위한 고려 사항을 강조.

전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

말초혈액 백혈구의 냉동 보존은 임상 시험에서 면역 반응 평가를 위해 세포를 보존하는 데 널리 사용되며, 많은...

이 영상은 다기관 임상 시험에서 중앙 실험실 분석을 위해 신선한 전혈을 염색하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 Fred Hutchinson Cancer Research Center의 HIV 백신 시험 네트워크(HIV Vaccine Trials Network)에서 개발되었습니다. 이 과정에서는 Becton Dickenson biosciences 사의 tru count 튜브를 사용하며, 각 튜브에는 샘플 준비 과정에서 용해되어 정해진 수의 형광 비드를 방출하는 동결 건조 펠릿이 포함되어 있습니다. 서로 다른 세포군에 특이적인 표면 마커를 염색하기 위해 형광 항체가 사용됩니다.유세포 분석 중에 이러한 서로 다른 세포 집단의 수를 형광 비드 수와 비교할 수 있으며, 중재 조치와 관련하여 전혈 내 다양한 백혈구 집단의 절대 농도를 시간에 따라 추적할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 HIV 백신 임상시험 네트워크(HIV Vaccine Trials Network)의 스태프 사이언티스트 에리카 앤더슨 니산(Erica Anderson Nissan)입니다. 지금부터 보실 절차는 저희가 다기관 임상시험에서 사용하기 위해 개발한 방법입니다.본 실험에서 혈액 처리 실험실 기술자는 신선한 전혈 시료를 받아 형광 표지 항체로 염색한 후, 유세포 분석기(flow cytometer)로 분석이 가능한 중앙 실험실로 시료를 운송합니다. 신선한 전혈은 비용 및 실행 가능성 문제로 인해 임상 시험 환경에서는 분석되지 않는 경우가 많으나, 본 연구팀은 말초혈액 내 주요 백혈구군을 식별할 수 있는 단일 항체 염색 패널을 개발하였습니다. 이러한 세포군에 대한 염색은 45분 이내에 완료되므로 HVTN의 임상 시험에 적용하는 것이 가능합니다. 현재 본 연구팀은 이 패널을 사용하여 HIV 후보 백신 접종 후 발생하는 초기 반응을 파악하고 있으며, 해당 PI 패널은 개별 연구자의 관심 세포형에 맞춰 추가로 수정하여 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 본 내용이 향후 연구에 도움이 되기를 바랍니다.표 1은 말초 혈액 내의 주요 백혈구 집단을 표현형 분석 및 수치화하기 위해 개발된 11색 항체 염색 패널을 보여줍니다. 각 사이트 간의 일관성을 보장하고, 임상 시험 샘플을 염색하기 전에 대조군 혈액 채취분으로 칵테일을 테스트할 수 있도록 항체 칵테일은 중앙 분석실에서 제작하여 처리 실험실로 발송합니다. 각 형광 결합 항체는 개별적으로 적정하며, 이후 적절한 적정 농도를 사용하여 항체들을 2% heat 및 activated fetal bovine serum이 포함된 delcos PBS flow wash buffer가 들어있는 단일 혼합물로 결합합니다.항체 칵테일에는 배치 번호와 유효 기간이 표시되어 있으며, 운송 중 4°C의 온도를 유지하는 포장 시스템을 통해 중앙 분석 실험실에서 처리 실험실로 운송됩니다. 수령 후, 항체 염색 패널은 암소의 4°C에서 최대 8주 동안 보관할 수 있습니다. 염색 후에는 BD fax slicing solution을 사용하여 백혈구를 보존하면서 적혈구를 용해하고 항체 염색 상태를 고정합니다.해당 용액은 제조사로부터 10배 농도로 수령하며, 중앙 분석실에서 탈이온수로 1:10으로 희석합니다. 희석된 용액에는 로트 번호와 유효 기간을 표시하며, 수령 후 상온 상태로 처리 실험실로 운송합니다. Fax lacing solution은 혈액 채취 및 true count 염색 전 15~30°C의 실온에서 보관합니다.처리 실험실은 중앙 분석 실험실로부터 모든 적절한 시약을 수령했는지 확인해야 합니다. 여기에는 BD TRU count tube, 혼합 항체 염색 패널 및 1 x fax 라이선스 용액이 포함됩니다. HVTN은 각 샘플에 대한 모든 관련 정보를 기록하기 위해 실험실 데이터 관리 시스템을 활용합니다.고유 식별 코드가 인쇄된 라벨을 true count 튜브에 부착합니다. 전체 과정 동안 검체를 추적하기 위해, 염색할 샘플을 식별할 수 있도록 크라이오 바이알에 라벨을 부착합니다. 여기에는 일반적으로 환자 또는 자원봉사자 식별자, 방문 식별자 및 혈액 채취 날짜가 포함됩니다. 무균법을 사용하여 필요한 양의 혈액을 라벨이 부착된 크라이오 바이알에 분주합니다.염색에 사용되는 혈액의 양은 사용되는 염색 패널에 따라 다르지만, 일반적으로 패널당 50 또는 100 µL입니다. 그 후 염색 전까지 크라이오 바이알을 상온에서 최대 4시간 동안 보관할 수 있습니다. 남은 혈액으로는 시간 민감성이 더 높은 절차들을 수행합니다.튜브 바닥에 비드 펠렛(bead pellet)이 온전하게 있는지 확인하고 TruCount 튜브에 라벨을 부착하십시오. 관련 검체 정보와 함께 모든 시약의 로트 번호와 유효 기간을 기록하십시오. 워크시트를 사용하면 임상 시험 전반에 걸쳐 이러한 정보를 추적하는 데 유용합니다.tru count tube의 비드 수(bead count number)와 로트 번호(lot number)는 tru count tube 포장지의 전면에서 확인할 수 있습니다. tru Count 염색 과정을 시작하기 전, 생물안전작업대(biological safety cabinet) 내에 모든 재료와 시약이 준비되었는지 확인하십시오. 준비물로는 tru count tube로 표시된 혈액 분주액, combined antibody staining panel tube, 1 x fax lacing solution, 200 µL 및 1000 µL 마이크로 피펫과 피펫 팁, 알루미늄 호일, 실험실용 랩, 그리고 염색 후 사용될 타이머가 포함됩니다.염색된 검체 박스도 필요하지만, 이는 후드 내에 있을 필요는 없습니다. 사용할 혈액과 항체의 양은 패널로 구별되는 세포의 종류와 적절한 분석에 필요한 세포 수에 따라 달라집니다. 각 패널은 대조군 샘플에서 테스트하여 염색에 최적화된 혈액량을 결정하며, 항체의 사용량은 이 비디오에 표시된 패널에 사용된 혈액량과 동일합니다.피펫팅 전 100 µL의 혈액과 100 µL의 항체를 준비합니다. 튜브를 여러 번 부드럽게 반전시켜 혈액을 혼합하고, 피펫으로 여러 번 부드럽게 흡입 및 배출을 반복합니다. 이는 혈액이 충분히 혼합되었는지 다시 한번 확인하기 위함입니다.그다음 역피펫팅 방식을 사용하여 분주액의 전혈을 tru count 튜브의 금속 리테이너 바로 윗부분에 정확히 분주합니다. 튜브 벽면을 따라 혈액이 번지지 않도록 주의하십시오. 각 tru count 튜브를 처리할 때마다 피펫 팁을 교체하십시오.이제 피펫팅 전 항체 염색 패널로 혈액을 염색할 차례입니다. 염색 패널을 가볍게 여러 번 피펫팅하여 섞어줍니다. true count 튜브에 담긴 혈액에 항체 혼합물 100 µL를 첨가합니다.이 단계에서 리버스 파이펫팅을 하지 마십시오. 귀중한 시약을 낭비하게 됩니다. 튜브 캡을 닫고 약 15초 동안 낮은 속도로 볼텍싱하여 혼합하십시오. 비드 펠렛이 완전히 용해되었는지 확인하십시오.튜브를 호일로 감싸고 혈액을 15분 동안 염색하도록 타이머를 설정합니다. 필요한 1x fax slicing solution의 양은 분석에 사용된 혈액 양의 9배이므로, 이 예시에서는 900 µL의 1x fax slicing solution을 사용합니다. 15분간의 배양 후, 염색된 혈액에 900 µL의 1x fax slicing solution을 추가하여 염색을 고정하고 적혈구를 용해합니다.이 단계에서는 리버스 피펫팅이 필요하지 않습니다. 튜브 캡을 닫고 약 15초 동안 저속으로 볼텍싱하여 혼합합니다. 캡을 잠금 위치까지 단단히 눌러 밀봉합니다.실험실용 필름을 사용하십시오. 튜브를 암실 상자에 보관하거나 호일로 완전히 감싸 -65°C에서 -95°C로 유지하여 중앙 분석실로 운송될 때까지 보관하십시오. 현재까지의 테스트 결과, 해당 온도에서 샘플은 최대 4주 동안 안정적인 것으로 나타났으며, 염색 샘플은 국제항공운송협회(IATA) 규정에 따라 카테고리 B 생물학적 물질로 운송해야 합니다.HVTN 규정에 따라 샘플은 이러한 요구 사항을 충족하도록 특별히 설계된 Safety Pack Inc.의 단열 운송 시스템을 사용하여 가공 실험실에서 중앙 분석 실험실로 매주 운송됩니다. 이 시스템을 사용할 때는 내부 갈색 상자를 스티로폼 상자 안에 넣고, 상자가 움직이지 않도록 홈에 고정하십시오. 상자 내부를 드라이아이스로 완전히 채운 후, 상자가 냉각될 수 있도록 5~10분 동안 기다리십시오.운송을 위해 검체를 준비하려면, 각 튜브와 호일을 완전히 감싼 후 염색된 검체 상자에 넣으십시오. 누출 방지 폴리백에 흡수제와 함께 염색된 검체 상자를 넣으십시오. 백 내부의 과잉 공기를 제거하고 단단히 밀봉하십시오.누수 방지 폴리백을 Tyvek 백 안에 넣습니다. 이때 밀봉하기 전 백 안의 공기를 모두 제거하십시오. 시료 패키지를 내부 갈색 상자에 넣고 스티로폼 상자의 덮개를 단단히 닫습니다.배송 박스를 단단히 테이프로 밀봉하고 적절한 드라이아이스 표시와 함께 생물학적 물질 B군으로 배송하십시오. 다기관 임상 시험 시 IATA PI 650 지침을 준수하십시오. 단기 보관, 운송 및 장기 보관 단계 전반에 걸쳐 검체를 추적하는 것이 중요합니다.HVTN에서 사용하는 데이터 관리 시스템을 통해 운송 명세서를 작성할 수 있으며, 이를 샘플이 보관 및 분석될 중앙 분석실의 검체 데이터베이스로 가져올 수 있습니다. 이를 통해 샘플의 발송 및 수령 시점, 최종 보관 위치 및 반출 시점에 대한 기록이 생성됩니다. 분석을 위해, 염색 샘플을 냉동고에서 꺼내 암상자 안에서 실온으로 해동하십시오.유세포 분석기로 수집하기 최대 1시간 전까지 준비하십시오. 두 개 이상의 샘플에서 데이터를 수집하는 경우, 각 튜브가 상온에 1시간 이상 방치되지 않도록 해동 시간을 조절하십시오. 각 샘플은 BD LSR II와 같이 적절한 필터가 장착된 4-레이저 유세포 분석기를 사용하여 수집해야 합니다. 기기에서 요구하는 경우, 데이터 수집을 위해 표준 분석기 보정 및 형광 보정 방법을 사용하십시오. 임계값을 설정하려면, am cyan 채널의 임계값을 가능한 최저로 설정하십시오. 유세포 분석기에 로딩하기 전 샘플 튜브를 5초 동안 볼텍싱하십시오.Cytometer tru count beads는 많은 채널에서 강한 형광을 나타냅니다. 데이터 수집 중에 강한 double positive를 보이는 집단을 찾아 beads 영역을 게이팅하십시오. PE SCI five 및 PC의 경우, beads와 세포를 가장 쉽게 구별할 수 있는 두 가지 색상은 장비에 따라 다를 수 있습니다.Tru count bead 게이트를 중단 게이트로 설정하고 최소 20,000개의 비드가 수집될 때까지 데이터를 기록하십시오. FlowJo와 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하십시오. 이제 대표 대조군 혈액 채취 데이터에서 얻은 주요 백혈구군 분석에 활용된 게이팅 전략을 살펴보겠습니다.해당 패널을 사용하여 NKT 세포나 호중구와 같은 더 구체적인 세포 하위 집합을 구분할 수도 있지만, 본 예제에서는 이를 보여주지 않습니다. 먼저, tru count beads 주위에 포함 게이트와 제외 게이트를 설정하고 이를 서로 겹쳐 배치하여, 하나는 계수를 위한 비드 추출용으로, 다른 하나는 세포 분석에서 비드를 제외하기 위한 용도로 사용합니다. 그다음, 비드가 제외된 세포 데이터에서 전방 산란광 높이(forward scatter height) 대 전방 산란광 면적(forward scatter area)을 이용하여 단일 세포만 포함하도록 게이팅합니다.이 게이트는 작은 부스러기 또한 제외합니다. 그 다음 CD 45 양성 세포를 게이트로 지정하여, 측방 산란(side scatter)을 이용해 과립구와 림프구 및 단핵구를 분리합니다. 이어서 CD 14와 측방 산란을 사용하여 림프구와 단핵구를 세 가지 서로 다른 그룹으로 분리합니다.여기에는 CD 14 음성 림프구, 모든 CD 14 음성 세포 및 비림프구가 포함되며, CD 14 음성 림프구 게이트 세포는 먼저 세 그룹, 즉 CD 3 양성 CD 19 음성, CD 3 음성 CD 19 양성, 그리고 CD 3 음성 CD 19 음성 그룹으로 나뉩니다. CD 3 양성 CD 19 음성 게이트에서 T 세포가 게이팅되며, CD 56 양성 및 CD 16 양성 세포를 제외한 후 CD 4 양성 및 CD 8 양성 T 세포를 구분할 수 있습니다. B 세포는 CD 56 양성 및 CD 16 양성 세포를 제외한 후 CD 3 음성 CD 19 양성 게이트에서 게이팅되며, NK 세포는 CD 3 음성 CD 19 음성 게이트에서 게이팅됩니다.CD 11 C 및 CD 4를 사용하여 오염 가능성이 있는 단핵구(monocytes)를 제외한 후, NK 세포를 CD 56 bright, CD 56 dim 및 CD 56 negative 군집으로 나눕니다. 수지상 세포 군집을 구별하기 위해, 모든 CD 14 negative 세포에서 CD 3 positive, CD 19 positive, CD 56 positive 및 CD 16 positive 세포를 제외하도록 게이팅합니다. 그 후 HLA-DR positive 세포를 게이팅하며, 이들의 CD 11 C 및 CD 1 23 발현 정도에 따라 골수성 수지상 세포(myeloid dendritic cells)와 형질세포양 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cells)를 구별할 수 있습니다.마지막으로, 비림프구 게이트에서 잠재적인 오염 세포인 CD 56 양성 CD 3 양성 및 CD 19 양성 세포를 제외한 후 단핵구 서브셋을 게이팅합니다. 비전형(Non-classical), 중간(intermediate) 및 전형(classical) 단핵구는 CD 16 및 CD 14 발현을 기준으로 구분합니다. 관심 집단의 게이팅이 완료되면 농도를 계산할 수 있습니다.비드 게이트 내의 이벤트 수를 튜브에 원래 들어있던 총 비드 수와 비교하면 수집된 시료의 비율을 결정할 수 있으며, 이를 통해 절대 농도를 산출할 수 있습니다. 각 세포 집단당 마이크로리터당 세포 수를 구하는 데 여기 제시된 식을 사용할 수 있습니다.본 영상에서는 혈액 처리 실험실 기술자가 신선한 전혈에 염색을 수행하는 절차와, 중앙 분석 실험실에서 이러한 염색 샘플을 분석하는 단계를 시연하였습니다. 다기관 임상 시험의 맥락에서, 본 분석법은 간단하고 소요 시간이 상대적으로 짧아, 혈액 처리 실험실 기술자가 직접 수행한 후 샘플을 냉동하여 분석을 위해 필수 분석 실험실로 운송하는 것이 가능하다는 것을 입증하였습니다. 정확하고 일관된 결과를 얻기 위한 핵심은 프로토콜의 중요한 단계들을 세심하게 표준화하고, 발견된 모든 이상 징후가 그 원인까지 추적 가능하도록 모든 단계를 기록하는 문서화 시스템을 활용하는 것입니다.이 염색 패널에서 생성된 데이터는 시간에 따른 백혈구 농도 변화를 추적하는 데 사용할 수 있으며, 관심 있는 특정 세포 유형의 활성 상태를 평가하도록 쉽게 추가 개발될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

자동 microfluidic 장치는 세포 손실없이 고품질의 샘플의 절연을 보장 적혈구 용해를 통해 말초 혈액에서 nucleated 세포 농축을 순환하기 위해 개발되었습니다.

Nucleated 셀을 순환의 강화를위한 자동 Microfluidic 혈액 용해 프로토콜

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Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

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여기 선물이 monocyte 하위 집합 전체 혈액 cytometry에 의해 특성화에 대 한 프로토콜. 이 하위 게이트 그들의 표현의 표면 마커를 평가 하는 방법을 설명 하 고 (염증 성) M1 및 M2 마커 (염증)의 식 평가의 예를 포함 됩니다.

전체 혈액에 의해 인간 Monocyte 하위 집합의 Flow Cytometry 분석

이 프로토콜은 번역 바이오마커 분석에 사용될 수 있는 임상 시험 현장에서 고품질 PBMC 및 플라즈마 바이오샘플의 임상 구현 가능한 제제를 상세히 설명합니다.

바이오마커 분석을 위한 임상 시험 현장에서 단하나 혈액 무승부에서 말초 혈액 단핵 세포 펠릿 및 플라즈마의 준비

POCT 카드 기반 백혈구 분석기를 사용하여 말초 혈액 백혈구를 측정하는 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 동일한 혈액 샘플을 두 개의 자동화된 혈액학 분석기에 의해 테스트하여 결과의 일관성과 정확성을 평가했습니다. 결과는 평가된 분석기가 기준 시스템과 양호한 상관관계를 갖는다는 것을 보여주었다.

말초 혈액 백혈구 측정을 위한 POS(Point-of-Care) 테스트 분석기 평가

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

배우세요 전체 혈액 표현형 분석을 통한 주요 말초 혈 백혈구 인구 열거 방법입니다. 다중 중심 임상 시험에서 유동 세포측정법을 활용하여 면역 반응을 추적하고 정확한 세포 농도 측정이 가능합니다.

전체 혈액 Phenotyping 분석을 사용하여 Multicenter 임상 시험을위한 주요 말초 혈 백혈구 인구의 열거

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