음향 액적 기화 및 버블이 강화 된 초음파로 인한 박리에 대한 좁은 크기 분포와 위상 - 교대 Nanoemulsions의 합성

다음 실험의 전반적인 목표는 기화되어 생성된 지질 코팅 나노 에멀전 버블이 초음파 매개 절제술에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 알부민이 함유된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 전체에 지질 코팅 나노 에멀전을 분산시킵니다. 두 번째 단계로, 집속 초음파 변환기가 하이드로젤 내로 짧은 고진폭 펄스를 송신하여 초점 부위의 나노 에멀전을 국소적으로 기화시킵니다. 다음으로, 생성된 버블이 초음파에 의해 지속적으로 구동되며, 버블에서 방사된 음향 에너지가 하이드로젤에 빠르게 흡수되어 초음파 매개 가열 속도가 가속화됩니다.

결과에 따르면 기포의 존재는 하이드로젤을 단백질 변성 임계 온도 이상으로 가열하는 데 필요한 시간과 에너지를 획기적으로 감소시켜, 더 빠르고 효율적인 초음파 매개 절제를 가능하게 합니다. 위상 변화 나노 에멀젼의 크기는 압력 임계값을 결정하는 결정적인 요인입니다. 음향 기화를 위해, 우리는 좁은 크기 분포와 명확한 기화 임계값을 가진 안정적인 위상 변화 나노 에멀젼을 제조하는 프로토콜과 초음파 매질 절제에 미치는 영향을 평가하기 위한 인비트로(in vitro) 시스템을 개발했습니다.

in vitro 시스템이 설명되어 있지만, 나노 에멀젼은 음향학적으로 기화될 수 있는 입자를 통해 혈관 외 조직 및 고형암을 관찰할 수 있도록 설계되었습니다. 형성된 기포는 이후 암 관리의 진단 또는 치료 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 상전이 나노 에멀젼(PSNE) 조제 절차를 시작하려면, 먼저 지질을 함께 혼합하여 DPPC 11 mg과 DSPE 1.7 mg을 용해하십시오.

유리 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름에 녹인 Peg 2000을 넣습니다. 둥근 바닥 플라스크를 화학 흄 후드 내의 50 °C 항온수조에 넣고, 아르곤 가스 흐름을 이용하여 유기 용매를 증발시킵니다. 건조한 지질 박막을 형성하기 위해, 플라스크를 데시케이터에 넣고 하룻밤 동안 진공 상태로 두어 다음 날 아침에 지질 박막을 건조시킵니다.

5.5 milliliters의 PBS로 지질 필름을 재수화합니다. 지질 필름이 용해될 때까지 45 degree Celsius 항온수조에서 용액을 가열합니다. 지질 용액을 7 milliliter 바이알로 주기적으로 옮긴 후, 프로브 초음파 분쇄기를 사용하여 20% amplitude에서 2분 동안 초음파 처리합니다.

용액을 2.5 milliliters씩 두 개의 바이알에 나누어 담습니다. 남은 0.5 milliliters는 폐기합니다. 각 바이알에 2.5 milliliters의 PBS를 추가한 다음, 두 바이알을 0 °C 얼음물 배스에 넣습니다.

각 바이알에 50 µL의 doca fluoro pentane(DDFP)을 첨가하십시오. DDFP 지질 혼합물을 얼음-물 중탕에서 초음파 처리하는 것이 이 절차에서 가장 중요한 부분입니다.

얼음물 배스는 액체 퍼플루오로카본의 증발을 방지하기 위해 사용됩니다. 이 과정 동안, 25% 진폭 펄스 모드, 총 60초의 설정으로 얼음물 배스 내의 각 바이알을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, PSNE 용액을 20밀리리터 신틸레이션 바이알로 옮기며, 각 바이알에 5밀리리터의 PBS를 첨가하여 바이알당 최종 부피가 10밀리리터가 되도록 합니다.

제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립하여 압출기를 프라이밍합니다. 탈이온수 10 milliliters를 상단 시료 포트에 피펫으로 넣습니다. 개구부를 캡으로 닫고 벤트 밸브를 조입니다.

질소 가스 라인을 천천히 열어 압력을 높여 샘플이 멤브레인을 통과하도록 합니다. 배출 튜브에서 샘플을 수집하고, 좁은 크기 분포를 얻기 위해 PSNE를 100 nanometer 또는 200 nanometer 필터로 16회 압출합니다. PSNE가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 준비하여 이 절차를 시작하십시오.

먼저, 2.4g의 BSA 분말을 10mL의 탈이온수에 녹여 24% 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 용액을 준비합니다. 다음으로, 1g의 PS 분말을 10mL의 탈이온수에 희석하여 10% 과황산암모늄(ammonium per sulfate) 또는 PS 용액을 준비합니다. 플라스틱 몰드에 아크릴아마이드 용액 2.1mL, Tris 완충액 1.2mL, 10% PS 용액 0.1mL, 24% BSA 용액 4.5mL, 탈이온수 3.6mL 순으로 이 시약들을 혼합합니다. 용액을 항온수조에서 40°C로 가열한 후, 진공 상태에서 1시간 동안 두어 액체 속의 가스를 제거합니다.

이는 한 시간 후 하이드로겔 내부에 원치 않는 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 필요합니다. 진공 상태에서 꺼낸 후, 480 µL의 PSNE 현탁액을 추가하고 플라스틱 챔버를 부드럽게 돌려 충분히 혼합합니다. 화학 흄 후드 내에서, 아크릴아마이드를 중합시키기 위해 12 µL의 tetraethyl ethylene diamine 또는 TEMED를 첨가하고, 챔버를 12 °C 워터배스에 2시간 동안 둡니다.

중합 반응은 발열 반응이므로, 중합 중 PSE의 기화를 방지하기 위해 냉각조가 필요합니다. 아크릴아마이드가 중합되면, DGA 탈이온수가 채워진 아크릴 탱크 내에 집중 전력 트랜스듀서와 이미징 프로브를 배치하여 이미징 평면이 트랜스듀서의 초점 부피와 겹치도록 합니다. 다음으로, PSNE가 충전된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 전력 트랜스듀서의 초점에 위치시키고, 짧은 음향 펄스로 하이드로젤 내의 PSNE를 기화시킨 후, 기포 강화 절제를 위해 15초 동안 연속파를 조사합니다.

BSA가 변성됨에 따라, 진단용 초음파 스캐너를 이용한 모니터링 과정에서 초음파 흡수와 열 발생으로 인해 하이드로겔이 불투명해지며 기화 및 기포 형성이 일어납니다. 이 예시 이미지에서 화살표는 PSNE 기화에 의해 기포 구름이 형성된 초점 영역을 나타냅니다. PSNE를 높이지 않은 채 하이드로겔의 새로운 위치에서 음향 노출을 반복하여 절제 시간과 부피를 비교하십시오.

이 프로토콜을 통해 좁은 크기 분포를 가진 지질 코팅 퍼플루오로카본 액적을 제조할 수 있습니다. 여기에는 100 및 200 나노미터 필터를 사용하여 압출한 PSNE의 동적 광산란 측정 크기 분포가 나타나 있습니다. 세로축의 단위는 샘플의 전체 산란광 강도 대비 특정 크기 입자에서 발생하는 산란광의 강도를 기준으로 합니다.

100 및 200 nm 필터로 압출한 후 1일 및 7일 시점에서 동적 광산란법을 사용하여 PSNE의 평균 직경과 표준 편차를 측정한 결과, PSNE가 최소 일주일 동안 안정적임이 입증되었습니다. 이 그림은 기화 전후 PSNE의 B 모드 영상을 보여줍니다. 폴리아크릴아마이드 하이드로젤에서 화살표는 PSNE 기화로 인해 버블 클라우드가 형성된 초점 영역을 나타냅니다.

이 이미지들은 고강도 집속 초음파(High Intensity Focused Ultrasound, Hy Fu)를 이용한 기화 및 소니케이션 전후의 알부민과 PSNE가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤의 모습입니다. 15초간의 Hy Fu 매개 가열을 통해 병변이 형성되었습니다. 병변의 비대칭적 형태는 초음파 경로 내에 존재하는 기포 구름으로 인해 발생하는 초점 전 가열(pre focal heating)의 결과입니다. 이러한 초점 전 가열과 기포 산란으로 인한 병변 형성은 기포 발생 후 투과 음향 전력을 줄임으로써 최소화할 수 있습니다.

안정적인 상전이 나노 에멀젼을 제조하는 이 방법은 초음파 매개 치료 분야의 연구자들이 고형암에서 기포 강화 HIFU 절제술을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 좁은 크기 분포를 가진 안정적인 상전이 나노 에멀젼을 제조하는 방법과 기포 핵 생성 및 강화된 초음파 매개 절제술을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.