Name: 음향 액적 기화 및 버블이 강화 된 초음파로 인한 박리에 대한 좁은 크기 분포와 위상 - 교대 Nanoemulsions의 합성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 학습하세요 위상-전환 나노유화액을 이용한 초음파 매개 종양 절제술. 안정적인 PSNE 제조 프로토콜과 좁은 입자 크기 분포를 통해 기포 생성이 열 치료 효율을 높이는 방법을 탐구합니다.

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이 작품은 BU / CIMIT 응용 의료 공학 Predoctoral 휄로 십, 공학 참여 연구 개시 기금 (BRIGE)를 확대 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 국립 보건원 (R21EB0094930)에 의해 지원되었다.

1. 단계 - 교대 Nanoemulsion의 준비 (PSNE) <ol><li> 11 MG DPPC와 클로로포름의 1.68 MG DSPE-PEG2000를 해산 </li><li> 유리 둥근 바닥 플라스크에 드라이 지질 필름을 형성하기 위해 유기 용매를 증발 </li><li> 밤 지질 필름을 Dessicate </li><li> 인산 버퍼 생리 (PBS)의 5.5 ML과 지질 필름을 Rehydrate </li><li> 45 ° C의 물을 욕조에 열 솔루션은 지질이 영화는 정기적으로 vortexing, 해체 할 때까지 </li><li> 7 ML의 유리 병에 지질 솔루션을 전송 </li><li> 20 % 진폭에서 2 분에 대한 지질 솔루션을 Sonicate </li><li> 2.5 ML의 두 병에 솔루션을 나눈다 각 (나머지 0.5 ML를 삭제) </li><li> 각 유리 병에 2.5 ML PBS를 추가합니다 </li><li> 0 ° C 얼음물에 각 병을 놓고 </li><li> 각 유리 병의 50 μl DDFP을 추가 </li><li> 25 % 진폭, 펄스 모드 (50 초에서 10 초), 시간에 60 초 총 : 다음 설정을 사용하여 얼음물에서 각 병을 Sonicate </li><li> TR20 ML의 섬광 병에 ansfer PSNE 솔루션 </li><li> 10 ML 최종 볼륨의 결과로, 각 유리 병에 5 ML PBS를 추가합니다 </li><li> 제조업체에서 제공 압출기 다음과 같은 지시를 조립 <ol><li> 탈 이온수 각 부분을 씻어 </li><li> 필터 지원 기지의 중심에 스테인레스 스틸 지원 디스크를 놓으십시오 </li><li> 스테인레스 스틸 지원 디스크 상단에있는 스테인리스 스틸 메쉬를 배치 </li><li> 핀셋 사용하여 스테인레스 스틸 메쉬에 압출기 배출 디스크 막 (반짝이는 사이드까지)를 배치 </li><li> 핀셋 사용하여 배수 디스크 막에 압출기 필터 (반짝이는 사이드까지)를 배치 </li><li> 조심스럽게 필터의 작은 O-링을 배치하고 지원 기지 위의 thermobarrel와 압출기의 상단에 배치 </li><li> 부분적으로 첫번째 각 날개 너트를 조여 다음, 완전히 번갈아 방식으로 손으로 날개 너트를 조여 </li><li> 에 압출기를 연결질소 가스 라인 </li><li> 상단 샘플 포트에 압출기, 피펫 10 ML 탈 이온수를 프라임하려면 시작을 한도 및 배기 밸브를 조여 </li><li> 천천히 멤브레인을 통해 샘플을 강제로 압력을 높이기 위해 질소 가스 라인을 열고 출구 튜브에서 샘플을 수집 </li><li> 사용 후, 반대 순서로 분해 탈 이온수와 압출기 부품을 헹구고, 멤브레인 필터와 멤브레인 배수 디스크를 삭제 </li></ol></li><li> 200 nm의 필터를 통해 10 배를 압출의 100 나노 미터 방울 만, 사전 조건 PSNE </li><li> 필터 100 나노 미터 또는 200 nm의를 통해 돌출 PSNE은 16 배 좁은 크기 분포를 얻을 수 </li></ol> 2. PSNE를 포함 Polyacrylamide의 히드로 겔의 작성 <ol><li> 5 ML 탈 이온수에 1.2 g BSA 가루를 diluting하여 24% BSA 솔루션을 준비 </li><li> 한 ML deionized wate에 희석 0.1 g APS 분말로 10 %의 APS 솔루션을 준비연구 </li><li> 다음과 같은 순서로, 2.1 ML의 아크릴 아미드 솔루션, 1.2 ML 트리스 버퍼, 0.1 ML 10 % APS, 4.5 ML 24% BSA 솔루션, 플라스틱 챔버에 3.6 ML 탈 이온수를 섞어 </li><li> 40 열 ° 1 시간에 진공 C 및 장소 </li><li> PSNE 480 μl를 추가하고 철저하게 부드럽게 플라스틱 챔버를 회전하여 섞는다. </li><li> 12 μl TEMED를 추가하고 2 시간에 12 ° C 물 목욕에있는 챔버를 배치 </li></ol> 3. 대표 결과 조직 - 모방의 히드로 겔 유령과 초음파 실험에 대한 설정의 개략도는 그림 1에 표시됩니다. 이 프로토콜은 적어도 일주일 솔루션 안정 좁은 크기 분포와 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울에 결과를 표시합니다. 동적 광 분산 (90Plus 입자 크기 분석기, 브룩 헤이븐 계기, Holtsville, NY)로 측정 크기 분포는 PSNE는 압출 100와 200를 사용하기 위해 그림 2에 표시됩니다나노 필터. 동적 광 산란을 사용하여 측정 시간의 경과에 PSNE 유효 직경은, PSNE 적어도 일주일 안정적임을 입증 표 1에 표시됩니다. polyacrylamide의 히드로 겔의 기화 전후 PSNE의 B-모드 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 또한, 병변은 알부민과 PSNE는 그림 4에 표시됩니다를 포함하는 polyacrylamide의 히드로 겔에 HIFU로 인한 난방의 15 초에 의해 형성. 병변의 비대칭 모양 초음파 경로에 거품 구름의 존재로 인해 발생 prefocal 난방의 결과입니다. 이 전송 음향 전력을 줄임으로써 최소화 할 수 prefocal 난방 시설, 거품의 분산으로 인한 병변 형성에 유의하는 것이 중요합니다. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 조직 - 밈과 초음파 실험에 대한 실험 설정의 개략도hydrogels을 icking. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 크기 100 나노 미터 또는 200 nm의 필터를 통해 압출 PSNE의 배포는 동적 광 분산을 사용하여 측정. 종좌표 축의 단위는 샘플의 총 분산 된 광 강도에 비해 특정 크기의 입자의 분산 된 빛의 강도에 따라 결정됩니다. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. B-모드 이미지 polyacrylamide의 히드로 겔의 PSNE 기화 (A) 이전 및 (b) 후. 화살표가 거품 구름이 PSNE 기화에 의해 형성 된 초점 영역을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig4.jpg" alt="그림 4"/> polyacr의 그림 4. 이미지알부민과 PSNE 포함 ylamide의 히드로 겔는 (a) HIFU로 기화와 sonication 전에하고, (b) 후 초음파 유도 가열의 결과로 병변 형성을 보여줍니다. 초음파 중심 주파수 3.3 MHz의했다. 초음파 신호가 초기 30주기로 구성, 6.4 W 펄스가 PSNE을 날려 버리기 위해, 즉시 W.은 0.77에서 지속적인 초음파의 15 초 다음 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 압출 후 일 </td><td colspan="2"> 200 nm의 필터 압출 </td><td colspan="2"> 100 nm의 필터 압출 </td></tr><tr><td> 디아 의미합니다. (NM) </td><td> 표준. 개발자. (NM) </td><td> 디아 의미합니다. (NM) </td><td> 표준. 개발자. (NM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 182.9 </td><td> 4.9 </td><td> 118.0 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 7 </td> &lt;TD&gt; 177.7 </td><td> 2.5 </td><td> 124.8 </td><td> 3.1 </td></tr></tbody></table> 표 1. 100 nm의 200 nm의 필터를 사용 압출 차례로 7 일의 직경과 PSNE의 표준 편차를 의미합니다.

<ol><li>Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+noninvasive+ultrasound+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI-guided noninvasive ultrasound surgery.</a> Med. Phys. 20, 107-115 (1993).</li>
<li>Baban, D. F., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumour+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of tumour vascular permeability.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Schadlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+accumulation+of+NIR+fluorescent+PEG-PLA+nanoparticles%3A+impact+of+particle+size+and+human+xenograft+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model.</a> ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).</li>
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<li>Giesecke, T., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-mediated+cavitation+thresholds+of+liquid+perfluorocarbon+droplets+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro.</a> Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).</li>
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<li>Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29+5000+to+prolong+the+circulation+time+of+liposomes+depends+on+the+liposome+size+and+is+unfavorable+for+immunoliposome+binding+to+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+polyethyleneglycols+effectively+prolong+the+circulation+time+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes.</a> FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).</li>
<li>Gabizon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+Doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li>
<li>Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+biodistribution+profiles+of+long-circulating+PEG-liposomes+of+various+sizes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits.</a> Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).</li>
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<li>Lafon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+phantom+for+use+in+high-intensity+focused+ultrasound+dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).</li>
</ol>

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높은 강도 집중 초음파 (HIFU)이 열 종양 어블 레이션하기 위해 임상 적으로 사용됩니다. 1 지역화 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하려면 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울은 HIFU에 의해 기화 할 수있는 개발되었습니다. 많은 종양의 vasculature는 인해 빠른 성장을 비정상적으로 새는 것입니다. 따라서 2 나노 입자는 fenestrations을 관통하고 수동적으로 종양 내에 축적 할 수 있으며, 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과로 알려진 과정입니다. 3이 표시되었습니다 그 70와 200 나노 미터 사이의 나노 입자는 종양에서 가장 효율적으로 축적.이 보고서에 설명 된 4 절차는 좁은 크기 분포와 지질 코팅 perfluorocarbon 방울의 안정적인 위상 편이 nanoemulsion (PSNE)를 생산하고 있습니다. 과거에는 polydisperse 크기 PSNE의 분포하지만, 최근의 연구를 사용하여 대부분의 연구는...

<table border="1"><tbody><tr><td> 일반 이름 </td><td> 제조업 자 </td><td> 고양이. 수 </td><td> 전체 이름 / 설명 </td></tr><tr><td> DPPC </td><td> 벤티의 지질, 설화 석고, AL, 미국 </td><td> 850355P </td><td> 1,2 - dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine </td></tr><tr><td> DSPE-PEG2000 </td><td> 벤티의 지질, 설화 석고, AL, 미국 </td><td> 880120P </td><td> 1,2 - distearoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[메 톡시 (폴리에틸렌 글리콜) -2000] (암모니아 염) </td></tr><tr><td> DDFP </td><td> Fluoromed, 라운드 록, TX, USA </td><td> CAS : ​​138495-42-8 </td><td> Dodecafluoropentane (C 5 F 12) </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> P2194 </td><td> 생리 인산 버퍼 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트. 루이, MO, USA </td><td> 372978 </td><td> 클로로포름 </td></tr><tr><td> 아크릴 아미드 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> A9926 </td><td> 40% 19시 1분 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 </td></tr><tr><td> 트리스 버퍼 </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> T2694 </td><td> 1M, 산도 8, trizma 히드로 클로라이드와 trizma 기지 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> A3059 </td><td> 소 혈청 알부민 </td></tr><tr><td> APS </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> A3678 </td><td> 암모늄 persulfate 솔루션 </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO, USA </td><td> 87,689 </td><td> N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylenediamine </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 장비 </td></tr><tr><td> Sonicator (3mm 팁) </TD&gt; <td> Sonics &amp; 자료, 주식회사, 뉴타운, CT, USA </td><td> Vibra-셀 </td><td></td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 온도 피셔 과학, Waltham, MA, USA </td><td> Neslab EX-7 </td><td></td></tr><tr><td> 압출기 </td><td> 북부 지질, 버나비, BC, 캐나다 </td><td> LIPEX </td><td></td></tr><tr><td> 압출기 필터 </td><td> 워트 먼지, Piscataway, NJ, USA </td><td> # 110605와 # 110606을 Nuclepore </td><td></td></tr><tr><td> 압출기 흡수 디스크 </td><td> Sterlitech 공사, 켄트, WA, USA </td><td> # PETEDD25100 </td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 챔버 </td><td> 미국 플라스틱 회사, 리마, OH, USA </td><td> # 55,288, 1 3 / 16 &quot;1 개 16분의 3&quot;X2 16분의 7 &quot; </td><td></td></tr></tbody></table>

음향 액적 기화 및 버블이 강화 된 초음파로 인한 박리에 대한 좁은 크기 분포와 위상 - 교대 nanoemulsions의 합성

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

높은 강도 집중 초음파 (HIFU)는 열 종양 어블 레이션하기 위해 임상 적으로 사용됩니다. 현지화 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하려면 지질 코팅 perfluorocarbon의 방울은 HIFU에 의해 기화 할 수있는 개발되었습니다. 많은 종양의 vasculature는 인해 빠른 성장을 비정상적으로 새는 있으며, 나노 입자는 fenestrations을 관통하고 수동적으로 종양 내에 축적 할 수 있습니다. 따라서 방울의 크기를 조절하는 종양에서 더 축적 될 수 있습니다. 이 보고서에서는 좁은 크기 분포와 위상 편이 nanoemulsion (PSNE)에서 안정 방울의 준비가 설명되어 있습니다. PSNE는 액체 perfluorocarbon의 존재에 지질 솔루션을 sonicating에 의해 합성되었다. 좁은 크기 분포는 100 또는 200 nm의 기공 크기의 필터를 사용하여 PSNE을 여러 번 압출하여 얻은 것입니다. 크기 분포는 동적 광 산란을 사용하여 7 일 동안 측정되었습니다. PolyacPSNE을 포함 rylamide의 hydrogels은 체외 실험에서 준비되었다. hydrogels의 PSNE 방울은 초음파와 지역화 난방 개선 결과 거품과 기화되었습니다. 기화 PSNE 더 빠른 난방이 가능하며 열 절제에 필요한 초음파 강도를 줄일 수 있습니다. 따라서, PSNE는 잠재적으로 HIFU로 인한 열 절제 트리트먼트 치료 결과를 개선, 종양의 열 절제를 강화 할 예정이다.

위상 시프트 nanoemulsions (PSNE)는 지역화 된 난방을 개선하고 종양의 열 절제를 개선하기 위해 높은 강도 집중 초음파를 사용하여 기화 할 수 있습니다. 이 보고서에서는 좁은 크기 분포와 안정 PSNE의 준비가 설명되어 있습니다. 또한, 초음파로 인한 박리에 기화의 PSNE의 영향은 조직 - 모방의 유령에서 증명된다.

음향 액적 기화 및 버블이 강화 된 초음파로 인한 박리에 대한 좁은 크기 분포와 위상 - 교대 Nanoemulsions의 합성

고강도 집속 초음파(HIFU)는 임상적으로 종양을 열적으로 절제하는 데 사용됩니다. 국소 가열을 강화하고 ...에서의 열 절제 효과를 개선하기 위해...

다음 실험의 전반적인 목표는 기화되어 생성된 지질 코팅 나노 에멀전 버블이 초음파 매개 절제술에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 알부민이 함유된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤 전체에 지질 코팅 나노 에멀전을 분산시킵니다. 두 번째 단계로, 집속 초음파 변환기가 하이드로젤 내로 짧은 고진폭 펄스를 송신하여 초점 부위의 나노 에멀전을 국소적으로 기화시킵니다. 다음으로, 생성된 버블이 초음파에 의해 지속적으로 구동되며, 버블에서 방사된 음향 에너지가 하이드로젤에 빠르게 흡수되어 초음파 매개 가열 속도가 가속화됩니다.결과에 따르면 기포의 존재는 하이드로젤을 단백질 변성 임계 온도 이상으로 가열하는 데 필요한 시간과 에너지를 획기적으로 감소시켜, 더 빠르고 효율적인 초음파 매개 절제를 가능하게 합니다. 위상 변화 나노 에멀젼의 크기는 압력 임계값을 결정하는 결정적인 요인입니다. 음향 기화를 위해, 우리는 좁은 크기 분포와 명확한 기화 임계값을 가진 안정적인 위상 변화 나노 에멀젼을 제조하는 프로토콜과 초음파 매질 절제에 미치는 영향을 평가하기 위한 인비트로(in vitro) 시스템을 개발했습니다.in vitro 시스템이 설명되어 있지만, 나노 에멀젼은 음향학적으로 기화될 수 있는 입자를 통해 혈관 외 조직 및 고형암을 관찰할 수 있도록 설계되었습니다. 형성된 기포는 이후 암 관리의 진단 또는 치료 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 상전이 나노 에멀젼(PSNE) 조제 절차를 시작하려면, 먼저 지질을 함께 혼합하여 DPPC 11 mg과 DSPE 1.7 mg을 용해하십시오.유리 둥근 바닥 플라스크에 클로로포름에 녹인 Peg 2000을 넣습니다. 둥근 바닥 플라스크를 화학 흄 후드 내의 50 °C 항온수조에 넣고, 아르곤 가스 흐름을 이용하여 유기 용매를 증발시킵니다. 건조한 지질 박막을 형성하기 위해, 플라스크를 데시케이터에 넣고 하룻밤 동안 진공 상태로 두어 다음 날 아침에 지질 박막을 건조시킵니다.5.5 milliliters의 PBS로 지질 필름을 재수화합니다. 지질 필름이 용해될 때까지 45 degree Celsius 항온수조에서 용액을 가열합니다. 지질 용액을 7 milliliter 바이알로 주기적으로 옮긴 후, 프로브 초음파 분쇄기를 사용하여 20% amplitude에서 2분 동안 초음파 처리합니다.용액을 2.5 milliliters씩 두 개의 바이알에 나누어 담습니다. 남은 0.5 milliliters는 폐기합니다. 각 바이알에 2.5 milliliters의 PBS를 추가한 다음, 두 바이알을 0 °C 얼음물 배스에 넣습니다.각 바이알에 50 µL의 doca fluoro pentane(DDFP)을 첨가하십시오. DDFP 지질 혼합물을 얼음-물 중탕에서 초음파 처리하는 것이 이 절차에서 가장 중요한 부분입니다.얼음물 배스는 액체 퍼플루오로카본의 증발을 방지하기 위해 사용됩니다. 이 과정 동안, 25% 진폭 펄스 모드, 총 60초의 설정으로 얼음물 배스 내의 각 바이알을 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후, PSNE 용액을 20밀리리터 신틸레이션 바이알로 옮기며, 각 바이알에 5밀리리터의 PBS를 첨가하여 바이알당 최종 부피가 10밀리리터가 되도록 합니다.제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립하여 압출기를 프라이밍합니다. 탈이온수 10 milliliters를 상단 시료 포트에 피펫으로 넣습니다. 개구부를 캡으로 닫고 벤트 밸브를 조입니다.질소 가스 라인을 천천히 열어 압력을 높여 샘플이 멤브레인을 통과하도록 합니다. 배출 튜브에서 샘플을 수집하고, 좁은 크기 분포를 얻기 위해 PSNE를 100 nanometer 또는 200 nanometer 필터로 16회 압출합니다. PSNE가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로겔을 준비하여 이 절차를 시작하십시오.먼저, 2.4g의 BSA 분말을 10mL의 탈이온수에 녹여 24% 소혈청 알부민(bovine serum albumin) 또는 BSA 용액을 준비합니다. 다음으로, 1g의 PS 분말을 10mL의 탈이온수에 희석하여 10% 과황산암모늄(ammonium per sulfate) 또는 PS 용액을 준비합니다. 플라스틱 몰드에 아크릴아마이드 용액 2.1mL, Tris 완충액 1.2mL, 10% PS 용액 0.1mL, 24% BSA 용액 4.5mL, 탈이온수 3.6mL 순으로 이 시약들을 혼합합니다. 용액을 항온수조에서 40°C로 가열한 후, 진공 상태에서 1시간 동안 두어 액체 속의 가스를 제거합니다.이는 한 시간 후 하이드로겔 내부에 원치 않는 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 필요합니다. 진공 상태에서 꺼낸 후, 480 µL의 PSNE 현탁액을 추가하고 플라스틱 챔버를 부드럽게 돌려 충분히 혼합합니다. 화학 흄 후드 내에서, 아크릴아마이드를 중합시키기 위해 12 µL의 tetraethyl ethylene diamine 또는 TEMED를 첨가하고, 챔버를 12 °C 워터배스에 2시간 동안 둡니다.중합 반응은 발열 반응이므로, 중합 중 PSE의 기화를 방지하기 위해 냉각조가 필요합니다. 아크릴아마이드가 중합되면, DGA 탈이온수가 채워진 아크릴 탱크 내에 집중 전력 트랜스듀서와 이미징 프로브를 배치하여 이미징 평면이 트랜스듀서의 초점 부피와 겹치도록 합니다. 다음으로, PSNE가 충전된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤을 전력 트랜스듀서의 초점에 위치시키고, 짧은 음향 펄스로 하이드로젤 내의 PSNE를 기화시킨 후, 기포 강화 절제를 위해 15초 동안 연속파를 조사합니다.BSA가 변성됨에 따라, 진단용 초음파 스캐너를 이용한 모니터링 과정에서 초음파 흡수와 열 발생으로 인해 하이드로겔이 불투명해지며 기화 및 기포 형성이 일어납니다. 이 예시 이미지에서 화살표는 PSNE 기화에 의해 기포 구름이 형성된 초점 영역을 나타냅니다. PSNE를 높이지 않은 채 하이드로겔의 새로운 위치에서 음향 노출을 반복하여 절제 시간과 부피를 비교하십시오.이 프로토콜을 통해 좁은 크기 분포를 가진 지질 코팅 퍼플루오로카본 액적을 제조할 수 있습니다. 여기에는 100 및 200 나노미터 필터를 사용하여 압출한 PSNE의 동적 광산란 측정 크기 분포가 나타나 있습니다. 세로축의 단위는 샘플의 전체 산란광 강도 대비 특정 크기 입자에서 발생하는 산란광의 강도를 기준으로 합니다.100 및 200 nm 필터로 압출한 후 1일 및 7일 시점에서 동적 광산란법을 사용하여 PSNE의 평균 직경과 표준 편차를 측정한 결과, PSNE가 최소 일주일 동안 안정적임이 입증되었습니다. 이 그림은 기화 전후 PSNE의 B 모드 영상을 보여줍니다. 폴리아크릴아마이드 하이드로젤에서 화살표는 PSNE 기화로 인해 버블 클라우드가 형성된 초점 영역을 나타냅니다.이 이미지들은 고강도 집속 초음파(High Intensity Focused Ultrasound, Hy Fu)를 이용한 기화 및 소니케이션 전후의 알부민과 PSNE가 포함된 폴리아크릴아마이드 하이드로젤의 모습입니다. 15초간의 Hy Fu 매개 가열을 통해 병변이 형성되었습니다. 병변의 비대칭적 형태는 초음파 경로 내에 존재하는 기포 구름으로 인해 발생하는 초점 전 가열(pre focal heating)의 결과입니다. 이러한 초점 전 가열과 기포 산란으로 인한 병변 형성은 기포 발생 후 투과 음향 전력을 줄임으로써 최소화할 수 있습니다.안정적인 상전이 나노 에멀젼을 제조하는 이 방법은 초음파 매개 치료 분야의 연구자들이 고형암에서 기포 강화 HIFU 절제술을 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 좁은 크기 분포를 가진 안정적인 상전이 나노 에멀젼을 제조하는 방법과 기포 핵 생성 및 강화된 초음파 매개 절제술을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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