Name: 동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 배우세요 설치류 대뇌 피질에서 동시 전기생리학 및 젖산 측정을 위한 수술적 이식법과 광유전학 자극 기법. 실시간 뇌 생화학 및 신경 활동 모니터링으로 수면 연구와 신경과학 분야의 새로운 통찰을 제공합니다.

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국방부 (국방 고급 연구 프로젝트 기관, 젊은 교수 상, 그랜트 번호 N66001-09-1-2117)과 NINDS (R15NS070734)의 지원을받는 연구.

1. 동물의 외과 준비 1. 실험 과목 대뇌 피질 뉴런에있는 파란색 빛에 민감한 양이온 채널, Channelrhodopsin-2를 표현 잭스 스트레인 # 7612) 또는 기타 마우스, B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인 9 마우스를 사용합니다. B6.Cg-TG (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J 유전자 변형 라인의 대뇌 피질에 푸른 빛의 응용 가능성 9,10를 depolarize하고 조치를 받아야 할 Channelrhodopsin-2을 표현 피라미드 뉴런이 발생합니다. 피라미드 세포 활성화의 결과로서, 지역 interneurons가 활성화되며, 잠재적의 변화는 자극 (10)의 사이트 이외의 뉴런에 전달됩니다. , 핫 구슬은 모든 열 저항성 주입 금속 장치 (cannulas, 나사와 와이어) 소독 압력솥 수술 도구와 softpacks (수술 필드 거즈 패드) : 해당 규제 가이드 라인을 준수의 무균 조건 하에서 수술을 수행30 초에, 에탄올에서 10 초 수영과 열 차별적 인 implantable 장치 (광섬유 케이블, 플라스틱 커넥터) 소독, 통조림 공기의 응용 프로그램이 타격을 에탄올 담궈 둔 항목 건조합니다. 2. 마취 Stereotaxic 위치와 해골의 통관 마우스를 마취하는 IMPAC 6 통합 멀티 환자 (뇌려 장비 주식회사) 시스템을 사용합니다. 5%에게 유도를위한 Isoflurane/95 %의 산소와 수술 동안 유지 보수 3 % Isoflurane/97 %의 산소를 사용합니다. 그것은 이불이 온도에서 보관하는 경우 체온을 모니터링 할 필요가 없습니다 37 C.로 설정 순환 물 담요에 동물을 놓으십시오. 3. 주입을 위해 두개골을 준비 두개골의 상단에서 모든 털을 면도를하여 절개 사이트를 준비합니다. 면도 면적은 귀에서 눈에서 두개골의 뒤쪽 끝으로 귀하고 앞 - 뒤로 옆으로 확장해야합니다. 세 consecutiv로 노출 된 피부를 소독betadine의 전자 면봉은 에탄올이 나타납니다. 눈 사이에서 두개골의 뒷면에, 두개골의 상단에 안쪽 절개를합니다. 과산화수소와 멸균 생리 (0.9 % NaCl)으로 두개골을 청소합니다. cauterizing 도구를 사용하여 피를 흘리고을 관리 할 수​​ 있습니다. stereotaxic 좌표를 결정하기위한 bregma와 람다을 찾아 표시합니다. 우리가 사용했던 전극 / optogenetic 자극 구성을위한 Stereotaxic 좌표는 표 1에서 제시하고 그림 1A에 개략적으로 표시됩니다. 4. 해골에 주입 사이트의 작성 두개골의 각 주입 사이트를 구축하기 위해 0.5mm 볼 버 비트와 고속 치과 드릴을 사용합니다. 나사 삽입을 용이하게하기 위해 0.7 mm 볼 버 비트를 사용하여 각 구멍의 외부 여백을 챔퍼. 5. 삽입 및 Cannulas 확보, EMG는 리드 (lead)와 EEG 리드 EEG 나사를 (길이 0.8mm, 코팅 3 2cm로 삽입0-게이지 주석 도금 - 구리 버스는 구멍에) 머리를 망칠 때와 슬롯 손으로에서 그들을 몰아 사전 납땜 와이어 원하는 깊이를 얻기 위해 약 4-5 회전을 드라이버. 다음 stereotaxic 캐뉼라 홀더 및 부착 그들 아크릴 시멘트로 두개골 및 앵커에와 장소에 안내 cannulas을 잡아. 각 가이​​드 캐뉼라는 명백을 유지하기 위해 실험의 시간 (10~14일)에 수술의 시간에서 더미 캐뉼라 / 탐침을 (플라스틱, 하나, 일부 # C312 DC \ 1)를 포함해야합니다. 6. 외과 사이트를 닫기 일단 EEGs 및 가이드 cannulas는 본드는 치과 아크릴 시멘트 (- 오르토 - 제트 시멘트 랑 치과)와 함께 두개골에 위치하고 있습니다. 시멘트 세트 후, 건조 시멘트 마운드 위의 플라스틱 커넥터 (피나클 기술 부분 # 8402)를 배치. 솔더 EEG 리드에서 플라스틱 커넥터의 주소록에 나오는 와이어의 끝. 와이어가 시멘트에 연결 싸는. 그런 다음 nuchal 근육을 통해 EMG 와이어를 그리s은 (는) 21ga 바늘의 통에 넣어 슬라이드하여 근육을 관통. 그들은 근육을 종료 곳으로 단지 말초이 전선 주위에 5-0 나일론 봉합사의 두 외과 의사의 매듭을 묶게. P-3 바늘과 5-0 나일론 봉합사를 절단 역을 사용하여, 다시 하나의 중단 의사 옹이와 근육 조직을 액세스 할 수 후퇴 한 피부를 봉합 해. 7. 수술 진통제 및 복구 즉시 수술 후 항 염증 등 (0.1 밀리그램 / kg, 피하) 진통제와 flunixin meglumine (0.1 밀리그램 / kg, 피하)로 buprenorphine를 관리하고, 매일 일 1-2 수술에. 동물 실험 전에 최소한 7 일 동안 표준 식민지 주택 조건에서 복구 할 수 있습니다. 표준 식민지 주택 이외의 추가주의, cannulas는 장소에 고정 내재 stylets과 적어도 2 주 동안 특허를 유지 할 것으로 예상 할 수 있습니다. EEG와 EMG 센서는 유지 될 것으로 예상 할 수 있습니다이 기간 동안 기능. 2. 특정 시간 빛 펄스의 생성 1. MC의 자극 단위의 프로그래밍 데스크톱 컴퓨터에 USB 연결을 통해 MC-자극 단위 (멀티 채널 시스템)에 연결합니다. 사용 스프레드 시트와 같은 MC 자극 장치를 프로그램 할 MC-자극 사용자 인터페이스를 제공합니다.주세요 의 기간 동안 원하는 TTL (트랜지스터 - 트랜지스터 논리) 전압을 입력 기간 켜고 자극의 기간, 원하는 초당 사이클, 그리고 전체 자극 세션에 대한 반복 사이클의 총 수. 자세한 내용은 내용은 MC-자극 기술 설명서를 참조하십시오 : 3. 광섬유 저얼의 제조 / 조립대뇌 피질에 빛 제공을위한 obes <ol><li> 필요한 용품 및 장비에서 발견된다 : <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li> 절단 및 광섬유 케이블로 연마. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf은</a> </li></ol> 4. 쥐 Optogenetic의 자극 시스템의 조립 1. MC-자극 장치와 레이저의 인터페이스 MC-자극 단위가 프로그램되면, 신호 ON / OFF 5 만 볼트의 이진의 독립 실행 형 신호 생성기로 실행합니다. BNC 커넥터가있는 레이저의 TTL 사용 전원 장치에 MC-자극 장치를 연결합니다. 2. 광섬유 케이블을 통해 레이저 출력을 생산 수동으로 레이저 전원 장치의 디지털 디스플레이 및 가변 전원 출력 다이얼을 사용하여통증은 레이저의 전원 출력을 조정합니다. 리본 케이블을 통해 레이저로 레이저 전원 장치를 연결합니다. 여성 FC (페럴 커넥터) 광섬유 패치 케이블 (200 μm 직경 유리 전도 섬유는 아크릴 레이트 폴리머 cladding을 반영 빛으로 감싼 3m 길이)에있는 남성 FC 커넥터에 레이저 광섬유 어댑터를 연결합니다. 3. 로터리 정류자 : 동물에 레이저를 전달 이 collimating 렌즈 (도리스 식 렌즈)를 encasing 광 회전 이음의 끝을 반대에 발생하는 광섬유 케이블 (길이 3m)와 배달 광섬유 케이블 (길이 45 ㎝)에 연결합니다. 광섬유 로터리 조인트는 정류자 역할 : 동물의 케이지에 대해 이동으로 회전 조인트는 광섬유 케이블의 파손을 방지하기 위해 회전합니다. 금속에 부착 정류자에 플라스틱 케이블 타이를 사용하는 동물이 자리되는 원통형 케이지 위에 배치하라. 4. 배달 광섬유 부착머리를 케이블 cupped 손바닥 아래에 마우스를 핀 한 손을 사용하여 마우스를 구속. 실험의 검지와 중지 사이에 동양의 머리. 광섬유 캐뉼라에 배치 가이드 캐뉼라에서 더미 캐뉼라를 제거합니다. 멸균 25ga 바늘을 사용하여 쓰레기의 가이드 캐뉼라를 삭제합니다. 손으로 광섬유 케이블을 삽입하고 더미 캐뉼라에서인양 나사 캡과 광섬유 가이드 캐뉼라에 고정. 평면 흘리고 끝에서 고정 된 거리에서 광섬유 케이블에 연결된 봉합 매듭으로 뇌의 광섬유 케이블의 삽입의 깊이를 조절합니다. 전체 실험 장치는 그림 1B에 표시됩니다. 5. Optogenetic을 자극하는 동안 EEG 정의 된 절전 모드 및 젖산 농도의 측정 1. 락트산 센서의 Precalibration 락트산 센서의 사전 보정 체외에서 함께 수행됩니다키트 (피나클 기술 부분 # 7000-K1-T). 센서가 인산염의 equilibrated 것은 제조업체 프로토콜 당 stepwise 방식으로 L-락트산의 세 농도에 노출 후, (산도 7.4) 염분 버퍼. 2. 락트산 센서와 EEG 케이블의 삽입 광섬유 케이블 삽입 절차 (섹션 4.4)에 동일한 방식으로 두개골 마운트 락트산 가이드 캐뉼라로 미리 보정 된 센서를 삽입합니다. 양극성 플러그 커넥터가있는 피나클 8400 바이오 센서의 전치 증폭기에 젖산 센서를 연결합니다. 수술 - 주입 headmount에있는 8 핀 커넥터에이 전치 증폭기를 연결합니다. 3. Optogenetic의 자극 강도를 구축 데이터를 수집하기 전에 optogenetic의 자극의 강도를 조정하는 레이저 강도 조절 노브를 사용합니다. EEG 응답의 진폭은, 체계적으로 연구되지 ​​않은 요인으로 인해, 동물에서 다릅니다<html> D는 자극의 발병에 육안 검사에 의해 확인해야합니다. 실제로, 80-120 μWatts의 강도는 일반적으로 자극의 주파수에서 약 50 %의 EEG 진폭 증가를 생산합니다. 후 임시 고속 푸리에 변환 분석 (섹션 5.5 참조) 응답의 절대 크기를 정할 필요가 있습니다. 4. 데이터 수집 : 피나클 8400 시스템 사용하여 데이터 수집 <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html를</a> . 5. Neuroscore과 데이터 처리 : Neuroscore 인터페이스 (DataSciences, 국제와 EEG와 EMG의 데이터를 시각적으로 검사하여 상태를 잘 분류 <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a> 또는 Sirenia 인터페이스 (피나클 기술) :F = &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot;대상 = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). 웨이크, 비 급속 안구 운동 수면, 또는 EEG와 EMG에 따라 빠른 안구 운동 수면과 같은 10 초 epochs에서 프로세스 데이터입니다. 추가 분석 및 통계 테스트를 위해 Microsoft Excel 스프레드 시트로 데이터를 저장합니다.

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</ol>

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방법은 하나 이전에 불가능 시간 규모 glycolytic 중간 락트산의 두뇌 농도의 수면과 변화 사이의 관계를 측정 할 수 있도록 여기에 소개했다. 동물이 깨어나, NREMS와 REMS 사이의 자발적인 전환을 받고있다. 동물이 전환을 받다 동안 또한, 우리는 optogenetic 자극을 적용 할 수 있습니다. 데이터 락트산 산화 효소 기반 바이오 센서의 판독에 그 자연과 유도 모두 파도에 미치는 영향을 설명 데이트를 모았습니다. 하나는 다른 출처의 장비 및 소프트웨어와 함께 여기에 설명 된 것과 유사한 실험 시스템을 구성 수 있습니다. 설치류에 적합한 polysomnographic 시스템의 대체 소스는 데이터 과학 국제 11과 Embla 12 등이 있습니다. 슬립 상태 분류를위한 소프트웨어가 Somnologica 12 이용이 가능하며, 13 로그인 Icelus 14 자. 젖산의 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> BASi 마우스 가이드 정맥 </td><td> 피나클 기술 / BASi 주식회사 </td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td> 락트산 바이오 센서 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td> 머리 산 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td> 수면 / 바이오 센서 녹화 시스템 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 8400-K1-SL </td><td> 이 EEG 채널, 1 EMG 채널, &amp; 1 바이오 센서 </td></tr><tr><td> 테 더링 마우스 인 체외 보정 키트 </td><td> 피나클 기술 </td><td> 7000-K1-T </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 가이드 정맥 </td><td> 플라스틱 하나 </td><td> C312G </td><td> 21 게이지 가이드 정맥 </td></tr><tr><td> 더미 정맥 </td><td> 플라스틱 하나 </td><td> C312DC </td><td> 21 게이지 더미 </td></tr><tr><td> 다이아몬드 섬유 스크라이브 </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 커넥터 크림프 도구 </td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td> 분기 관 </td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03.0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> 최대 DIA. 0.012 </td></tr><tr><td> 분기 튜브 스트리퍼 </td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td> 맨 하드 Cladding 멀티 섬유 </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> 200 μm 코어, 0.37 NA </td></tr><tr><td> 와이어 자르는 / 케블라 자르는 가위 </td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 에폭시 </td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> 섬유 스트리퍼 도구 </td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 연마 플레이트 </td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td> 고무 폴리싱 패드 </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td> 아이 루페 </td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td> 김 물티슈 </td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td> 압축 공기 </td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리싱 퍽 </td><td> Thorlabs </td><td> D50-XX </td><td></td></tr><tr><td> 섬유 검사 범위 </td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td> 연마 영화 </td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC 커넥터 끝 </td><td> Thorlabs </tD&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> 240 μm의 정공, SS 페럴 </td></tr><tr><td> MC의 자극 단위 </td><td> 멀티 채널 시스템 </td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> MC의 자극 소프트웨어 </td><td> 멀티 채널 시스템 </td><td> MC-자극 V 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td> 블루 레이저 </td><td> CrystaLaser </td><td> CL473 - 050-0 </td><td></td></tr><tr><td> 레이저 전원 공급 장치 </td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td> 광섬유 로타리 조인트 </td><td> 도리스 식 렌즈 </td><td> FRJ-V4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 용품 및 장비. </td></tr></tbody></table>

동시 electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 neuronal 활동 optogenetic 조작의 실시간 측정

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

뇌는 질량에 의해 신체의 5 % 이하를 나타냅니다이지만, 나머지 1에서 몸에서 사용하는 포도당의 약 분기 활용합니다. 비 급속 안구 운동 수면 (NREMS), 시간의 수면의 가장 큰 부분의 기능은 불확실합니다. 그러나, NREMS 중 하나를 분출하는 기능은 잠이 오지 않음 2-4를 기준으로 뇌성 포도당 이용의 속도에 상당한 감소이다. 해당 제품 및 기타 연구 결과는 수면 뇌성 신진 대사에 관련된 기능을 제공하는 널리 통용되고 있던 신념으로 이어 왔습니다. 그러나 NREMS 동안 뇌성 포도당 신진 대사의 감소 근간이 메커니즘은 elucidated 할 수 남아 있습니다. 뇌성 신진 대사 속도에 영향을 미칠 수 있습니다 NREMS과 관련된 하나의 현상이 뇌파 5,6에서 속도가 느린 파도, 4 Hz에서보다 주파수에서 진동의 발생입니다. 두개골 또는 대뇌 피질 표면의 수준에서 감지 이러한 느린 파도가를 반영depolarized / 최대 상태 hyperpolarized / 아래 상태 7 사이의 기본 뉴런의 진동. 다운 상태 동안, 세포는 수백 밀리 초까지 간격에 대한 작업 잠재력을 받아야하지 않습니다. 작업 잠재력에 대한 후속 이온 농도 그라디언트의 복원은 세포 팔에 큰 신진 대사 하중을 나타냅니다 NREMS과 관련된 아래 주 동안 활동 전위의 부재가 깨어날 상대적으로 감소 신진 대사에 참여할 수 있습니다. 두 기술 도전은 테스트하려면이 가상 관​​계를 위해 해결해야했습니다. 첫째, 대뇌 EEG의 역학을 반영한 시간적 해상도로 뇌성 glycolytic 신진 대사를 측정 할 필요 (그​​ 대신 분 초 동안입니다.) 이렇게하려면 우리는 젖산의 농도, 에어로빅 작용의 제품, 따라서 쥐의 뇌에 포도당 신진 대사의 속도의 기록을 측정. 락트산였다전두엽 피질에 포함 된 젖산 산화 효소 기반의 실시간 센서를 사용하여 측정. 감지 메커니즘은 락트산 산화 효소 분자의 층으로 둘러싸인 백금 - 이리듐 전극으로 구성되어 있습니다. 락트산 산화 효소에 의해 젖산의 대사는 백금 - 이리듐 전극에 전류를 생산 과산화수소를 생산하고 있습니다. 그래서 대뇌 작용들로 ramping는 감지 전극에 증가 현재에 반영되어 락트산 산화 효소에 대한 기판의 농도 증가를 제공합니다. 이 NREMS의 다른 측면에서이 변수를 분리하기 위해 대뇌 피질의 흥분을 조작하는 동안이 변수를 측정하기 위해 추가로 필요했습니다. 우리는 Pyra의 optogenetic 활성화를 통해 뇌성 대뇌 피질의 neuronal 활동의 elecetroencephalogram, 락트산 바이오 센서를 통해 glycolytic 유량의 측정 및 조작을 통해 neuronal 활동의 동시 측정을위한 실험 시스템을 고안midal 뉴런. 우리는 수면 관련 electroencephalographic 파형과 대뇌 피질의 젖산 농도의 순간 - 투 - 순간 역학 사이의 관계를 문서화하는이 시스템을 활용하고 있습니다. 프로토콜 자유롭게 동물을 행동에 공부에 관심이있는 개인을 위해 유용 할 수 있습니다, 뇌 내의 electroencephalographic 수준과 세포 에너지 론에서 측정 neuronal 활동 사이의 관계.

<html> 으로, 그림 2에 표시된 EEG, EMG 및 뇌성 젖산 농도가 지속적으로 모니터링하는 동안 optogenetic의 자극과 EEG / 락 테이트 / EMG 데이터 수집을위한 시설을 갖추고 쥐가 자연 슬립 / 웨이크 상태 전환을 받았습니다. 락트산 센서의 전류는 EEG 낮은 진폭의 기간 동안 증가하고 EEG 높은 진폭의 기간 동안 감소. 그림 3에 도시 된 바와 같이, EEG의 두 채널은 전두엽 피질에 전달 optogenetic의 자극에 민감하게 반응합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4328/4328fig1.jpg" /> 그림 1. 수술 - 성형 한 EEG 전극, 젖산 센서와 optogenetic의 자극에 캐뉼라의 A) 도식 ...

절차는 뇌파, electromyogram, 그리고 뇌성 젖산 농도를 모니터링하는 동안 optogenetically 뇌성 대뇌 피질의 피라미드 뉴런의 활동을 조작하기위한 설명되어 있습니다. 사람들이 자연 수면 / 웨이크주기를 받아야 동안 실험 녹음 케이블 테 더링 마우스에 수행됩니다. Optogenetic 장비는 우리의 실험실에서 조립, 녹화 장비는 상업적으로 사용할 수 있습니다.

동시 Electroencephalography, 설치류 대뇌 피질의 젖산 농도와 Neuronal 활동 Optogenetic 조작의 실시간 측정

뇌는 질량 기준으로 신체의 5% 미만을 차지하지만, 휴식 상태에서 신체가 사용하는 포도당의 약 4분의 1을 소비합니다. ...

이 절차의 전반적인 목적은 정밀한 정위 좌표에서 광유전학적 자극을 주는 동안 EEG로 정의된 수면 상태와 젖산 농도를 측정하는 것입니다. 뇌전도 리드선과 젖산 센서 및 광섬유 케이블을 위한 캐뉼라를 외과적으로 이식하십시오. 그 다음, 동물의 두개골에 설치된 가이드 캐뉼라 내로 광섬유 케이블과 사전 보정된 젖산 센서를 삽입하십시오.다음으로, 원하는 전기생리학적 반응을 얻기 위해 청색광 자극 강도를 조절합니다. 그 후, 동물이 자발적으로 행동하거나 수면을 취하는 동안 뇌파, 근전도 및 젖산 농도 데이터를 수집합니다. EEG의 약리학적 연구와 같은 다른 방법들과 비교했을 때, 이 실험적 접근법은 뉴런의 활동을 1초 미만의 시간 단위로 실시간 조작하면서 뇌의 생화학 및 전기생리학적 상태를 모니터링할 수 있다는 장점이 있습니다.따라서 수면 연구 분야에서 새로운 통찰력을 제공할 가능성이 매우 높습니다. 예를 들어, 서파 수면의 대사 및 전기생리학적 수반 현상을 식별할 수 있습니다. 이러한 유형의 실험은 학습 및 기억, 시냅스 가소성 또는 발작성 질환과 같은 신경과학의 다른 분야에도 적용될 수 있습니다.해당 수술 기법은 기술적으로 매우 까다롭습니다. 상당한 숙련도가 필요하지만, 이는 충분한 연습을 통해 습득할 수 있습니다. 본 시각적 시연에서는 서면 설명의 보완을 위해 몇 가지 복잡한 수술 절차의 핵심 단계들을 반복하여 보여드리겠습니다.동물이 수술 후 회복되면, 젖산 센서와 광섬유 케이블을 적절하게 삽입하는 것이 관건입니다. 조나단과 저는 이 두 가지 정밀한 장비를 삽입하기 위해 동물을 보정할 때 손을 단단히 고정하는 방법을 시연하겠습니다. 마지막으로, 실시간으로 자극 강도를 조절하여 EEG 반응을 최적화하는 방법을 보여드리겠습니다.본 실험에서는 청색광 민감성 양이온 채널을 발현하는 형질전환 마우스를 사용합니다. 해당 채널은 대뇌 피질 뉴런에 도입됩니다. 먼저 유도를 위해 5% isof fluorine, 95% oxygen을 사용하여 마우스를 마취시킨 후, 3% isof fluorine, 97% oxygen으로 마취 상태를 유지합니다.양 눈 사이부터 두개골 뒷부분까지 두개골 상단에 정중 절개를 실시합니다. 과산화수소와 멸균 식염수로 두개골을 세척합니다. 전극 광유전학 자극 배치를 위한 정위 좌표를 결정하기 위해 Bregma와 Lambda를 찾아 표시합니다. 0.5 mm 볼 버(ball bur) 비트와 이어서 0.7 mm 볼 버 비트가 장착된 고속 치과용 드릴을 사용하여 나사 구멍을 뚫습니다.일자 드라이버를 사용하여 전극 고정용 나사(kelo gram screws)를 구멍에 삽입합니다. 원하는 깊이가 될 때까지 약 4~5바퀴 정도 돌려 고정합니다. 스테레오택식 캐뉼라로 가이드 캐뉼라를 제자리에 유지한 다음, 아크릴 시멘트를 사용하여 두개골과 앵커에 부착합니다. 개통성을 유지하기 위해, 수술 시점부터 실험 시점까지 각 가이드 캐뉼라 내에 더미 캐뉼라 또는 스타일렛을 삽입해 두어야 합니다.EEG 전극과 가이드 캐뉼라를 두개골에 배치한 후, 얇은 층의 치과용 아크릴 시멘트로 이들을 함께 고정합니다. 시멘트가 굳으면, 건조된 시멘트 둔덕 위에 플라스틱 커넥터를 배치하고, EEG 리드에서 뻗어 나온 와이어 끝부분을 플라스틱 커넥터의 접점에 납땜하여 와이어 리드가 시멘트에 고정되도록 합니다. 그 후, 21 gauge 바늘의 배럴 속으로 근전도 와이어를 밀어 넣어 핵 근육을 통해 통과시킵니다.근육을 관통하여 와이어가 근육에서 나오는 지점 바로 원위부에 5-0 나일론 봉합사로 더블 서전 매듭(double surgeon's knot)을 묶습니다. 역절단 P3 바늘과 5-0 나일론 봉합사를 사용하여 단일 결절 봉합(single interrupted surgeon knots) 방식으로 근육 조직에 접근하기 위해 견인했던 피부를 다시 봉합합니다. MC 자극 장치의 프로그래밍이 완료되면, 이를 5V 이진 온-오프 신호를 생성하는 독립형 신호 발생기로 작동시킵니다. BNC 커넥터를 사용하여 MC 자극 장치를 레이저의 TTL 활성화 전원 장치에 연결합니다.리본 케이블을 통해 레이저 전원 장치를 레이저에 연결하십시오. 또한, 레이저를 시작 광섬유 패치 케이블의 수형 FC 커넥터에 연결하십시오. 시작 광섬유 케이블을 회전 조인트에 연결하십시오.정류기 광섬유 회전 조인트(Commutator Fiber optic rotary joint)는 정류기 역할을 합니다. 동물이 케이지 안에서 움직일 때, 회전 조인트가 함께 회전하여 회전 토크로 인해 광섬유 케이블이 파손되는 것을 방지합니다. 플라스틱 케이블 타이로 정류기를 동물이 수용된 원통형 케이지 상단에 배치된 금속 스탠드에 고정하십시오.한 손으로 생쥐를 컵 모양으로 감싸 쥐어 고정합니다. 생쥐의 머리가 실험자의 중지와 검지 사이에 오도록 위치시킵니다. 이제 멸균된 25 gauge 바늘을 사용하여 가이드 캐뉼라 내부의 이물질을 제거합니다.그 다음 광섬유 케이블을 수동으로 삽입하고 나사형 스크루 캡을 사용하여 광섬유 가이드 캐뉼라에 고정합니다. 평평하게 절단된 끝단으로부터 일정 거리에 묶은 봉합사 매듭을 통해 뇌 내 광섬유 케이블의 삽입 깊이를 조절합니다. 센서는 인산염 완충 식염수에서 보정하며, 세 가지 농도의 L lactate에 단계적으로 노출시킵니다.제조사 프로토콜에 따라, 광섬유 케이블 삽입 절차와 동일한 방식으로 미리 보정된 센서를 두개골에 장착된 젖산 가이드 캐뉼라에 삽입하십시오. 바이폴라 플러그 커넥터를 사용하여 젖산 센서를 pinnacle 8, 400 바이오센서의 프리앰프에 연결하십시오. 그런 다음 이 프리앰프를 수술적으로 이식된 헤드 마운트의 8핀 커넥터에 부착하십시오.데이터를 수집하기 전, 레이저 강도 조절 노브를 사용하여 광유전학적 자극의 강도를 조정하십시오. EEG 응답의 진폭은 체계적으로 연구되지 않은 요인들로 인해 동물마다 다르게 나타날 수 있습니다. 따라서 광유전학적 자극 강도를 조정하여 원하는 응답이 얻어졌을 때 EEG 응답이 적절한지 확인하는 과정이 필요합니다.neuro score가 포함된 Pinnacle 8, 400 시스템을 사용하여 데이터를 수집합니다. SEIA 인터페이스를 통해 EEG 및 EMG 데이터 처리 과정의 시각적 검사를 수행하여 수면 상태를 분류합니다. EEG 및 EMG를 기반으로 10초 에포크 단위의 데이터를 각성, 비급속 안구 운동 수면 또는 급속 안구 운동 수면으로 분류합니다.이 바이오센서 광유전학적 자극 구성은 외과적으로 삽입된 EEG 전극, 젖산 센서 및 광유전학적 자극용 캐뉼라를 보여줍니다. 광유전학적 자극이 없는 상태에서 이 마우스는 자연 수면을 취했습니다. EEG, EMG 및 뇌 젖산 농도가 지속적으로 모니터링되는 동안 각성 상태의 전이와 두 가지 수면 하위 유형이 관찰되었습니다.급속 안구 운동(Rapid eye movement)과 비급속 안구 운동(non rapid eye movement)은 EEG와 EMG를 기반으로 정의됩니다. 흥미롭게도, 젖산 바이오센서 전류는 저진폭 EEG의 함수로 증가하며, 고진폭 EEG의 함수로 감소합니다. EEG의 두 채널 모두 전두엽 피질에 전달된 광유전학적 자극에 반응합니다.이 영상을 시청한 후, 광유전학적 조작과 더불어 뇌의 뇌파, 근전도 및 젖산 농도를 동시에 측정하기 위한 마우스 수술적 임플란트 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 수술 기법을 숙달하면 90분에서 120분 이내에 적절히 수행할 수 있습니다. 마취 깊이를 측정하는 척도로서 동물의 호흡 상태를 지속적으로 모니터링해야 함을 기억하십시오.동물의 호흡 주기가 4~5초에 한 번보다 더 길어지면 마취가 너무 깊은 상태일 수 있습니다. 반대로 호흡 주기가 2초에 한 번보다 더 짧아지면 마취가 너무 얕은 상태일 수 있습니다. 가스 마취제인 isof fluorine을 사용할 때는 적절한 안전 주의 사항을 준수해야 함을 기억하십시오.광유전학적 자극에 사용되는 레이저로부터 망막을 보호하기 위해 수술실 내의 환기가 적절한지 확인하십시오. 보호 고글을 착용하거나 동물을 차광 캐비닛에 넣으십시오. 완전히 깨어 있는 마우스에 젖산 바이오센서와 광섬유 케이블을 이식하는 연습이 필요합니다.마우스는 이러한 절차에 순응하지 않으므로 고정시켜야 합니다. 하지만 구속 장치가 동물을 다치게 하거나 호흡을 방해할 정도로 강해서는 안 됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 신경 활동과 혈액 산소 수준의 종속 (굵게) MRI 신호 사이의 관계의 조사를 위해 플랫폼을 제공하고 동시에 기능성 자기 공명 이미징 및 쥐 두뇌에 electrophysiological 기록하는 방법을 개발했습니다.

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

이 비디오는 마취된 쥐에서 공동 국소 뇌파검사(EEG)와 국소 자기장 전위(LFP)를 동시에 기록하는 절차를 보여줍니다. 이 과정에는 쥐를 준비하고 수염 패드에 자극 전극을 부착하는 것이 포함됩니다. 표면 EEG 측정을 위해 EEG 거미 전극을 쥐의 두개골에 놓습니다. 동시에 다채널 미세전극은 두개골의 버 구멍을 통해 특정 뇌 영역에 삽입되어 국소화된 뇌 영역의 신경 활동을 기록합니다.

마취된 쥐의 동시 뇌파 및 국소 자기장 전위 기록(Concurrent Electroencephalographic and Local Field Potential Recordings in an Anesthetized Rat

이 비디오는 내측 전전두엽 피질(mPFC) 축삭을 광유전학적으로 자극하고 LEC에서 피라미드 뉴런의 반응을 기록하여 외측 내후각 피질(LEC)의 시냅스 효율성을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 녹음과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합합니다.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

출처: Lai, J., et al. 설치류 뇌에서 억제제의 동시 전기생리학적 기록 및 미세 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 쥐 상골에서 동시 신경 기록 및 억제를 위한 미세 주입 기반 기술을 보여줍니다. 이 절차에는 정위 표적화, 두개골 드릴링, 신경 활동을 기록하면서 억제성 신경 전달 물질을 전달하는 주사대 삽입이 포함됩니다. 빛 자극은 활동 전위를 유발하는 반면 약물 미세 주사는 신경 흥분성을 억제합니다. 신경 전달 물질 수치가 감소함에 따라 신경 활동이 기준선으로 돌아가 억제와 회복에 대한 연구가 가능해집니다.

쥐에서 신경 활동의 억제 및 전기생리학을 사용한 검출

여기에서는 약물의 미세 주입에 의한 뇌 심부 구조 억제와 동시 전기 생리학적 기록을 통한 실시간 모니터링이라는 두 가지 기능을 가진 유리 피펫을 제작합니다.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

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우리는 동시에 응답 nociceptive 레이저 자극으로 자유롭게 이동 하는 쥐에서 electrocorticography와 로컬 필드 전위를 기록 하는 기술을 개발 했다. 이 기술은 nociceptive 정보를 뇌에서 처리 조사를 용이 하 게 electrocortical 신호는 생체 및 거시적인 수준에서의 직접적인 관계를 설정 하는 데 도움이 됩니다.

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