애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry Drosophila 망막

이 절차의 전반적인 목적은 초파리 망막의 최적 절개를 얻고 발달 중인 망막에서 발현되는 단백질을 시각화하는 것입니다. 첫째, 망막 박리술은 유충 단계, 동공 단계, 성체 단계의 세 가지 발달 단계에서 시연됩니다. 다음 단계는 고정과 면역조직화학입니다.

마지막 단계에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 시각화하기 위해 망막을 슬라이드에 장착합니다. 궁극적으로 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 망막 세포의 발달 및 분화를 보여줍니다. 역사적으로 파리 망막은 발달 생물학의 광범위한 질문을 해결하고 근본적인 유전 조절 메커니즘을 연구하는 데 이상적인 시스템이었습니다.

여기에서는 만능 단계에서 말기 분화 상태로 진행되는 망막 세포의 발달을 시각화하는 기술을 보여 드리고, 용암 또는 망막을 해부하는 방법을 보여 드리겠습니다. 나는 광수용체의 핵이 거의 같은 초점면에 있기 때문에 중간 동공 망막에 대한 해부를 시연할 것입니다. 이 단계는 전사 인자(transcription factor)와 같은 핵 국소 단백질의 발현을 비교하는 데 이상적입니다.

오늘은 성인 파리 망막을 해부하는 방법을 보여 드리겠습니다. 발달 단계의 재현 가능한 병기를 용이하게 하려면 이러한 조건에서 초파리를 섭씨 25도의 일정한 온도와 1212의 밝은 어두운 주기 이하로 유지하십시오. 세 번째 instar 유충은 늦은 세 번째 instar 유충이 음식을 먹기 위해 떠날 때 조절 후 약 96 시간 후에 사용할 수 있습니다.

부드러운 솔이나 집게로 제거할 수 있습니다. 유충을 채취한 후 실가드 해부 접시에 차가운 PBS 한 방울에 담아 놓습니다. 실험 그룹당 약 10-15개의 망막을 절개할 준비를 합니다.

해부 현미경으로 입 고리가 있는 용암의 앞쪽 끝을 찾습니다. 집게를 사용하여 용암의 중간 부분을 실 가드 접시의 바닥에 부드럽게 누릅니다. 다른 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 몸에서 부드럽고 천천히 당깁니다.

몸의 주요 부분을 버리고 입 부분을 사용하여 앞부분을 잡습니다. 여기서의 목표는 상상력, 디스크 및 뇌에서 외부 조직을 제거하는 것입니다. 이제 집게로 입 고리를 잡고 상상의 디스크가있는 뇌를 PBS로 채워진 세 개의 세계 유리, 세계 접시로 옮깁니다.

다음으로, PBS를 갓 준비한 고정제로 교체하고 셰이커에서 조직을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 P 200 피펫으로 정착액을 제거합니다. PBS로 조직을 두 번 헹구고 새 PBS 수조로 옮깁니다.

티슈를 셰이커에 올려 실온에서 30분 동안 씻습니다. 이제 PBS를 제거하고 PBST로 조직을 두 번 헹굽니다. 그런 다음 새로운 PBST를 다시 추가하고 현미경으로 조직을 추가로 해부할 준비를 합니다.

침샘과 지방 조직을 제거합니다. 그런 다음 눈의 상상 디스크를 다른 조직과 분리합니다. 이제 면역조직화학 처리를 거칠 준비가 되었습니다.

티슈를 처리한 후 깨끗한 유리 슬라이드의 중앙으로 옮깁니다. P 20 피펫을 사용하여 여분의 용액을 제거한 다음 집게를 사용하여 망막을 슬라이드 중앙에 정렬합니다. 이미징용.

이제 10마이크로리터의 장착 매체를 망막에 적용합니다. 커버 슬립으로 부드럽게 덮고 투명한 매니큐어로 슬립을 슬라이드에 밀봉합니다. 섭씨 25도, 50%pube는 번데기 후 약 48시간에 관찰할 수 있습니다.

빙빙 돌거나, 바이알에 흰색 또는 0%pube가 형성되거나, 단순히 새 바이알로 옮기는 것이 가장 좋습니다. 48시간 후, 중간 번데기는 집게를 사용하여 조심스럽게 제거하고 PBS로 옮길 수 있습니다 현미경으로 집게로 동공 케이스의 뒤쪽 끝을 잡습니다. 그런 다음 다른 집게로 큐티클의 앞쪽 표면을 잡고 수술을 부드럽게 제거합니다.

머리가 완전히 드러나도록 남아 있는 큐티클을 벗겨냅니다. 이제 집게 끝을 사용하여 등쪽 앞쪽 부위에 있는 밑에 있는 부드러운 자루를 뚫습니다. 이렇게 하면 헤드에 액세스할 수 있습니다.

P 20 피펫으로 머리를 천천히 빨아 올려 머리와 흉부를 부드럽게 분리하고 피펫에서 머리를 새 PBS로 배출합니다. 뇌에 부착된 망막은 자유롭게 떠다닐 것입니다. PBS를 한 방울 더 떨어뜨리면 투명한 망막을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.

조직이 안정되면 머리 큐티클과 주둥이를 포함한 여분의 조직을 제거합니다. 망막과 뇌를 PBS에 격리된 모든 망막과 뇌와 함께 새로운 PBS로 이식합니다. 용액을 갓 준비한 정착제로 교체하십시오.

그런 다음 셰이커에 조직을 실온에서 15분 동안 배양합니다. 15분 후 피펫으로 고정액을 제거하고 티슈를 세 번 헹굽니다. PBST를 사용하면 조직을 PBST에 담근 상태로 두고 추가 해부를 준비할

이것은 프로토콜에서 가장 어려운 단계입니다. 먼저 조직을 연구하여 얇은 판과 뇌를 제거합니다. 매우 날카로운 해부 바늘을 사용하여 시신경을 뚫습니다.

그런 다음 얇은 판과 망막 사이에 똑같이 날카로운 절개 바늘을 삽입하여 얇은 판과 시신경에서 망막을 분리합니다. 망막은 이제 염색될 수 있지만 매우 얇고 끈적거리므로 취급할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 조직을 염색한 후 P 20 피펫을 사용하여 중앙 동공 망막을 장착하여 깨끗하고 양전하를 띤 유리 슬라이드의 중앙으로 이동합니다.

여분의 PBST를 제거한 다음 바늘을 사용하여 이미징을 위해 망막을 정렬합니다. 이제 10마이크로리터의 장착 매체를 망막에 적용합니다. 와이프와 모세관 동작을 사용하여 커버 슬립을 부드럽게 적용한 후 PBST를 제거합니다.

슬라이드는 이미징할 준비가 되었습니다. 2일에서 5일 된 파리의 머리를 차가운 XPBS가 들어 있는 유리 야생 접시에 모으는 것으로 시작합니다. S 접시에 담긴 차가운 PBS 한 방울에 머리 하나를 옮깁니다.

집게로 앞쪽 두낭을 잡고 입 부분을 제거하여 해부를 시작합니다. 그런 다음 한 집게로 복부 후방 두부 큐티클을 잡고 다른 쪽 집게를 사용하여 큐티클 가장자리를 따라 찢어 한쪽 눈을 큐티클에서 분리합니다. 나중에 조작하기 위해 눈 가장자리의 큐티클을 제거하여 진행합니다.

망막에 붙어있는 작은 큐티클 조각을 남겨두는 것이 편리합니다. 이제 모든 망막을 절개할 때 집게를 사용하여 차가운 PBS가 들어 있는 유리 야생 접시에 망막을 옮깁니다. PBS를 갓 준비한 정착제로 교체하십시오.

망막의 안쪽 부분이 고정제와 접촉하고 있는지 확인하십시오. 망막이 표면에 떠 있더라도 실온에서 15분 동안 셰이커에서 조직을 배양합니다 15분 후 P 200 피펫으로 고정제를 제거하고 PBS로 조직을 두 번 헹굽니다. 그런 다음 실온의 셰이커에서 30분 이상 티슈를 씻으십시오.

이제 PBS를 제거하고 PBST를 추가한 다음 층을 제거할 준비를 합니다. 종종 얇은 판은 절개 된 망막의 내부 표면에 부착 된 상태로 남아 있습니다. 집게로 한쪽 가장자리의 망막을 잡고 다른 집게로 얇은 판을 부드럽게 당겨 제거합니다.

그런 다음 남아 있는 큐티클을 제거하여 망막에 접히지 않도록 합니다. 장착하는 동안 얇은 판과 큐티클 조직은 염색된 광수용체를 시각화하는 데 방해가 됩니다. 이제 망막을 염색할 수 있습니다.

성인 망막을 해부하는 것은 몇 주간의 연습으로 마스터할 수 있습니다. 라민을 내뿜고 제거하는 것은 아마도 가장 어려운 부분일 것입니다. 제 조언은 인내심을 갖고 당신이 필요하다고 생각하는 것보다 더 많은 것을 해부하라는 것입니다.

또한 흰 눈 파리로 시도하기 전에 빨간 눈 파리로 연습하는 데 도움이 됩니다. 염색이 완료되면 망막은 이미징을 위해 브리지 슬라이드의 방향을 지정해야 합니다. 테이프로 고정되면 브리지 조명은 설명된 절차에 따라 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다.

3단계 발달 단계의 망막 샘플은 현미경 검사를 위해 준비됩니다. 애벌레 눈 상상 디스크는 서로 다른 광수용체 유형에서 발현되는 두 가지 전사 인자를 감지하는 항체로 염색되었습니다. 단백질 seven up은 녹색으로 표시되고 단백질 runt는 magenta로 표시됩니다.

고립된 중간 동공 망막은 다양한 광수용체 유형을 시각화하는 항체와 함께 배양되었습니다. 얼룩은 모든 광 수용체를 표시하는 파란색의 LLV와 프로스페로에 대한 것입니다. 시안색으로, R에 7개의 광수용체를 표시합니다.

성인 망막은 두 개의 광수용체 아형을 시각화하기 위해 항체에 두 개의 빨간색 방울로 염색되었습니다. 청록색의 RH 5와 빨간색의 Rh 6의 확률론적이고 상호 배타적인 발현은 R 8 광수용체의 두 가지 하위 유형에서 발생합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 유충 동공과 성인 독감 망막을 해부하는 방법과 면역조직화학을 사용하여 망막 세포를 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

사용 가능한 눈별 기능 손실 및 이득 접근 방식과 결합됩니다. 이 프로토콜을 통해 눈 발달의 기초가 되는 유전적 메커니즘을 연구할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.