Name: 에 대한 바이러스 나노 입자 생체에 종양 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 배우세요 식물 바이러스 나노입자를 이용한 종양 표적화 및 생체 이미징 방법을 마우스 종양 모델에서. 형광 표지된 VNP의 생체 내 분포와 종양 축적을 분석하는 기술입니다.

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이 작품은 NIH / NIBIB 보조금 R00 EB009105 (NFS로)와 P30 EB011317 (NFS에), NIH / NIBIB 훈련 보조금 T32 EB007509 (AMW에), 케이스 웨스턴 리저브 대학의 학제 연합 투자 기금 (NFS로)에 의해 지원되었다 및 사례 종합 암 센터 보조금 P30 CA043703 (NFS로). 우리는의 Steinmetz 연구실 학부 학생 연구원에게 감사 실질적인 지원 : 나디아 Ayat, 케빈 첸, Sourav (SID) 데이, 앨리스 양 샘 알렉산더, 크레이그 D&#39; 크루즈 스티븐 왜가리, 로렌 랜돌프, 브라이언 그래서 바울 Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 전파 <ol><li> 실내 식물 챔버 하루 15 시간 (100 % 등, 25 ° C, 65 % 습도)와 밤 9 시간 (0 % 등, 22 ° C, 60 % 습도)에 제어합니다. </li><li> 표 1의 타임 라인에 따라 식물의 예방. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV, 그리고 BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> 일 0 : 공장 3 cowpea 씨앗 / 화분. </td><td> 일 0 : 공장 ~ 30 N. benthamiana 씨 / 냄비. 1 큰술 비료 / 5 L의 물을 일주일에 한 번 비옥. </td></tr><tr><td> 일 14 : 1 공장 / 냄비에서 다시 냄비 N. benthamiana. </td></tr><tr><td> 10 일 : 감염은 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 CPMV (5 μg/50 μl / 잎)를 기본 잎을 남긴다. </td><td> 일 28 : 감염 3 F필자는 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 PVX, TMV, 또는 BMV (5 μg/50 μl / 잎)로 출발합니다. </td></tr><tr><td> 일 20 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C. </td><td> 일 42 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C. </td></tr></tbody></table> 성장 감염, 그리고 잎을 수확을위한 표 1. 타임 라인. 참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 정화 참고 : 모든 단계는 얼음 또는 4에서 수행되는 ° C. <ol><li> 추위 버퍼 2 볼륨을 (표 2 참조)를 사용하여 표준 믹서기에서 냉동 잎 100g을 균질화. 일종의 투박한 무명로부터 2-3 층을 통해 필터링 할 수 있습니다. </li><li> PVX를 들어, 1 M HCL을 사용하여 6.5에 pH를 조정합니다. 0.2 % (w / V) 아스코르브 산 및 0.2 % (w / V) 나트륨 sulfi을 추가테. </li><li> 20 분에 5,500 XG에서 원유 공장 homogenate를 원심 분리기. 표면에 뜨는 수집합니다. </li><li> BMV를 들어, 레이어 10 % (w / V) 자당 솔루션의 5 ML 이상 표면에 뜨는 25 ML. 38.5 % CsCl 용액 (w / V)의 3 시간과 resuspend 펠릿을위한 9,000 XG에서 원심 분리기. 5 시간에 진동에 의한 혼합 한 다음 단계 2.12를 계속합니다. </li><li> 1시 1분 (V / V) 클로로포름 :1-부탄올의 0.7 볼륨을 추가하여 식물 자료를 추출합니다. 30-60 분 동안 혼합물을 저어. </li><li> 20 분에 5,500 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 위 수성 단계를 수집합니다. </li><li> 0.2 M와 8 % (w / V) PEG (MW 8000)에 NaCl을 추가합니다. TMV의 경우도 (V / V) 트라이 튼 X-100 1 %를 추가 할 수 있습니다. 적어도 1 시간에 저어, 최소한 1 시간에 앉아 보자. </li><li> 15 분에 15,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 버퍼의 10 ML에 Resuspend 펠릿. PVX를 들어, 0.5 M.에 0.1 % β-메르 캅토 에탄올 및 요소를 추가 </li><li> 30 분에 8,000 XG에 원심 분리기와 표면에 뜨는 수집합니다. </li><li> 3 시간에 160,000 XG에 표면에 뜨는을 Ultracentrifuge. 5 ML 버퍼 O에 Resuspend 펠릿vernight. </li><li> 동일한 10 % 권, 20 %, 30 %, 및 버퍼에 40 % 자당을 (무거운 첫 번째)를 사용하여 10-40%의 자당 기울기를 준비합니다. 기울기가 실온에서 하룻밤 평형 할 수 있습니다. </li><li> Ultracentrifuge은 2 시간 (BMV 24 시간)에 100,000 XG에서 자당 기울기를 통해 펠릿을 resuspended. </li><li> 광 분산 밴드를 수집하고 버퍼에 대한 dialyze. </li><li> 4에 VNPs (아래)와 상점을 특징 ° C. 장기 저장을 위해, -80에 저장 ° C.를 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV 및 TMV </td><td> 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 38.5 MM KH 2 PO 4 61.5 MM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0.5 M borate 버퍼 (산도 7.8) 0.5 M 붕소의 산성 NaOH로 pH를 조정 </td></tr><tr><td> BMV </td><td> 사마 버퍼 (산도 4.5) 250 MM 나트륨 아세테이트 10 MM MgCl 2 이 MM β-메르 캅토 에탄올 (신선한 추가) </td></tr></tbody></table> 표 2. 각 VNP에 대한 버퍼 및 요리법. 참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 특성 <ol><li> VNPs의 농도를 결정하기 위해 UV / 눈에 보이는 분광을 수행합니다. <ol><li> NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 샘​​플 2 μl의 흡광도를 측정합니다. </li><li> 맥주 램버트 법을 사용하여 입자와 염료의 농도를 결정 (A는 흡광도입니다 A = εcl, ε 흡광 계수이며, C는 농도이며, 전 경로 길이입니다.) 경로 길이는 NanoDrop에 0.1 cm입니다. VNP 별 흡광 계수는 다음과 같습니다 CPMV : 8.1 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서) PVX : 2.97 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서) TMV : 3.0 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서) BMV : 5.15 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서) </li></ol></li><li> 크기 제외 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)에 의해 입자를 분석합니다. <ol><li> Superose 6 크기 배제 컬럼과 악타 익스플로러, 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 200 μl에 VNPs의 부하 50-100 μg을 사용합니다. </li><li> 260 나노 미터 (핵산), 280 nm의 (단백질), 그리고 연결된 염료의 여기 파장에 감지기를 설정합니다. </li><li> 72 분 동안 0.5 ML / 분의 유량으로 실행합니다. </li><li> 용출 프로필과 A260 : A280 나노 미터는 VNP 준비가 순수 여부와 입자가 온전하고 조립 있는지 여부를 나타냅니다. 다음 A260 : 280 비율이 순수한 VNP 준비를 나타냅니다 : CPMV : 1.8 ± 0.1 PVX : 1.2 ± 0.1 TMV :1.1 ± 0.1 BMV : 1.7 ± 0.1 </li></ol></li><li> 개별 코트 단백질에 준비 및 활용의 순도를 분석 할 (예정 주물 NuPAGE) 비스 - 트리스의 polyacrylamide 4-12% 기울기 겔 전기 영동을 denaturing 수행합니다. <ol><li> 인산 칼륨 버퍼의 9 μl에있는 입자의 10 μg에 4X LDS 샘플 버퍼 3 ML을 추가합니다. 이황화 채권의 높은 수를 줄이기 위해 BMV에 4X LDS 샘플 버퍼와 β-메르 캅토 에탄올 3 μl의 추가 1 μl를 추가합니다. </li><li> 100 5 분에 열 블록에 품다 ° C. </li><li> SDS 젤에 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행 1X 걸레에 1 시간에 대해 200 V에서 샘플을 실행합니다. </li><li> 형광 코트 단백질을 시각화하기 위해 UV 빛 아래에있는 젤을 문서화. </li><li> 비 형광 단백질의 경우 1 시간에 Coomassie 블루 (0.25 % (w / V) Coomassie 브릴리언트 블루 R-250, 30 % (V / V) 메탄올, 10 % (V / V) 아세트산 산)와 얼룩. </li><li> 밤새 30 % 메탄올, 10 % 아세트산과 Destain. 찬GE는이 솔루션이 필요합니다. </li><li> 하얀 빛 아래 젤을 문서화. </li></ol></li><li> 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 입자의 무결성을 분석합니다. <ol><li> 0.1-1 MG / DI 물을 20 μl의 ML에 샘플을 희석. </li><li> Parafilm에있는 샘플의 20 μl 방울을 넣으십시오. </li><li> TEM 그리드와 방울을 커버 2 분 동안 앉아 보자. 필터 종이 그리드에 초과 솔루션을 위크. </li><li> 드라이 wicking 후 DI 워터 드롭 배치하여 격자를 씻으십시오. </li><li> 2 % 20 μl 드롭 (w / V) 2 분에 대한 uranyl 아세트산에 배치하여 격자를 청바지. 필터 종이 얼룩 초과를 위크. </li><li> 물에 한 번 더 그리드를 씻으십시오. </li><li> 전송 전자 현미경으로 격자를 관찰. </li></ol></li></ol> 4. PEG와 Fluorophores, 정제 및 특성과 VNPs의 화학 결합 <ol><li> 아래의 반응에 대한 계산은 VNPs의 몰 질량은 다음과 같습니다 CPMV : 5.6X 10 6 G / 몰 PVX : 35 X 10 6 G / 몰 TMV : 41 X 10 6 G / 몰 BMV : 4.6 X 10 6 G / 몰 </li><li> 한 단계 N-하이드 록시 succinimide 커플 링 반응을 이용하여 CPMV과 PVX의 표면 lysines에 염료와 PEG를 공액 : 알렉사 형석 647 succinimidyl 에스테르 및 4500 등가물의 2500 몰 등가물 (모든 어금니 과도한는 VNP 당 어금니를 초과 참조) 추가 NHS를 PEG (MW 5,000) 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼에 CPMV에 DMSO에 용해. PVX와 함께 작업 할 경우 NHS-염색 및 NHS-PEG의 만 몰 초과를 추가합니다. CPMV와 PVX의 최종 농도가 2 밀리그램 / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 빛으로부터 보호 상온에서 반응 혼합물은 하루 아침에 품다. CPMV 및 PVX는 각각 300 및 1270 번지 lysines 있습니다. (독자가에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다CPMV 및 PVX의 화학 수정 : 13-15). </li><li> diazonium 커플 링에 의한 TMV의 tyrosines에 공액 염료와 PEG는 구리 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition이 나타납니다. <ol><li> 0.3 M P-toluenesulfonic의 산성 일 수화물, 3.0 M의 아질산 나트륨의 25 μl, 그리고 0.68 M 소주 1 시간에 대해 4 ° C에서 아세토 니트릴에 용해 3 ethynylaniline의 75 μl 400 μl를 혼합하여 diazonium 염 (alkyne)를 준비합니다. </li><li> TMV의 1.25 ML (20 MG / ML 주식 솔루션)에 NaCl 100 MM를 포함하는 borate 버퍼, 산도 8.8의 3.3 ML를 추가합니다. </li><li> alkyne 결합이 diazonium 커플 링으로 TMV에 처리 추가하는 3 시간에 얼음 욕조에서 diazonium 염 (alkyne) 솔루션 450 μl로 TMV를 반응한다. 이 솔루션은 밝은 갈색 컬러로 돌아갈 것입니다. TMV는 활용을위한 2140 사용할 수 tyrosines 있습니다. </li><li> 단계 4.4에 설명 된대로 자당의 쿠션을 사용하여 최종 제품을 정화. </li><li> azide - 기능 알렉사 형석 647 및 PEG-azide (MW 5,000) 쓰겠다고를 첨부g의 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC). 1 ㎜ CuSO 4, 2 MM의 AMG, 그리고 15 분 동안 실온에서 2 MM 나트륨 아스 코브 산으로 코트의 단백질과 품다 당 염료 및 PEG-azide 2 동등을 추가합니다. TMV의 최종 반응 농도가 2 밀리그램 / ML이라는 버퍼 볼륨 등 조정합니다. (: 16,17 리더는 TMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.) </li></ol></li><li> lysines 및 BMV 시스테인 돌연변이 (cBMV)의 cysteine​​s에 PEG에 염료를 변화시키다 : <ol><li> 0.1 M TNKM 버퍼 (50 MM 트리스베이스, 50 MM NaCl, 10 MM KCl, 5 MM MgCl 2, 산도 7.4)에 cBMV에 DMSO에 용해 오레곤 그린 488 succinimidyl 에스테르 2,000 몰 동등을 추가합니다. BMV의 최종 농도가 1 MG / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 4에서 하룻밤 반응 혼합물을 품어 ° C 빛으로부터 보호되고 있습니다. </li><li> centri를 사용하여 정화 입자같은 fugal 필터는 단계 4.4에 설명되어 있습니다. </li><li> 이전과 동일한 반응 조건을 사용하여 PEG-maleimide (MW 2000)의 2000 몰 초과를 추가하고 4시에 2 시간의 반응 혼합물을 품어 ° C. cBMV 180 반응 lysines과 cysteine​​s 있습니다. (: 18 리더는 BMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.) </li></ol></li><li> 정제 : 2.5 시간에 160,000 XG의 40 % (w / V) 자당의 쿠션을 통해 솔루션을 전달합니다. 버퍼에 펠렛를 다시 분해. 또한, 10 kDa 컷 - 오프 스핀 필터를 사용 적절한 버퍼에 대한 dialyze. </li><li> 특성화 : PEGylated과 휘황-라벨 VNPs은 위에서 설명한 방법 사용 분석 : 표시 / UV 분광, SDS 겔 전기 영동, FPLC, 그리고 TEM (미도 그러나,도 6 및 7 참조). </li></ol> 5. 마우스 이종 이식 모델을 사용하여 종양 타겟팅 및 이미징<ol><li> 문화 HT-29 RPMI 매체에서 인간 대장 암 세포는 175cm이 세포 배양 플라스크를 사용하여 5 % CO 2 5 % FBS, 37시 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 그리고 1% L-글루타민 ° C로 보충. </li><li> 5 분에 37 ° C에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 5 ML과 잠복기에 의해 멸균 PBS와 수확을 두 번 세포를 씻으십시오. RPMI 매체의 5 ML과 트립신을 비활성화. 5 분 500 XG에 centrifuging하여 세포를 수집합니다. 4에 5x10 6 cells/50 μl 매체 (trypan 파랑과 hemocytometer를 사용하여 총 세포 수를 결정)에 신선한 RPMI에서 ° C와 resuspend. 주사 (모든 솔루션 및 시약은 멸균 유지) 이전에 matrigel의 동일한 볼륨으로 섞는다. </li><li> 조달 6 주 이전 NCR 뉴 / 뉴 마우스, 2 주 알팔파 무료로 다이어트를을 유지하고 있습니다. [참고 :. 모든 동물 절차는 IACUC 승인해야합니다]의 피하 주입하여 종양 xenografts을 유발 5x10 6 cells/100 멸균 18 2분의 1 게이지를 사용하여 측면에서 μl / 종양 (2 종양 / 마우스)바늘. 정기적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하고 종양 20mm 3 (향후 12 일 이내)의 평균 볼륨으로 성장 할 수 있습니다. PBS와 VNP (N = 3 동물 / 그룹 / 시간 점) : 무작위로 두 개의 서로 다른 그룹에 쥐를 지정합니다. 1 ML 28 게이지 인슐린 주사기를 사용 정맥 주사 멸균 PBS의 꼬리 정맥 주입 100 μl 또는 10 밀리그램 / kg V​​NP 제제에 의해 관리 할 수​​ 있습니다. </li></ol> 참고 : 라이브 동물과 조직 문화 실험과 연구가 증명되지 않습니다. 손 -에 시범 조직 처리 및 데이터 수집으로 제한됩니다. HT-29 종양의 이종 이식 모델에서 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19 세 기술은 VNPs의 유도 종양을 평가하는 데 사용됩니다 : <ol start="4"><li> CO 2를 사용하여 다른 시간 지점 (2, 24, 72 시간)에 희생 마우스 : 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징가스. 측면에있는 종양과 함께 동물과 소비세 모든 주요 기관 (뇌, 심장, 폐, 비장, 신장, 간) 해부, parafilm에 조직을 배치하고, (800 밀리 노란색 여기와 방출 필터를 사용 형광 이미징 장비와 분석 조직에서 형광 신호 (VNPs에 복합 A647 레이블에서 파생)의 존재를 감지 노출). 이미지를 저장하고 ImageJ 1.44o 소프트웨어 (사용 형광 농도 분석 <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij을</a> ). 시간이 주요 조직과 종양의 VNPs의 이해의 패턴을 비교합니다. </li><li> 이미징 후, 반으로 각 조직을 잘라 cryo-sectioning 및 공 촛점 분석 10월 화합물에 반을 삽입 할 수 있습니다. 미리 무게 cryo-병에 나머지 절반을 수집하고 즉시 액체 N 2를 사용 동결. 스토어 -80 ° C에서 추가 처리를위한 준비가 될 때까지. </li><li> 형광 정량화 : 재코드는 조직 가중치를. 실온에서 냉동 조직을 해동하고 PBS 1 ML을 포함하는 별도의 50 ML 팔콘 튜브에 배치합니다. 휴대용 조직 균질를 사용하여 PBS에서 2-3 분을위한 조직을 균질화 한 후 microfuge 튜브에 homogenate를 전송합니다. 비 무균 조직을 제거하는 13,000 XG에서 10 분의 homogenates을 원심 분리기. </li><li> 384도 검은 색 UV 판에 각 그룹 (PBS 및 VNP 공법 / 시간 점)에서 조직의 표면에 뜨는의 Pipet 100 μl. 접시 리더를 사용하여 형광 강도를 (예 / EM 파장 665분의 600) 평가합니다. 조직 가중치에 의해 얻은 형광 값을 정상화. </li><li> Immunohistochemistry : -20 ° C.에 cryo-마이크로톰 섹션 (10 μm)와 상점을 준비 세포 핵 (DAPI)과 내피 세포 마커 (CD31 항체 안티 - 마우스 FITC-라벨)에 대한 조직 섹션을 청바지. 휘황 - 라벨 VNP의 혈관과 간 tumoral 현지화를 매핑 할 공 촛점 현미경 분석을 수행s입니다. </li></ol> 참고 :이 절차는 증명되지 않습니다 대리인 데이터는 그림 8에 표시됩니다. immunohistochemistry와 설명 착색 방법에 대한 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19

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<li>Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+novel+platform+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications.</a> Nano Lett. 10, 305-312 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+virus+particles+as+addressable+nanoscale+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).</li>
<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 프로토콜은 생체 종양 이미징에 대한 VNPs 및 응용 프로그램의 화학 조작을위한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 동물 형광 이미징, 형광 정량화 및 immunohistochemistry 기술 biodistribution을 공부하고 종양 추적 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 EPR 효과를 통해 종양에 나노 입자의 접근에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 다양한 분석 방법의 결과를 결합하여, 우리는 VNPs의 지역화와 biodistribution을 평가하기위한 강력한 방법을. 이러한 연구는 그러나 수행 할 수 있습니다 전에, 순수한 바이러스 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 이외에도 기계 접종에서 VNP 전파에 대한 가능한 대안은 높은 변화와 축적 속도를 가질 수 agroinfiltration입니다. VNPs를 전파 할 때주의가 별도의 t와 같은 다른 바이러스에 감염된 식물을 유지하기 이동해야합니다교차 오염을 방지 O. 특히, TMV는 ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;VNP 생산&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>실내 식물 생장 챔버</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; 종자 (California black-eye no. 5)</td><td>버피</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; 종자</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;N. benthamiana 종자는 Salk Institute에서 제공받았습니다. 종자는 식물 증식을 통해 생산됩니다.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>카보런덤</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX 배양토</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite 비료</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;장비&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50.2 Ti 로터</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 티타늄 로터</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 초고속 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 로터</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 병</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>SLA-3000 로터용</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 병</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>SS-34 로터용</td></tr><tr><td>초투명 튜브</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>수크로스 밀도 구배 및 SW 32 Ti 로터용</td></tr><tr><td>폴리카보네이트 병</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>펠릿팅 및 50.2 Ti 로터용</td></tr><tr><td>NanoDrop 분광광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 프리캐스트 겔 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) 크기 배제 크로마토그래피 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 크로마토그래프</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>벤치탑 원심분리기</td></tr><tr><td>크라이오스탯</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;생체 내(In vivo)&lt;/em&gt; 영상 시스템</td></tr><tr><td>조직 파쇄기</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>마이크로플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView 레이저 스캐닝 공초점 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;화학 물질 및 시약&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-에티닐아닐린</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>384-웰 블랙 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS 겔</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDS 샘플 버퍼</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 azide</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 카복실산, 숙신이미딜 에스테르</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 ml 원심분리 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>10 kDa 분자량 컷오프</td></tr><tr><td>아미노구아니딘 염산염</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>거름종이</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>P5 등급</td></tr><tr><td>FITC 표지 항-마우스 CD31 항체</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르빈산 나트륨염</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 글라스</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS 완충액</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>나노캡슐</td><td>PG1-ML-2k</td><td>분자량 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>나노결정</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>분자량 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>나노입자</td><td>PG1-SC-5k</td><td>분자량 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 succinimidyl ester 6-이성질체</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>p-톨루엔술폰산 일수화물</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>봉입제</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>인산수소칼륨</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>인산일칼륨</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 나트륨</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>아질산나트륨</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>아황산나트륨</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>TEM 그리드</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-메르캅토&amp;#8211;에탄올</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;조직 배양&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>혈구계수기</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>인산완충생리식염수(PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>트리판 블루</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>트립신, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, 액상</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;동물 실험&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>18% 단백질 설치류 사료</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>알팔파 제거 식이</td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28게이지</td></tr><tr><td>이소플루레인</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>매트리젤 매트릭스 기저막</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nu 마우스</td><td></td><td></td><td>CWRU 단과대학&lt;br/&gt; 의과대학 무균 동물 및 이종 이식 핵심 시설</td></tr><tr><td>멸균 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 게이지</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT 화합물</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

나노 소재의 사용은 재료 과학 및 의학에 혁명을 할 수있는 가능성이 있습니다. 현재, 서로 다른 나노 입자의 수​​는 이미징 및 치료에 응용 프로그램에 조사하고 있습니다. 식물에서 파생 바이러스 성 나노 입자 (VNPs)가 정의 크기와 모양으로 자기 조립 bionanomaterials으로 간주 할 수 있습니다. Steinmetz 연구실에서 조사중인 공장 바이러스는 직경 30 nm의 아르 둘 다 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)와 Brome 모자이크 바이러스 (BMV)에 의해 형성 icosahedral 입자가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 다음과 같은 식물 바이러스로부터 파생 된 막대 모양과 filamentous 구조를 개발하고 있습니다 : 18 나노 미터로 300 nm의 크기, 그리고 filamentous 입자 515를 형성 감자 바이러스 X (PVX)로 강성 봉을 형성 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 길이, 폭 13 나노 미터의 나노 미터는 (독자는 심판이 판결이라고합니다. VNPs에 대한 자세한 내용은 1, 2). planta에 대규모로 쉽게 제작 할 수 매우 안정적이고 biocompatible 있습니다. 또한, VNPs는 특히 유전자 변형 또는 화학 bioconjugation 방법 3을 사용 설계 할 수 있습니다 &quot;프로그램&quot;단위입니다. VNPs의 구조는 원자 해상도로 알려져 있으며, 수정은 원자 레벨 4, 현재의 최첨단 기술과 합성 나노 소재를 사용하여 달성 할 수없는 제어 수준의 공간적 정밀도로 수행 할 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 CPMV, PVX, TMV, 그리고 Vigna ungiuculata와 Nicotiana benthamiana 공장에서 BMV의 전파에 대해 설명합니다. 각 VNP에 대한 추출 및 정제 프로토콜은 주어집니다. 정화되고 화학적으로 라벨이 표시된 VNPs의 특성에 대한 방법은 설명되어 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 채널에 초점을emical fluorophores과 VNPs의 라벨 (예를 들면, 알렉사 형석 647) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 염료는 추적 및 5-10 VNPs의 확인을 용이하게하고, 자신의 pharmacokinetics 8,11을 향상하는 동안 PEG는 proteinaceous 나노 입자의 immunogenicity을 감소시킨다. 우리는 마우스 이종 이식 종양 모델을 사용 PEGylated VNPs의 유도 종양을 보여줍니다. 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 조직 예 생체의 형광 이미징, 균질 조직의 형광 정량화하고, 공 촛점 현미경의 조합이 biodistribution을 연구하는 데 사용됩니다. VNPs는 reticuloendothelial 시스템 (RES)를 통해 해제되며, 추적 종양이 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과를 통해 수동적으로 12 달성된다. VNP의 나노 기술은 강력한 플러그 앤 플레이 이미지에 기술하고 생체 내 질병의 사이트를 취급합니다. 우리는 더에 약물 cargos 및 임상 - 관련 영상 moieties뿐만 아니라 조직 별 리간드를 수행 할 VNPs를 개발하고 있습니다암과 심장 혈관 질환에 overexpressed 분자 수용체를 타겟팅합니다.

<img alt="식물 성장 비교 분석; 실험 설정, 잎 색 변화 연구, 황화 현상 방법." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="그림 1"> 
 그림 1. 식물 바이러스에 감염된 식물. CPMV에 감염된 Vigna unguiculata 식물 (A). PVX (B), TMV (C) 및 BMV (D)에 감염된 Nicotiana benthamiana 식물. 사진은 기계적 접종 후 약 10일째에 촬영되었습니다.
<img alt="흡광도 대 파장 그래프; 바이러스 비교: PVX, CPMV, BMV, TMV; 스펙트럼 분석." fo:content-width="3in" fo:...

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

나노 물질의 사용은 재료 과학과 의학에 혁신을 일으킬 잠재력을 가지고 있습니다. 현재 다양한 종류의 나노 입자들이...

본 절차의 전반적인 목적은 형광 표지된 바이러스 나노입자의 생체 내 종양 표적화 및 생체 분포를 연구하는 것입니다. 마우스 종양 모델에서 먼저 바이러스를 증식 및 정제한 후, 입자에 염료와 peg를 결합시킵니다. 기능화된 입자의 특성을 분석한 후, 종양 이식편이 있는 마우스에 이를 주입합니다.Maestro 이미징, 형광 강도, 조직 균질성 측정 및 면역형광 결과는 바이러스 나노입자가 종양 및 신체 전반의 다양한 장기에 국소화되었음을 보여줍니다. 나노입자 또는 BMP는 생의학 응용 분야에서 유망한 플랫폼입니다. 본 연구에서는 PLA VMP의 제작, 증식, 정제, 특성 분석 및 결합 공정에 대해 설명합니다.마지막으로, 말리노 이식 모델과 형광 이미징을 이용하여 종양 표적화 및 이미징을 위한 V mps의 응용 사례를 보여줍니다. 현재 이미징 및 치료 응용을 위해 다양한 나노입자가 연구되고 있습니다. 금속 또는 고분자 나노 재료와 같은 합성 재료보다 바이오 나노입자를 사용할 때의 주요 장점은 식물 유래 BMP가 균일하게 분산되어 있으며 그 구조가 원자 수준의 해상도로 알려져 있다는 점입니다.식물 바이러스는 분자 농업(molecular farming)을 통해 대량으로 생산될 수 있으며, 유전적 및 화학적 공학 모두에 적용 가능합니다. 본 시연에서는 형광체(fluorophores)와 PEG를 이용한 바이러스 나노입자의 화학적 수식 방법을 보여줍니다. 형광체는 이미징 향상을 위해 사용되며, PEG는 약동학적 특성을 개선하는 데 사용됩니다.화학적 수식을 통해 바이러스 나노입자에 치료제나 MRI와 같은 임상 영상 진단용 조영제를 탑재할 수 있습니다. 본 실험에서는 다른 나노입자와 마찬가지로 바이러스 나노입자의 생체 내 분포 연구를 입증하였습니다. 바이러스 나노입자의 종양 표적화는 수동적 종양 표적화로 설명되는 투과성 및 유지성 증가 효과(EPR effect)를 기반으로 합니다.우리는 최근 서로 다른 식물 바이러스의 생체 내 분포 프로파일이 뚜렷하게 다르다는 것을 발견했습니다. 이번 시연에서는 바이러스 나노 기술의 표준으로 간주되는 copy mosa virus를 사용하겠습니다. 우리는 식물 바이러스 유래 나노 물질을 개발하고 설계하며 연구하는 데 특히 관심을 두고 있습니다.저희 연구실은 Ed cow p mosaic virus, bro mosaic virus, rock shaped bacca mosaic virus 및 filamentous potato virus X가 포유류 시스템과 어떻게 상호작용하는지에 대한 근본적인 이해를 얻는 데 집중하고 있습니다. 구체적으로, 모양과 유연성이 EVO 특성에 어떤 영향을 미치는지, 그리고 조직 특이적 이미징 및 약물 전달과 같은 응용 분야에 맞게 이를 최적화하는 방법은 무엇인지 연구하고자 합니다. 본 원고에서는 kalp mosaic virus, potato virus X, brown mosaic virus 및 tobacco mosaic virus의 준비 과정을 상세히 다룹니다.Vic, Gil 및 Nicotiana의 기능화와 전임상 마우스 모델에서의 응용에 대해 설명합니다. 본 시연에서는 실내 배양 챔버 내에서 소 P 모자이크 바이러스를 사용하겠습니다. 화분당 소 P 종자 3개를 심으십시오.10일 차에, 카룸(carum) 가루를 얇게 뿌린 후 잎을 가볍게 문지르는 기계적 접종법을 사용하여 각 잎에 0.1 µg/µL의 CPMV를 감염시킵니다. 10일 후, 잎을 수확하여 -80 °C에서 보관합니다. 표준 블렌더를 사용하여 냉동된 잎 100 g을 2배 부피의 차가운 0.1 M 인산칼륨 완충액(pH 7)에 넣고 균질화한 뒤, 균질물을 세 겹의 치즈 천으로 걸러내고 5,500 G에서 20분 동안 원심분리합니다.상층액을 수집한 다음, 1:1 클로로포름과 1-부탄올 혼합액을 0.7 부피만큼 가하여 식물 조직의 유기 용매 추출을 수행하고, 혼합물을 최소 30분 동안 교반합니다. 해당 용액을 5,500 G에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층의 수용성 층을 수집하여 초원심분리합니다.160,000 G에서 3시간 동안 원심분리합니다. 그다음, 펠릿을 5 mL의 인산염 완충액에 재현탁하고 시료를 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 또한, 완충액에 10, 20, 30, 40% sucrose를 동일한 부피로 사용하여 10~40% sucrose 농도 구배를 준비합니다.가장 무거운 층을 먼저 배치하여 상온에서 하룻밤 동안 농도 구배를 평형화합니다. 재현탁된 펠렛을 수크로스 구배 위에 층적하고 100,000 G에서 2시간 동안 원심분리합니다. 광산란 밴드를 수집하고 버퍼로 투석하여, CPMV의 표면 리신 잔기에 2,500 molar equivalents의 Fluor와 4,500 equivalents의 NHS PEG를 결합시킵니다.반응물을 정제한 후, 나노드롭을 사용하여 2 µL의 시료의 흡광 스펙트럼을 측정하고 260, 280 및 651 nm에서의 값을 기록합니다. Superdex 6 size exclusion 컬럼과 ÄKTA Explorer를 이용한 크기 배제 고속 단백질 액체 크로마토그래피(size exclusion fast protein liquid chromatography)로 입자를 분석합니다. 0.1 M 인산칼륨 완충액 200 µL에 녹인 50~100 µg의 VNP 시료를 로딩합니다.pH 7.0에서 검출기를 핵산의 경우 260 nanometers로, 단백질의 경우 280 nanometers로 설정하십시오. 또한 부착된 염료의 흡광 파장도 설정하십시오. 0.5 milliliters per minute의 유속으로 72분 동안 분리를 수행하십시오.2:62:80 비율의 Ellucian 프로필은 반응의 순도와 V NPS가 완전히 조립되어 온전한 상태인지를 나타냅니다. 다음으로, 개별 외피 단백질(coat proteins)과의 접합을 분석하기 위해 변성 SDS 겔 전기영동을 준비합니다. 각 샘플에 대해, 9 µL의 인산칼륨 완충액에 희석된 10 µg의 입자에 3 µL의 4X LDS 샘플 버퍼를 첨가하고, 가열 블록에서 100 °C로 5분 동안 변성시킵니다.샘플을 SDS 젤에 로딩하고 200 V에서 1시간 동안 전기영동합니다. 1X MOPS 러닝 버퍼 내에서 백색광 하에 젤을 기록합니다. 염색 후, 이 바이러스 나노입자들은 이제 제노그라프트 마우스 모델을 이용한 종양 타겟팅 및 이미징에 사용할 준비가 되었습니다.일반적으로, 이러한 입자들을 투여하고 VN ps의 종양 표적 능력을 정맥 내로 평가하기 위해 꼬리 정맥 주사를 사용합니다. Maestro 형광 이미징 장비로 조직을 분석하십시오. 형광 정량을 위해 VN PS에 접합된 A 6 47 표지에서 유래한 형광 신호의 존재를 검출하도록 800 밀리초의 노출 시간과 황색 들뜸 및 방출 필터를 사용하십시오.PBS 내에서 조직을 2~3분 동안 균질화합니다. 그런 다음 각 시점별 PBS 및 VNP 제형에 해당하는 원심분리 튜브로 균질물을 옮깁니다. 샘플 100 µL를 384웰 블랙 UV 플레이트에 분주합니다. 들뜸 및 방출 파장을 600nm 및 665nm로 설정하여 형광 강도를 측정합니다.성공적인 VNP 증식 여부는 기계적 접종 약 일주일 후 잎에 모자이크 증상이 나타나는지로 판단할 수 있습니다. 입자의 순도는 UV-visible 분광법으로 평가할 수 있습니다. 260 nm에서의 흡광도는 핵산 농도에 비례하며, 280 nm에서의 흡광도는 단백질 농도에 비례합니다.VN PS의 이러한 크기 배제 용출 프로파일은 Superos six 컬럼과 ACTA purifier를 사용하여 얻었습니다. UV 가시광선 스펙트럼과 마찬가지로, A₂₆₀/A₂₈₀ 비율은 VNP 조제물의 순도를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 용출 프로파일을 통해 입자의 순도를 결정할 수 있습니다.SDS 겔 전기영동은 변성된 외피 단백질 서브유닛을 분리합니다. CPMV 입자는 42 kilodalton의 대형 단백질과 24 kilodalton의 소형 단백질이라는 두 가지 단백질로 구성됩니다. 참고: 바이러스 입자의 이 TEM 이미지들에서 소형 단백질은 두 가지 전기영동 형태로 나타납니다.TEM 그리드를 2% 아세트산 우라닐로 음성 염색하였으므로, 입자는 어두운 배경에서 밝게 보입니다. CPMV 입자의 크기는 30 nanometers입니다. 이후 V NPS는 생체 접합 화학을 통해 기능화할 수 있습니다.예를 들어, CPMV는 기능화된 NHS 에스테르와 반응하여 V NPS의 기능화를 확인하는 데 사용할 수 있는 라이신을 가지고 있으며, 정제된 입자에 대해 이전에 수행했던 것과 동일한 방법으로 특성 분석을 수행합니다. 이는 형광 표지 및 페길화된 VN ps의 대표적인 데이터입니다. 기능화된 입자는 이후 페길화 및 형광 표지된 VN ps를 이용한 생체 내 분포 및 종양 표적 성능 조사와 같은 하위 응용 분야에 활용될 수 있습니다.본 실험에서는 인간 HT 29 제노그라프트를 이식한 누드 마우스에서 CPMV의 생체 내 분포를 평가하며, 조직의 Maestro 이미징을 통해 생체 내 분포 및 종양 표적 능력을 평가합니다. Ex vivo 분석 결과, PBS 대조군에서는 형광이 관찰되지 않았습니다. 반면 6 47 및 peg가 접합된 CPMV의 경우, 망상내피계의 제거 작용으로 인해 간에서 뚜렷한 형광이 나타났으며 비장에서도 일부 형광이 관찰되었습니다.종양에서 두드러진 형광이 관찰되는 것은 투과성 및 유지력 증강(enhanced permeability and retention) 효과를 통한 종양 표적 기능을 나타냅니다. 이 정량적 데이터는 조직 무게로 표준화한 균질화 조직의 형광 측정을 통해 얻었습니다. 예상대로 데이터는 간과 비장에 의한 CPMV의 제거를 나타냅니다.CPMV는 종양에서도 검출되었습니다. 동결 절편 조직의 면역 염색을 이용한 추가적인 종양 내 국소화 분석을 통해 CPMV의 종양 내 국소화가 확인되었습니다. CPMV는 빨간색으로 표시되었습니다.파란색은 핵을 나타내며, 녹색은 anti CD 31로 염색된 혈관입니다. CPMV는 주로 종양의 혈관 주변에서 발견되었습니다. 설명된 기술들은 다양한 바이오 나노입자 시스템에 적용 가능성을 제공했습니다.Stein 연구실에서는 cow mosaic virus, bro mosaic virus, potato virus X 및 tobacco mosaic virus와 같은 VMP를 연구합니다. 하지만 이러한 방법론은 다른 바이러스 나노입자나 열충격 단백질과 같은 단백질 나노 구조체에도 적용될 수 있습니다. 이 절차 이후에 R-T-P-C-R 또는 Western Block과 같은 추가 방법을 독립적인 방법으로 수행할 수 있습니다.동결절편 제작 및 면역조직화학 염색을 통해 종양 내 v ps의 위치와 종양 관련 대식세포 또는 다른 세포 소기관과의 잠재적 공동 국소화에 대한 추가 정보를 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 바이러스 나노입자를 증식, 정제, 기능화 및 특성 분석하는 방법과 종양 마우스 모델을 사용하여 생체 내 분포를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

출처: Kim, BD, et al. 다형 교모세포종 동물 모델에서 올리고뉴클레오티드 페이로드의 나노입자 전달. J. Vis. 경험. (2024년)이 비디오는 교모세포종 보유 마우스에 치료용 나노입자를 정맥 주사하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 혈액-뇌 장벽을 가로질러 표적 전달을 가능하게 하고 뇌종양에서 나노입자 생체분포 및 치료 효능을 평가하기 위한 비침습적 이미징을 지원합니다.

쥐 교모세포종 모델에서 치료용 나노입자의 정맥 투여

이 비디오는 마우스 종양 이종 이식 모델에서 생체 내 항체 국소화를 위한 형광 이미징 방법을 보여줍니다. 그것은 피부 아래에 고체 이종 이식편을 생성하기 위해 마우스에 종양 세포를 주입하는 것을 포함합니다. 후속 형광 항체 주입은 종양 이종이식 세포 내에서 향상된 형광 신호를 통해 특정 국소화를 확인합니다.

마우스 종양 이종이식 모델에서 항체 국소화를 위한 In vivo Fluorescence Imaging

이 비디오는 마우스 모델에서 종양의 생체 내 이미징을 위한 방사성 면역접합체와 관련된 기술을 보여줍니다. 방사성 면역접합체를 주입하면 접합체의 항체는 암세포의 특정 막 항원에 결합합니다. 접합체의 방사성 추적자는 주변 전자와 상호 작용하여 에너지를 생성하는 양전자를 방출하며, 이는 양전자 방출 단층 촬영(PET) 스캐너에 의해 감지되어 종양의 이미지를 생성합니다.

방사선 표지된 항체를 사용하여 쥐 모델에서 종양을 감지하는 In Vivo PET 이미징 기술

이 문서 상세 종양 표적 나노 입자, HerDox의 광학 영상 분석을위한 절차에 대해 설명합니다. 특히, 표적 종양 침투를 평가 종양 검출을위한 멀티 이미징 장치에 대한 자세한 사용은 여기에 설명되어 있습니다.

표적으로 바이러스 성 단백질의 분석은 HER2 + 종양에 전달 나노 입자

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

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나노 의약품의 생체 내 성능에 대한 이해가 부족하여 임상 번역이 지연됩니다. 종양 보유 면역 능력이 있는 마우스에서 전신, 조직, 단세포 및 세포 내 수준에서 암 나노의약품의 생체 내 거동을 평가하는 절차가 여기에 설명되어 있습니다. 이 접근 방식은 연구자가 임상 번역을 위한 유망한 암 나노의약품을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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