Name: 게놈 전체 유전자 삭제할에 연쇄상 구균 sanguinis 높은 처리량 PCR에 의한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: 배우세요 Streptococcus sanguinis에서 고처리량 PCR을 이용한 게놈 전체 단일 유전자 삭제 방법을. 이 기법은 세균 유전학 및 유전자 기능 연구에 효율적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

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이 작품은 버지니아 커먼 웰스 대학의 대통령 연구 인센티브 프로그램 (PRIP) 144602-3 (PX)에 의해, 건강 (PX)의 국립 연구소에서 보조금 R01DE018138 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. 레이 첸, 게놈 전체 돌연변이의 건설을 지원에 Yuetan쪽으로 앉아야하고 왕을 Xiaojing. 우리는 또한 DNA 배열을 위해 버지니아 커먼 웰스 대학에서 DNA 핵심 시설 감사드립니다.

1. 프라이머 디자인 <ol><li> 프리 머은 S.에 따라 집 스크립트에서 사용 설계되어 있습니다 sanguinis SK36 게놈 시퀀스. 프리 머, F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트 대상 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 (km R) 단백질 (3) 및 (1)의 1 킬로바이트 상류 시퀀스의 증폭을 위해 설계되었습니다 각각 대상 유전자의-KB 하류 순서 (그림 1). 이러한 프리 머 가운데 F1 및 R3는 프로그램의 양각 스위트 룸 (에 ePrimer3를 사용하여 설계되었습니다 <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> 대상의 상류 또는 하류 측면을 노릴 지역을 확대하려면) 유전자. 유전자 특정 프리 머, R1 및 F3는 5 &#39;와 3&#39;대상 유전자의 시퀀스에 따라 설계되었습니다. R1과 F3 프리 머의 aphA-3에 보완의 5 &#39;끝에서 25-BP 어댑터 시퀀스를 포함유전자. 각 프라이머의 녹는 온도는 가장 가까운 가능한 60 ° C 96 - 웰 형식의 모든 PCR 반응에 대한 온도를 어닐링 유니폼의 사용을 활성화 할 수 있습니다. 할 수 있도록 설계되었습니다 </li><li> F1, R1, F3 및 R3 프리 머은 유전자 순서에 따라 96 - 웰 플레이트에 합성됩니다. 각 판은 동일한 유전자 순서 프리 머의 한 종류가 포함되어 있습니다. 채널 피펫을 사용하여 PCR 증폭을위한 10 μm의 최종 농도로 96 - 웰 작동 프라이머 판에서 프리 머를 희석. </li></ol> 2. 높은 처리량 PCR 증폭 및 정화 <ol><li> 높은 처리량 증폭하려면 1 킬로바이트 상류 또는 대상 S.의 하류 sanguinis의 유전자는 1640 μl ddH 2 O, 250 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 200 μl, 50 MM 100 μl MgSO 4, 100 μl를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 얼음에 PCR 칵테일 혼합을 조립 10 μl / NG S. sanguinis SK36 게놈의 DNA와 10 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매 DNA polyme새기다 고 충실도 및 전송 채널 피펫을 사용하여 96 - 웰 PCR 플레이트의 각도에 혼합물의 23 μl. 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트에 프라이머 플레이트 작업 10 μM에서 각각 F1과 R1 (또는 F3와 R3) 1 μl를 전송합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 1.5 분 30 초 및 68 ° C에 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 54 ° C에 94 ° C에서 증폭을 수행합니다. </li><li> 1퍼센트 아가로 오스 겔 48 우물 피팅 멀티 채널 피펫 로딩과 ethidium 브로마이드를 포함하는 준비. 96 - 웰 플레이트에 5xDNA 로딩 버퍼 1 μl를 갖춘 4 μl PCR 제품을 섞어서 10 μl 다 채널 피펫을 사용하여 아가로 오스 겔에서 샘플을로드합니다. 30 분에 135 V의 전기를 실행합니다. UVP 문서 및 분석 체제에서 젤에 밴드를 검사합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 원심 분리를 사용하여 PureLink 96 PCR 정화 키트하여 PCR 제품을 정화. DNA를 용출를 들어, B의 잘 40 μl 멸균 ddH 2 O를 추가 할판을 inding. </li><li> 무작위로 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 검사하기 위해 접시에 몇 정화 amplicons을 선택합니다. 접시에 amplicons의 농도를 조정하려면 ~ μl / 10 NG. </li><li> 플라스미드 포함 킬로미터 연구 카세트는 PCR 템플릿으로 EcoR I을 사용하여 소화하고 있습니다. 소화 플라스미드는 QIAquick PCR 정화 키트에 의해 정화되고 선형 플라스미드 DNA는 최종 DNA 농도로 10 NG / μl를 조정됩니다. SO 16.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함 킬로미터 연구 카세트 amplicon 25 μl 혼합물을 조립 4, 10 μM F2, 1 μl 1 μl 10 μM의 R2, 1 μl 선형 플라스미드 DNA와 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 고 충실도. ° C 1 분 30 초 68 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 55 ° C에 94 ° C에서 PCR 증폭을 수행합니다. 1퍼센트 아가로 오스의 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 검사합니다. 푸QIAquick PCR 정화 키트로 10 개인 PCR 정화의 km R 카세트 amplicon의 라 일괄. 10 NG / μl로 amplicon 농도를 조정합니다. </li><li> 최종 선형 재조합 PCR의 amplicon을 구하려면 세 PCR의 amplicons은 잘 PCR 템플릿과 같은 하나 PCR 플레이트의 각 1 μl (거의 동등한-몰 양에서)과 결합되어 있습니다. 다른 PCR 구성 요소는 SO 14.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함한 추가됩니다 4, 10 μM의 F1 1 μl, 10 μM R3의 1 μl, 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 높은 충실도를. PCR 증폭은 4 분에 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 30 초 및 68 ° C 30 초 55 ° C에서 2 분, 94의 30주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다. </li><li> 아가로 오스 겔에서 PCR amplicons를 검사합니다. 정화하고 위에 설명 된대로 PCR의 amplicons을 수량화. -20 ° C.에서 재결합 PCR의 amplicons를 고정 </li></ol> 3. COMpetent 셀 준비 <ol><li> 토드 휴이트 국물이 준비되어 상온으로 냉각 및 0.22 μm의 폴리스티렌 필터 4를 사용 소독 한 후 끓여야하고 가열 10 N NaOH를 사용하여 7.6로 조정 산도. TH + HS 매체를 만회하기 위해 15 ML 원뿔 튜브에 11.7 ML 토드 휴이트 국물에 300 μl 열 inactivated 말 커를 (2.5 %까지 최종 농도)를 추가합니다. 나누어지는의 TH + HS 중간이 ML 튜브 10 ML에. </li><li> 주식 S. 5 μl의 예방 sanguinis SK36 2 ML의 TH + HS 매체에 -80 ° C에서 냉동 37에 단단히 상한과 밤 문화를 길러 10 ML-TH + HS 관을 미리 잠복기와 함께 ° C,.에게 </li><li> 박 한 후, 10 ML TH + HS에 50 μl 문화를 전송하고 3 시간 (0.07-0.08의 OD 660에 해당)를 37 ° C에서 관을 길러 즉시 변환을 위해 사용합니다. </li></ol> 4. 셀 변환과 항생제 선택 <ol><li> 70 NG S. 2 μl를 추가합니다 sanguinis SK36 competence 자극 펩타이드 (CSP)과 37 번 블록 96 - 웰하고 사전에 따뜻한에서 Eppendorf 튜브 2 μl 선형 재조합 PCR amplicon (~ 50 NG) ° C. 각 튜브에 3 시간 - incubated SK36 문화의 330 μl를 전송합니다. 1 시간에 37 ° C에서 알을 품다. 제어 등의 살균 ddH 2 O와 DNA를 교체하십시오. </li><li> 얼음 블록을 놓고, 500 μg / ML의 kanamycin과 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트의 각 변형 100 μl을 알리십시오. microaerobic 조건 하에서 2 D에 37 ° C에서 접시를 품다. </li></ol> 5. 돌연변이 확인 및 저장 <ol><li> 각 교체 돌연변이를 들어, 무작위, 2 개인 식민지을 데리러 오 ML BHI가 500 μg / ML의 kanamycin을 포함하는으로 식민지의 예방 및 37에서 microaerobically 밤 inoculum을 품어 ° C. -80에서 30 % 글리세롤에있는 각 문화를 Cryopreserve ° C </li><li> 예상 유전자 교체를 포함하는 돌연변이가 식민지 각 돌연변이 사용하는 F1에 대한 PCR 및 R3을 수행 여부를 검사하려면96 - 웰 PCR 판에서 프리 머. 개별 식민지에서 약 1 μl 밤 문화는 25 μl PCR-증폭 반응에서 DNA 템플릿으로 사용됩니다. PCR는 ° C 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 4 분에 30 초 및 68에 30 초, 55 ° C에 5 분, 94의 35주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다. </li><li> 정확하게 이중 대역 돌연변이 나 오염 물질 PCR의 amplicon을 확인하려면 ethidium의 브로마이드 착색과&gt; 12cm 길이 2% 아가로 오스 겔에서 4 시간에 전기 영동하여 PCR amplicon을 확인합니다. 이 아가로 오스 겔 전기 영동 조건에서 ≥ 100 BP의 차이가있는 모든 amplicons은 분명하게 식별되었습니다. km의 R 카세트의 증폭 및 야생 형 유전자에서 발생하는 밴드는 내부 T1의 프라이머는 야생 형 유전자는 PCR에 의해 검출 될 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다 &lt;100 BP에 의해 차이가 예상하는 경우. </li><li> 추가로 삭제를 확인하려면 amplicons는 PureLink 96 PCR 정화 키트에 의해 정화되고있는 P1의 프라이머를 사용하여 순서가 아르km의 R 카세트에 바인딩합니다. 시퀀싱에 의해 확인 만 정확한 돌연변이세요. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

초기 뇌관이 설계하면서 이웃 유전자에 대한 외인성 항생제 유전자과 하나가 타겟 유전자의 교체 가능한 극성 효과를 최소화하기 위해 두 단계 이동합니다. 삭제 된 유전자의 대부분은 프리 머 R1과 F3는 사전 정지 코돈 30 BP로 시작 코돈에 따라 6 BP에서 코딩 영역을 삭제할 수 있도록 설계되었습니다. 지난 30 기본 쌍은 인접 하류 유전자에 의해 사용 가능성 ribosomal 구속력이 사이트를 보호하기 위해 유지됩니다. 두 이웃 유전자 사이의 보존 지역은 그들이 반대 방향에있는 때 100 BP로 확장하고 두 단백질의 N-말단은 잠재적 인 프로모터 영역을 삭제 방지하기 위해 서로 가깝습니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 유전자 삭제 5 재조합 구조에서 제외됩니다. ribosomal 바인딩 사이트 번역 aphA-3 유전자 도입된다. 우리의 전략을 테스트하기 위해, 우리는 무작위로 다음 96 allelic 교환 뮤턴트 10 구축합니다. 우리는 O발기인 - 이하 aph...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 #</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트 (선택 사항)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 F2</td&gt;<td&gt; 통합 DNA 기술</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 R2</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 F2p</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 P1</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 P2</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; 순서 : NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA의 중합 효소</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; 플래티넘 DNA 형성 촉매 효소 DNA 고 충실도</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; 뉴 잉글랜드 Biolabs 주식회사</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; 제한 효소</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 한천</td&gt;<tdBioanalytical&gt; 미국</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아가로 오스</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; 뇌 하트 주입</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; km</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH 국물</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; 토드 휴이트 국물</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR 정화 키트</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28,106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR 정화 키트</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 필터</td&gt;<td&gt; 코닝</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0.22 μm의 폴리스티렌 필터</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat 시스템</td&gt;<td&gt; 마트 미생물 BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat 마크 II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Benchtop의 원심 분리기</td&gt;<td&gt; 열 과학</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall 전설 RT 플러스 microplate 회</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 젤 문서</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc - 이건 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 보육</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; 11-690 - 625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet의 젤 XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet의 젤 XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifuge 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 멀티 채널 피펫</td&gt;<td&gt; 열 Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 열 자전거 타는 사람</td&gt;<td&gt; 응용 Biosystems 주식회사</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR 시스템 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 pcr에 의한

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis 및 단일 유전자 삭제 박테리아 1,2의 게놈 전체 유전자 녹아웃에 적용된 두 가지 방법이 있습니다. transposon의 mutagenesis이 적은 시간이 소요 적은 비용이 많이 드는, 그리고 완성 된 게놈 정보를 요구하지 않습니다하지만,이 방법은 두 약점이 있습니다 : 감소 경쟁과 뮤턴트 카운터 선택하는 혼합 돌연변이 라이브러리의 서로 다른 돌연변이 (1) 가능성, (2) 일부 유전자 불 활성화의 가능성은 상기 유전자가 완전히 transposon의 삽입에 따라 자신의 기능을 잃게하지 않습니다. 단일 유전자 삭제 분석 transposon의 mutagenesis와 관련된 단점을 보완 할 수 있습니다. 게놈 전체의 단일 유전자 삭제의 효율성을 개선하기 위해, 우리는 모델 생물로 연쇄상 구균의 sanguinis를 사용하여 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 대한 높은 처리량 기술을 확립하려고합니다. 각 유전자 삭제 S.에 구축 sanguinis 게놈는 1을 구성하도록 설계되었습니다타겟 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 단백질, 그리고 타겟 유전자의 1 이하 하류-KB 상류. 프리 머 F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트를 각각 설계, 각 삭제 그 세 가지 구성 요소 구성의 PCR-amplifications을위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 합성됩니다. 프리 머 R1과 F3는 5 &#39;끝 부분에있는 aphA-3 유전자의 지역에 보완 25 BP 시퀀스가 포함되어 있습니다. aphA-3 유전자의 대규모 PCR 증폭은 모든 단일 유전자 삭제 구조를 만드는 한 번 수행됩니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 처음 kanamycin 카세트의 잠재력 극성 효과를 최소화하기 위해 제외됩니다. 유전자 삭제 구조를 만들려면, 높은 처리량 PCR의 증폭 및 정화는 96 - 웰 플레이트 형식으로 수행됩니다. 각 유전자 삭제에 대한 선형 재조합 PCR의 amplicon는 고 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 네 PCR 반응을 통해 구성됩니다. 초기 exponS.의 ential 성장 단계 2.5 % inactivated 말 혈청이 PCR-재조합 구조의 변화에 대한 능력을 향상하는 데 사용됩니다와 토드 휴이트 국물에 배양 sanguinis이 보충. S.의 조건, 최대 20 % sanguinis 세포는 DNA의 ~ 50 NG를 통해 변환 할 수 있습니다. 이 방법에 따라, 단일 유전자 삭제로 2048 뮤턴트은 궁극적으로 S.에있는 2,270 유전자에서 얻은되었습니다 네 유전자 ORFs 제외 sanguinis은 S.의 다른 ORFs 내에 완전히 포함 sanguinis SK36 218 가능성이 필수적인 유전자. 유전자 삭제 구조를 만드는 방법에 대한 기술은 높은 처리량이며, 모든 transformable 박테리아 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 사용하기 쉬운 될 수 있습니다.

후 PCR의 프리 머 F1과 R1을 사용하여 증폭하고, F3 및 R3, 각 S. 약 1 킬로바이트 업스트림 및 다운 스트림 sanguinis 유전자는 96도 형식은 각각 (그림 2A)에서 얻은되었습니다. 우리의 PCR 조건 및 사용하여 설계 프리 머에서 특정 제품 S.에서 증폭 된 각 PCR 반응에 sanguinis 게놈 DNA. 이 결과는 프리 머은 S.의 목표에 매우 구체적인이었다 표시 sanguinis. PCR을 통해 F1과 R3 프리 머와 DNA 템플릿, 선형 재조합 PCR 구조 (~ 3 KB) 3 개 amplicons을 사용하여 재 증폭은 높은 처리량 각 대상 유전자, kanamycin의 상류 지역으로 구성 96 - 웰 플레이트에 만들어졌습니다 카세트, 그 순서 (그림 2B)의 각 대상 유전자의 지역 하류. 재조합 PCR 구조는 다음 S.로 변환 ...

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는 설립되었습니다<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 모델 생물로. 이 방법은 높은 처리량 재조합 PCRs 및 변환을 통해 달성했다.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

트랜스포존 돌연변이 유발과 단일 유전자 결손은 박테리아의 전유전체 유전자 녹아웃에 적용되는 두 가지 방법입니다 1,2. 트랜스포존 돌연변이 유발은 ...

본 절차의 전반적인 목표는 고효율 PCR을 통해 streptococcus sanguine의 게놈 전반에 걸쳐 단일 유전자 결손을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 고효율 PCR 증폭을 통해 항생제 내성 유전자를 포함하여 표적 유전자의 상류 및 하류 DNA 서열까지 총 3개의 앰플리콘(amplicon)을 확보함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이 3개의 PCR 앰플리콘을 템플릿으로 사용하여 선형 재조합 PCR 앰플리콘을 얻는 것입니다.다음으로, 수용성 s sanguine 세포를 준비합니다. 마지막 단계는 선형 재조합 PCR 증폭 산물을 수용성 s sanguineous 세포로 형질전환하는 것입니다. 최종적으로 colon A PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱을 통해 정확한 돌연변이체를 검증합니다.자살 플라스미드(suicide plasmid) 녹아웃과 같이 기존에 사용되던 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 고처리량을 통해 게놈 전반의 결손 돌연변이체를 직접 생성할 수 있다는 점입니다. PCR 프라이머는 streptococcus sanguineous SK 36 게놈 서열을 기반으로 한 내부 스크립트를 사용하여 서면 프로토콜에 기술된 대로 설계 및 합성할 수 있습니다. 타겟 유전자의 상류 1 kb 서열, A PHA 3 유전자 ENC 코딩, 카나마이신 내성 단백질, 그리고 타겟 유전자의 하류 1 kb 서열을 증폭하기 위해 세 세트의 프라이머가 설계되었습니다.유전자 특이적 프라이머. R1 및 F3는 표적 유전자의 5' 및 3' 서열을 기반으로 설계되어, 표적 S. sanguine genes의 상류 또는 하류 1 kb 영역을 고효율로 증폭합니다. 먼저 15 mL 원추형 튜브에 PCR 칵테일 혼합물을 얼음 위에서 조제합니다.s sanguineous 게놈 DNA를 포함하는 PCR 혼합물의 성분은 본문을 참조하십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 혼합물 23 µL를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 표적 유전자의 상류 서열을 위해, 멀티채널 피펫을 사용하여 10 µM 농도의 작동 프라이머 플레이트에서 F1 및 R1 프라이머를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트로 옮깁니다. 표적 유전자의 하류 서열을 증폭하기 위해 F3 및 R3 프라이머에 대해서도 동일하게 수행합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 94 °C에서 1분 동안 증폭을 수행한 후, 94 °C에서 30초 동안 30회 사이클을 반복합니다.54 °C에서 30초, 68 °C에서 1.5분 동안 반응시킵니다. 증폭 후, multichannel pipette 로딩에 적합한 48개 웰이 포함되고 bromide가 함유된 1% agarose 겔을 준비합니다. PCR 산물 4 µL를 5X DNA loading buffer 1 µL와 혼합합니다.96-웰 플레이트의 aros gel에 10 µL 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘플을 로딩합니다. 135 V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다. UVP 문서화 및 분석 시스템을 사용하여 겔의 밴드를 확인합니다.제조사의 DNA 용출 지침에 따라 원심분리를 이용하여 PureLink™ 96 PCR Purification Kit로 PCR 산물을 정제합니다. 바인딩 플레이트의 각 웰에 멸균된 2차 증류수 40 µL를 첨가합니다. 플레이트에서 정제된 앰플리콘을 무작위로 몇 개 선택하여 DNA 농도를 확인합니다.NanoDrop 분광광도계를 사용하여 플레이트 내 증폭산물의 농도를 약 10 ng/µL로 조정합니다. 다음으로, PCR 템플릿으로 사용할 수 있도록 kanamycin 내성 카세트가 포함된 플라스미드를 Eco RI로 제한효소 처리합니다. QIAquick PCR purification kit를 사용하여 제한효소 처리된 플라스미드를 정제하고, 선형 플라스미드 DNA의 최종 농도를 10 ng/µL로 조정합니다.서면 절차에 기재된 F two 및 R two 프라이머를 포함하여, kanamycin 저항성 카세트 앰플리콘을 위한 25 µL PCR 혼합물을 준비하십시오. 이 비디오의 안내에 따라 PCR 증폭을 수행하십시오. PCR 산물을 확인하기 위해 1% agarose 겔에서 겔 전기영동을 수행하십시오.그런 다음 PCR 정제된 개체 10곳에서 얻은 cany 내성 카세트 증폭산물을 대량으로 모읍니다. 증폭산물의 농도를 10 nanograms per microliter로 조정합니다. 이 절차에서 가장 까다로운 단 하나의 부분은 세 가지 PCR 증폭산물로부터 최종적인 선형 능력을 갖춘 PCR 증폭산물을 얻는 것입니다.성공적인 결과를 위해, 세 가지 PCR 신청자 터를 거의 동일한 양으로 조정합니다. 10 nanogram per microliter 농도의 PCR aons 세 종류를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트에 넣고 PCR 템플릿을 함께 추가합니다. 그런 다음 서면 절차에 기재된 대로 F1 및 R three 프라이머를 포함하여 PCR 혼합물을 준비합니다.다음으로, 샘플의 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 증폭 산물을 정제 및 정량한 후, agarose gel에서 PCR 증폭 산물을 확인합니다. 이전과 마찬가지로, 재결합된 PCR 증폭 산물을 -20 °C에서 냉동 보관합니다.먼저, 본 영상에 제공된 서면 절차에 따라 Todd Hewitt 및 말 혈청 배지를 준비합니다. 15 mL 원심분리관 두 개에 배지를 각각 2 mL와 10 mL씩 분주합니다. -80 °C에서 냉동 보관했다가 해동한 s sanguine SK 36 스톡 5 µL를 2 mL 배지에 접종합니다. 뚜껑을 단단히 닫은 배양액을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.또한 하룻밤 배양 후 동일한 조건에서 10 milliliter 배지 튜브를 미리 예열하십시오. 배양액 50 microliters를 10 milliliter 배지 튜브로 옮깁니다. 튜브를 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양하십시오.배양 직후, 96-웰 블록에 놓인 각 튜브에 70 ng/mL의 SK 36 능력 자극 펩타이드 2 µL와 선형 재조합 PCR 증폭 산물 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 예열합니다. 3시간 동안 배양한 SK 36 배양액 330 µL를 각 튜브에 옮깁니다. 대조군으로는 DNA 대신 멸균 2중 증류수를 사용합니다.배양 후 튜브를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 블록을 얼음에 놓은 뒤, 각 형질전환물을 500 µg/mL의 kanamycin이 포함된 brain heart infusion 또는 BHI 한천 배지에 100 µL씩 도말합니다. 플레이트를 미호기성 조건의 37 °C에서 2일 동안 배양합니다. 각 대체 돌연변이체에 대해 무작위로 2개의 단일 콜로니를 선택하여, 500 µg/mL의 kanamycin이 포함된 5 mL의 BHI에 각각 접종합니다. 각 접종물을 미호기성 조건의 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.각 배양물을 30% glycerol에 넣어 -80 °C에서 냉동 보존하십시오. 돌연변이체에 예상되는 유전자 치환이 포함되어 있는지 확인하기 위해, 96-well PCR 플레이트에서 F1 및 R3 프라이머를 사용하여 각 돌연변이체에 대해 colony PCR을 수행하십시오.각 개별 콜로니에서 배양한 overnight culture 약 1 µL를 25 µL PCR 증폭 반응의 DNA 템플릿으로 사용합니다. 돌연변이 유전자 치환을 확인하여 이중 밴드 돌연변이 또는 오염된 PCR 증폭물을 정확하게 식별하기 위해 PCR 증폭을 수행합니다. 12 cm 이상의 길이를 가진 젤에서 4시간 동안 전기영동을 통해 PCR 증폭물을 분석합니다.본 agarose 겔 전기영동 조건에서 bromide 염색을 거친 2% agarose 겔을 사용합니다. 100 base pair 이상의 차이가 나는 amplicons는 명확하게 식별할 수 있습니다. 반면, kanamycin 저항성 카세트와 야생형 유전자의 증폭으로 인해 생성된 밴드의 차이가 100 base pairs 미만일 것으로 예상되는 경우에는, 표적 유전자의 내부 T one primer를 사용하여 PCR로 야생형 유전자가 검출되는지 확인하십시오.결실을 추가로 확인하기 위해, pure link 96 PCR purification kit를 사용하여 증폭 산물을 정제하고 kanamycin 내성 카세트에 결합하는 P one 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 수행한다. 상류 서열을 위한 F1 및 R one 프라이머와 하류 서열을 위한 F three 및 R three 프라이머를 사용한 PCR 증폭 후, 시퀀싱으로 확인된 정확한 돌연변이체만을 선별하여 유지한다. 설계된 프라이머와 PCR 조건을 사용하여 96-well 포맷으로 각 s sanguineous 유전자의 상류 및 하류 약 1kb 서열을 얻었다.각 PCR 반응에서 s sanguineous 게놈 DNA로부터 특정 산물이 증폭되었으며, 이는 F1 및 R3 프라이머를 사용한 PCR 재증폭을 통해 DNA 템플릿으로 세 개의 앰플리콘을 사용함으로써 프라이머가 s sanguine의 표적으로 매우 특이적임을 나타냈습니다. 선형 재조합 PCR 컨스트럭트가 고효율로 제작되었습니다. 각 표적 유전자 상위 영역, cany 카세트, 그리고 각 표적 유전자 하위 영역이 순서대로 구성된 96웰 플레이트에서, 재조합 PCR 컨스트럭트를 s sanguine SK 36에 형질전환한 후 BHI 한천 배지에서 cany로 선택하였습니다.대부분의 형질전환에서, 미호기성 상태로 2일간 배양한 후 각 플레이트에서 1000개 이상의 콜로니가 얻어졌습니다. 이러한 콜로니들을 F1 및 R three를 사용하여 PCR 증폭시킨 결과, 잠재적 필수 유전자를 결실시키고자 했을 때 젤 전기영동을 통해 예상되는 돌연변이 크기에 해당하는 단일 DNA 밴드가 관찰되었습니다. 일부 필수 유전자의 결실을 위한 대부분의 형질전환에서는 콜로니가 얻어지지 않아야 합니다.그러나 이러한 콜로니들을 F1 및 R 프라이머로 PCR 증폭하여 형질전환 후 확인한 결과, 젤 전기영동에서 기대되는 돌연변이 크기와 야생형 크기에 해당하는 3개의 2D NA 밴드가 나타났습니다. 일부 돌연변이체의 경우, PCR 증폭산물의 기대 돌연변이 크기와 야생형 크기가 너무 비슷하여 긴 아가로스 젤로 분리할 수 없었습니다. 이 경우, 야생형 유전자 서열을 기반으로 표적 유전자의 내부 T one 프라이머를 설계하였습니다.내부 T one 프라이머와 F1 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였습니다. 야생형 SK 36을 본 PCR의 양성 대조군 균주로 사용하였습니다. 내부 프라이머를 사용하여 돌연변이체로부터 예상 크기의 밴드가 증폭된 경우, 해당 유전자를 필수 유전자로 식별하였습니다.P1 프라이머를 이용한 DNA 시퀀싱을 통해 돌연변이체 내의 can mycin 카세트 존재가 이전에 확인되었습니다. 이 프로토콜을 바탕으로 2,048개의 비필수 S sanguineous 유전자 돌연변이체가 수집되었습니다. 이때 다른 오픈 리딩 프레임 내에 완전히 포함된 4개의 오픈 리딩 프레임은 제외되었습니다.실험 조건하에서 s sanguine의 생존에 필수적인 218개의 유전자가 확인되었습니다. 이 영상들을 시청하신 후에는 고처리량 PCR을 이용하여 어떻게 게놈 전체의 유전자 녹다운을 수행하는지에 대해 충분히 이해하셨으리라 생각합니다.

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여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

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여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

배우세요 Streptococcus sanguinis에서 고처리량 PCR을 이용한 게놈 전체 단일 유전자 삭제 방법을. 이 기법은 세균 유전학 및 유전자 기능 연구에 효율적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

게놈 전체 유전자 삭제할에

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