게놈 전체 유전자 삭제할에

본 절차의 전반적인 목표는 고효율 PCR을 통해 streptococcus sanguine의 게놈 전반에 걸쳐 단일 유전자 결손을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 고효율 PCR 증폭을 통해 항생제 내성 유전자를 포함하여 표적 유전자의 상류 및 하류 DNA 서열까지 총 3개의 앰플리콘(amplicon)을 확보함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이 3개의 PCR 앰플리콘을 템플릿으로 사용하여 선형 재조합 PCR 앰플리콘을 얻는 것입니다.

다음으로, 수용성 s sanguine 세포를 준비합니다. 마지막 단계는 선형 재조합 PCR 증폭 산물을 수용성 s sanguineous 세포로 형질전환하는 것입니다. 최종적으로 colon A PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱을 통해 정확한 돌연변이체를 검증합니다.

자살 플라스미드(suicide plasmid) 녹아웃과 같이 기존에 사용되던 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 고처리량을 통해 게놈 전반의 결손 돌연변이체를 직접 생성할 수 있다는 점입니다. PCR 프라이머는 streptococcus sanguineous SK 36 게놈 서열을 기반으로 한 내부 스크립트를 사용하여 서면 프로토콜에 기술된 대로 설계 및 합성할 수 있습니다. 타겟 유전자의 상류 1 kb 서열, A PHA 3 유전자 ENC 코딩, 카나마이신 내성 단백질, 그리고 타겟 유전자의 하류 1 kb 서열을 증폭하기 위해 세 세트의 프라이머가 설계되었습니다.

유전자 특이적 프라이머. R1 및 F3는 표적 유전자의 5' 및 3' 서열을 기반으로 설계되어, 표적 S. sanguine genes의 상류 또는 하류 1 kb 영역을 고효율로 증폭합니다. 먼저 15 mL 원추형 튜브에 PCR 칵테일 혼합물을 얼음 위에서 조제합니다.

s sanguineous 게놈 DNA를 포함하는 PCR 혼합물의 성분은 본문을 참조하십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 혼합물 23 µL를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 표적 유전자의 상류 서열을 위해, 멀티채널 피펫을 사용하여 10 µM 농도의 작동 프라이머 플레이트에서 F1 및 R1 프라이머를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트로 옮깁니다. 표적 유전자의 하류 서열을 증폭하기 위해 F3 및 R3 프라이머에 대해서도 동일하게 수행합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 94 °C에서 1분 동안 증폭을 수행한 후, 94 °C에서 30초 동안 30회 사이클을 반복합니다.

54 °C에서 30초, 68 °C에서 1.5분 동안 반응시킵니다. 증폭 후, multichannel pipette 로딩에 적합한 48개 웰이 포함되고 bromide가 함유된 1% agarose 겔을 준비합니다. PCR 산물 4 µL를 5X DNA loading buffer 1 µL와 혼합합니다.

96-웰 플레이트의 aros gel에 10 µL 멀티 채널 피펫을 사용하여 샘플을 로딩합니다. 135 V에서 30분 동안 전기영동을 수행합니다. UVP 문서화 및 분석 시스템을 사용하여 겔의 밴드를 확인합니다.

제조사의 DNA 용출 지침에 따라 원심분리를 이용하여 PureLink™ 96 PCR Purification Kit로 PCR 산물을 정제합니다. 바인딩 플레이트의 각 웰에 멸균된 2차 증류수 40 µL를 첨가합니다. 플레이트에서 정제된 앰플리콘을 무작위로 몇 개 선택하여 DNA 농도를 확인합니다.

NanoDrop 분광광도계를 사용하여 플레이트 내 증폭산물의 농도를 약 10 ng/µL로 조정합니다. 다음으로, PCR 템플릿으로 사용할 수 있도록 kanamycin 내성 카세트가 포함된 플라스미드를 Eco RI로 제한효소 처리합니다. QIAquick PCR purification kit를 사용하여 제한효소 처리된 플라스미드를 정제하고, 선형 플라스미드 DNA의 최종 농도를 10 ng/µL로 조정합니다.

서면 절차에 기재된 F two 및 R two 프라이머를 포함하여, kanamycin 저항성 카세트 앰플리콘을 위한 25 µL PCR 혼합물을 준비하십시오. 이 비디오의 안내에 따라 PCR 증폭을 수행하십시오. PCR 산물을 확인하기 위해 1% agarose 겔에서 겔 전기영동을 수행하십시오.

그런 다음 PCR 정제된 개체 10곳에서 얻은 cany 내성 카세트 증폭산물을 대량으로 모읍니다. 증폭산물의 농도를 10 nanograms per microliter로 조정합니다. 이 절차에서 가장 까다로운 단 하나의 부분은 세 가지 PCR 증폭산물로부터 최종적인 선형 능력을 갖춘 PCR 증폭산물을 얻는 것입니다.

성공적인 결과를 위해, 세 가지 PCR 신청자 터를 거의 동일한 양으로 조정합니다. 10 nanogram per microliter 농도의 PCR aons 세 종류를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트에 넣고 PCR 템플릿을 함께 추가합니다. 그런 다음 서면 절차에 기재된 대로 F1 및 R three 프라이머를 포함하여 PCR 혼합물을 준비합니다.

다음으로, 샘플의 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 증폭 산물을 정제 및 정량한 후, agarose gel에서 PCR 증폭 산물을 확인합니다. 이전과 마찬가지로, 재결합된 PCR 증폭 산물을 -20 °C에서 냉동 보관합니다.

먼저, 본 영상에 제공된 서면 절차에 따라 Todd Hewitt 및 말 혈청 배지를 준비합니다. 15 mL 원심분리관 두 개에 배지를 각각 2 mL와 10 mL씩 분주합니다. -80 °C에서 냉동 보관했다가 해동한 s sanguine SK 36 스톡 5 µL를 2 mL 배지에 접종합니다. 뚜껑을 단단히 닫은 배양액을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

또한 하룻밤 배양 후 동일한 조건에서 10 milliliter 배지 튜브를 미리 예열하십시오. 배양액 50 microliters를 10 milliliter 배지 튜브로 옮깁니다. 튜브를 37 degrees Celsius에서 3시간 동안 배양하십시오.

배양 직후, 96-웰 블록에 놓인 각 튜브에 70 ng/mL의 SK 36 능력 자극 펩타이드 2 µL와 선형 재조합 PCR 증폭 산물 2 µL를 첨가하고 37 °C에서 예열합니다. 3시간 동안 배양한 SK 36 배양액 330 µL를 각 튜브에 옮깁니다. 대조군으로는 DNA 대신 멸균 2중 증류수를 사용합니다.

배양 후 튜브를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 블록을 얼음에 놓은 뒤, 각 형질전환물을 500 µg/mL의 kanamycin이 포함된 brain heart infusion 또는 BHI 한천 배지에 100 µL씩 도말합니다. 플레이트를 미호기성 조건의 37 °C에서 2일 동안 배양합니다. 각 대체 돌연변이체에 대해 무작위로 2개의 단일 콜로니를 선택하여, 500 µg/mL의 kanamycin이 포함된 5 mL의 BHI에 각각 접종합니다. 각 접종물을 미호기성 조건의 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

각 배양물을 30% glycerol에 넣어 -80 °C에서 냉동 보존하십시오. 돌연변이체에 예상되는 유전자 치환이 포함되어 있는지 확인하기 위해, 96-well PCR 플레이트에서 F1 및 R3 프라이머를 사용하여 각 돌연변이체에 대해 colony PCR을 수행하십시오.

각 개별 콜로니에서 배양한 overnight culture 약 1 µL를 25 µL PCR 증폭 반응의 DNA 템플릿으로 사용합니다. 돌연변이 유전자 치환을 확인하여 이중 밴드 돌연변이 또는 오염된 PCR 증폭물을 정확하게 식별하기 위해 PCR 증폭을 수행합니다. 12 cm 이상의 길이를 가진 젤에서 4시간 동안 전기영동을 통해 PCR 증폭물을 분석합니다.

본 agarose 겔 전기영동 조건에서 bromide 염색을 거친 2% agarose 겔을 사용합니다. 100 base pair 이상의 차이가 나는 amplicons는 명확하게 식별할 수 있습니다. 반면, kanamycin 저항성 카세트와 야생형 유전자의 증폭으로 인해 생성된 밴드의 차이가 100 base pairs 미만일 것으로 예상되는 경우에는, 표적 유전자의 내부 T one primer를 사용하여 PCR로 야생형 유전자가 검출되는지 확인하십시오.

결실을 추가로 확인하기 위해, pure link 96 PCR purification kit를 사용하여 증폭 산물을 정제하고 kanamycin 내성 카세트에 결합하는 P one 프라이머를 사용하여 시퀀싱을 수행한다. 상류 서열을 위한 F1 및 R one 프라이머와 하류 서열을 위한 F three 및 R three 프라이머를 사용한 PCR 증폭 후, 시퀀싱으로 확인된 정확한 돌연변이체만을 선별하여 유지한다. 설계된 프라이머와 PCR 조건을 사용하여 96-well 포맷으로 각 s sanguineous 유전자의 상류 및 하류 약 1kb 서열을 얻었다.

각 PCR 반응에서 s sanguineous 게놈 DNA로부터 특정 산물이 증폭되었으며, 이는 F1 및 R3 프라이머를 사용한 PCR 재증폭을 통해 DNA 템플릿으로 세 개의 앰플리콘을 사용함으로써 프라이머가 s sanguine의 표적으로 매우 특이적임을 나타냈습니다. 선형 재조합 PCR 컨스트럭트가 고효율로 제작되었습니다. 각 표적 유전자 상위 영역, cany 카세트, 그리고 각 표적 유전자 하위 영역이 순서대로 구성된 96웰 플레이트에서, 재조합 PCR 컨스트럭트를 s sanguine SK 36에 형질전환한 후 BHI 한천 배지에서 cany로 선택하였습니다.

대부분의 형질전환에서, 미호기성 상태로 2일간 배양한 후 각 플레이트에서 1000개 이상의 콜로니가 얻어졌습니다. 이러한 콜로니들을 F1 및 R three를 사용하여 PCR 증폭시킨 결과, 잠재적 필수 유전자를 결실시키고자 했을 때 젤 전기영동을 통해 예상되는 돌연변이 크기에 해당하는 단일 DNA 밴드가 관찰되었습니다. 일부 필수 유전자의 결실을 위한 대부분의 형질전환에서는 콜로니가 얻어지지 않아야 합니다.

그러나 이러한 콜로니들을 F1 및 R 프라이머로 PCR 증폭하여 형질전환 후 확인한 결과, 젤 전기영동에서 기대되는 돌연변이 크기와 야생형 크기에 해당하는 3개의 2D NA 밴드가 나타났습니다. 일부 돌연변이체의 경우, PCR 증폭산물의 기대 돌연변이 크기와 야생형 크기가 너무 비슷하여 긴 아가로스 젤로 분리할 수 없었습니다. 이 경우, 야생형 유전자 서열을 기반으로 표적 유전자의 내부 T one 프라이머를 설계하였습니다.

내부 T one 프라이머와 F1 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였습니다. 야생형 SK 36을 본 PCR의 양성 대조군 균주로 사용하였습니다. 내부 프라이머를 사용하여 돌연변이체로부터 예상 크기의 밴드가 증폭된 경우, 해당 유전자를 필수 유전자로 식별하였습니다.

P1 프라이머를 이용한 DNA 시퀀싱을 통해 돌연변이체 내의 can mycin 카세트 존재가 이전에 확인되었습니다. 이 프로토콜을 바탕으로 2,048개의 비필수 S sanguineous 유전자 돌연변이체가 수집되었습니다. 이때 다른 오픈 리딩 프레임 내에 완전히 포함된 4개의 오픈 리딩 프레임은 제외되었습니다.

실험 조건하에서 s sanguine의 생존에 필수적인 218개의 유전자가 확인되었습니다. 이 영상들을 시청하신 후에는 고처리량 PCR을 이용하여 어떻게 게놈 전체의 유전자 녹다운을 수행하는지에 대해 충분히 이해하셨으리라 생각합니다.