Name: 게놈 전체 유전자 삭제할에 연쇄상 구균 sanguinis 높은 처리량 PCR에 의한 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: 배우세요 Streptococcus sanguinis에서 고처리량 PCR을 이용한 게놈 전체 단일 유전자 삭제 방법을. 이 기법은 세균 유전학 및 유전자 기능 연구에 효율적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

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이 작품은 버지니아 커먼 웰스 대학의 대통령 연구 인센티브 프로그램 (PRIP) 144602-3 (PX)에 의해, 건강 (PX)의 국립 연구소에서 보조금 R01DE018138 의해 부분적으로 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. 레이 첸, 게놈 전체 돌연변이의 건설을 지원에 Yuetan쪽으로 앉아야하고 왕을 Xiaojing. 우리는 또한 DNA 배열을 위해 버지니아 커먼 웰스 대학에서 DNA 핵심 시설 감사드립니다.

1. 프라이머 디자인 <ol><li> 프리 머은 S.에 따라 집 스크립트에서 사용 설계되어 있습니다 sanguinis SK36 게놈 시퀀스. 프리 머, F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트 대상 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 (km R) 단백질 (3) 및 (1)의 1 킬로바이트 상류 시퀀스의 증폭을 위해 설계되었습니다 각각 대상 유전자의-KB 하류 순서 (그림 1). 이러한 프리 머 가운데 F1 및 R3는 프로그램의 양각 스위트 룸 (에 ePrimer3를 사용하여 설계되었습니다 <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> 대상의 상류 또는 하류 측면을 노릴 지역을 확대하려면) 유전자. 유전자 특정 프리 머, R1 및 F3는 5 &#39;와 3&#39;대상 유전자의 시퀀스에 따라 설계되었습니다. R1과 F3 프리 머의 aphA-3에 보완의 5 &#39;끝에서 25-BP 어댑터 시퀀스를 포함유전자. 각 프라이머의 녹는 온도는 가장 가까운 가능한 60 ° C 96 - 웰 형식의 모든 PCR 반응에 대한 온도를 어닐링 유니폼의 사용을 활성화 할 수 있습니다. 할 수 있도록 설계되었습니다 </li><li> F1, R1, F3 및 R3 프리 머은 유전자 순서에 따라 96 - 웰 플레이트에 합성됩니다. 각 판은 동일한 유전자 순서 프리 머의 한 종류가 포함되어 있습니다. 채널 피펫을 사용하여 PCR 증폭을위한 10 μm의 최종 농도로 96 - 웰 작동 프라이머 판에서 프리 머를 희석. </li></ol> 2. 높은 처리량 PCR 증폭 및 정화 <ol><li> 높은 처리량 증폭하려면 1 킬로바이트 상류 또는 대상 S.의 하류 sanguinis의 유전자는 1640 μl ddH 2 O, 250 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 200 μl, 50 MM 100 μl MgSO 4, 100 μl를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 얼음에 PCR 칵테일 혼합을 조립 10 μl / NG S. sanguinis SK36 게놈의 DNA와 10 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매 DNA polyme새기다 고 충실도 및 전송 채널 피펫을 사용하여 96 - 웰 PCR 플레이트의 각도에 혼합물의 23 μl. 채널 피펫을 사용하여 PCR 플레이트에 프라이머 플레이트 작업 10 μM에서 각각 F1과 R1 (또는 F3와 R3) 1 μl를 전송합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 1.5 분 30 초 및 68 ° C에 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 54 ° C에 94 ° C에서 증폭을 수행합니다. </li><li> 1퍼센트 아가로 오스 겔 48 우물 피팅 멀티 채널 피펫 로딩과 ethidium 브로마이드를 포함하는 준비. 96 - 웰 플레이트에 5xDNA 로딩 버퍼 1 μl를 갖춘 4 μl PCR 제품을 섞어서 10 μl 다 채널 피펫을 사용하여 아가로 오스 겔에서 샘플을로드합니다. 30 분에 135 V의 전기를 실행합니다. UVP 문서 및 분석 체제에서 젤에 밴드를 검사합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 원심 분리를 사용하여 PureLink 96 PCR 정화 키트하여 PCR 제품을 정화. DNA를 용출를 들어, B의 잘 40 μl 멸균 ddH 2 O를 추가 할판을 inding. </li><li> 무작위로 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 검사하기 위해 접시에 몇 정화 amplicons을 선택합니다. 접시에 amplicons의 농도를 조정하려면 ~ μl / 10 NG. </li><li> 플라스미드 포함 킬로미터 연구 카세트는 PCR 템플릿으로 EcoR I을 사용하여 소화하고 있습니다. 소화 플라스미드는 QIAquick PCR 정화 키트에 의해 정화되고 선형 플라스미드 DNA는 최종 DNA 농도로 10 NG / μl를 조정됩니다. SO 16.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함 킬로미터 연구 카세트 amplicon 25 μl 혼합물을 조립 4, 10 μM F2, 1 μl 1 μl 10 μM의 R2, 1 μl 선형 플라스미드 DNA와 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 고 충실도. ° C 1 분 30 초 68 30 초 1 분, 그리고 94 ° C의 30주기, 55 ° C에 94 ° C에서 PCR 증폭을 수행합니다. 1퍼센트 아가로 오스의 겔 전기 영동하여 PCR 제품을 검사합니다. 푸QIAquick PCR 정화 키트로 10 개인 PCR 정화의 km R 카세트 amplicon의 라 일괄. 10 NG / μl로 amplicon 농도를 조정합니다. </li><li> 최종 선형 재조합 PCR의 amplicon을 구하려면 세 PCR의 amplicons은 잘 PCR 템플릿과 같은 하나 PCR 플레이트의 각 1 μl (거의 동등한-몰 양에서)과 결합되어 있습니다. 다른 PCR 구성 요소는 SO 14.4 μl ddH 2 O, 2.5 μl 10xHigh 성심 PCR 버퍼, 10 MM dNTP 혼합물의 2 μl, 50 밀리미터 MG 1 μl를 포함한 추가됩니다 4, 10 μM의 F1 1 μl, 10 μM R3의 1 μl, 0.1 μl 플래티넘 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소의 높은 충실도를. PCR 증폭은 4 분에 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 30 초 및 68 ° C 30 초 55 ° C에서 2 분, 94의 30주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다. </li><li> 아가로 오스 겔에서 PCR amplicons를 검사합니다. 정화하고 위에 설명 된대로 PCR의 amplicons을 수량화. -20 ° C.에서 재결합 PCR의 amplicons를 고정 </li></ol> 3. COMpetent 셀 준비 <ol><li> 토드 휴이트 국물이 준비되어 상온으로 냉각 및 0.22 μm의 폴리스티렌 필터 4를 사용 소독 한 후 끓여야하고 가열 10 N NaOH를 사용하여 7.6로 조정 산도. TH + HS 매체를 만회하기 위해 15 ML 원뿔 튜브에 11.7 ML 토드 휴이트 국물에 300 μl 열 inactivated 말 커를 (2.5 %까지 최종 농도)를 추가합니다. 나누어지는의 TH + HS 중간이 ML 튜브 10 ML에. </li><li> 주식 S. 5 μl의 예방 sanguinis SK36 2 ML의 TH + HS 매체에 -80 ° C에서 냉동 37에 단단히 상한과 밤 문화를 길러 10 ML-TH + HS 관을 미리 잠복기와 함께 ° C,.에게 </li><li> 박 한 후, 10 ML TH + HS에 50 μl 문화를 전송하고 3 시간 (0.07-0.08의 OD 660에 해당)를 37 ° C에서 관을 길러 즉시 변환을 위해 사용합니다. </li></ol> 4. 셀 변환과 항생제 선택 <ol><li> 70 NG S. 2 μl를 추가합니다 sanguinis SK36 competence 자극 펩타이드 (CSP)과 37 번 블록 96 - 웰하고 사전에 따뜻한에서 Eppendorf 튜브 2 μl 선형 재조합 PCR amplicon (~ 50 NG) ° C. 각 튜브에 3 시간 - incubated SK36 문화의 330 μl를 전송합니다. 1 시간에 37 ° C에서 알을 품다. 제어 등의 살균 ddH 2 O와 DNA를 교체하십시오. </li><li> 얼음 블록을 놓고, 500 μg / ML의 kanamycin과 뇌 심장 주입 (BHI) 한천 플레이트의 각 변형 100 μl을 알리십시오. microaerobic 조건 하에서 2 D에 37 ° C에서 접시를 품다. </li></ol> 5. 돌연변이 확인 및 저장 <ol><li> 각 교체 돌연변이를 들어, 무작위, 2 개인 식민지을 데리러 오 ML BHI가 500 μg / ML의 kanamycin을 포함하는으로 식민지의 예방 및 37에서 microaerobically 밤 inoculum을 품어 ° C. -80에서 30 % 글리세롤에있는 각 문화를 Cryopreserve ° C </li><li> 예상 유전자 교체를 포함하는 돌연변이가 식민지 각 돌연변이 사용하는 F1에 대한 PCR 및 R3을 수행 여부를 검사하려면96 - 웰 PCR 판에서 프리 머. 개별 식민지에서 약 1 μl 밤 문화는 25 μl PCR-증폭 반응에서 DNA 템플릿으로 사용됩니다. PCR는 ° C 3.5 분, 그리고 마지막으로 68 ° C 4 분에 30 초 및 68에 30 초, 55 ° C에 5 분, 94의 35주기 ° C에 94 ° C에서 수행된다. </li><li> 정확하게 이중 대역 돌연변이 나 오염 물질 PCR의 amplicon을 확인하려면 ethidium의 브로마이드 착색과&gt; 12cm 길이 2% 아가로 오스 겔에서 4 시간에 전기 영동하여 PCR amplicon을 확인합니다. 이 아가로 오스 겔 전기 영동 조건에서 ≥ 100 BP의 차이가있는 모든 amplicons은 분명하게 식별되었습니다. km의 R 카세트의 증폭 및 야생 형 유전자에서 발생하는 밴드는 내부 T1의 프라이머는 야생 형 유전자는 PCR에 의해 검출 될 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다 &lt;100 BP에 의해 차이가 예상하는 경우. </li><li> 추가로 삭제를 확인하려면 amplicons는 PureLink 96 PCR 정화 키트에 의해 정화되고있는 P1의 프라이머를 사용하여 순서가 아르km의 R 카세트에 바인딩합니다. 시퀀싱에 의해 확인 만 정확한 돌연변이세요. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

초기 뇌관이 설계하면서 이웃 유전자에 대한 외인성 항생제 유전자과 하나가 타겟 유전자의 교체 가능한 극성 효과를 최소화하기 위해 두 단계 이동합니다. 삭제 된 유전자의 대부분은 프리 머 R1과 F3는 사전 정지 코돈 30 BP로 시작 코돈에 따라 6 BP에서 코딩 영역을 삭제할 수 있도록 설계되었습니다. 지난 30 기본 쌍은 인접 하류 유전자에 의해 사용 가능성 ribosomal 구속력이 사이트를 보호하기 위해 유지됩니다. 두 이웃 유전자 사이의 보존 지역은 그들이 반대 방향에있는 때 100 BP로 확장하고 두 단백질의 N-말단은 잠재적 인 프로모터 영역을 삭제 방지하기 위해 서로 가깝습니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 유전자 삭제 5 재조합 구조에서 제외됩니다. ribosomal 바인딩 사이트 번역 aphA-3 유전자 도입된다. 우리의 전략을 테스트하기 위해, 우리는 무작위로 다음 96 allelic 교환 뮤턴트 10 구축합니다. 우리는 O발기인 - 이하 aph...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 #</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트 (선택 사항)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 F2</td&gt;<td&gt; 통합 DNA 기술</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 R2</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 F2p</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 P1</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 P2</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 프라이머 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; 순서 : NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA의 중합 효소</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; 플래티넘 DNA 형성 촉매 효소 DNA 고 충실도</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; 뉴 잉글랜드 Biolabs 주식회사</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; 제한 효소</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 한천</td&gt;<tdBioanalytical&gt; 미국</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 아가로 오스</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; 뇌 하트 주입</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; 말 혈청</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; km</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycin</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH 국물</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; 토드 휴이트 국물</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR 정화 키트</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28,106</td&gt;<td&gt; QIAquick PCR 정화 키트</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 필터</td&gt;<td&gt; 코닝</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; 0.22 μm의 폴리스티렌 필터</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomat 시스템</td&gt;<td&gt; 마트 미생물 BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat 마크 II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Benchtop의 원심 분리기</td&gt;<td&gt; 열 과학</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall 전설 RT 플러스 microplate 회</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 젤 문서</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc - 이건 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 보육</td&gt;<td&gt; 피셔 과학</td&gt;<td&gt; 11-690 - 625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet의 젤 XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet의 젤 XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifuge</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifuge 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 멀티 채널 피펫</td&gt;<td&gt; 열 Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 열 자전거 타는 사람</td&gt;<td&gt; 응용 Biosystems 주식회사</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR 시스템 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 pcr에 의한

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis 및 단일 유전자 삭제 박테리아 1,2의 게놈 전체 유전자 녹아웃에 적용된 두 가지 방법이 있습니다. transposon의 mutagenesis이 적은 시간이 소요 적은 비용이 많이 드는, 그리고 완성 된 게놈 정보를 요구하지 않습니다하지만,이 방법은 두 약점이 있습니다 : 감소 경쟁과 뮤턴트 카운터 선택하는 혼합 돌연변이 라이브러리의 서로 다른 돌연변이 (1) 가능성, (2) 일부 유전자 불 활성화의 가능성은 상기 유전자가 완전히 transposon의 삽입에 따라 자신의 기능을 잃게하지 않습니다. 단일 유전자 삭제 분석 transposon의 mutagenesis와 관련된 단점을 보완 할 수 있습니다. 게놈 전체의 단일 유전자 삭제의 효율성을 개선하기 위해, 우리는 모델 생물로 연쇄상 구균의 sanguinis를 사용하여 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 대한 높은 처리량 기술을 확립하려고합니다. 각 유전자 삭제 S.에 구축 sanguinis 게놈는 1을 구성하도록 설계되었습니다타겟 유전자 aphA-3 유전자 인코딩 kanamycin 저항 단백질, 그리고 타겟 유전자의 1 이하 하류-KB 상류. 프리 머 F1/R1, F2/R2, 그리고 F3/R3 세 세트를 각각 설계, 각 삭제 그 세 가지 구성 요소 구성의 PCR-amplifications을위한 96 - 웰 플레이트 형식으로 합성됩니다. 프리 머 R1과 F3는 5 &#39;끝 부분에있는 aphA-3 유전자의 지역에 보완 25 BP 시퀀스가 포함되어 있습니다. aphA-3 유전자의 대규모 PCR 증폭은 모든 단일 유전자 삭제 구조를 만드는 한 번 수행됩니다. aphA-3 유전자의 프로모터는 처음 kanamycin 카세트의 잠재력 극성 효과를 최소화하기 위해 제외됩니다. 유전자 삭제 구조를 만들려면, 높은 처리량 PCR의 증폭 및 정화는 96 - 웰 플레이트 형식으로 수행됩니다. 각 유전자 삭제에 대한 선형 재조합 PCR의 amplicon는 고 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하여 네 PCR 반응을 통해 구성됩니다. 초기 exponS.의 ential 성장 단계 2.5 % inactivated 말 혈청이 PCR-재조합 구조의 변화에 대한 능력을 향상하는 데 사용됩니다와 토드 휴이트 국물에 배양 sanguinis이 보충. S.의 조건, 최대 20 % sanguinis 세포는 DNA의 ~ 50 NG를 통해 변환 할 수 있습니다. 이 방법에 따라, 단일 유전자 삭제로 2048 뮤턴트은 궁극적으로 S.에있는 2,270 유전자에서 얻은되었습니다 네 유전자 ORFs 제외 sanguinis은 S.의 다른 ORFs 내에 완전히 포함 sanguinis SK36 218 가능성이 필수적인 유전자. 유전자 삭제 구조를 만드는 방법에 대한 기술은 높은 처리량이며, 모든 transformable 박테리아 게놈 전체의 단일 유전자 삭제에 사용하기 쉬운 될 수 있습니다.

후 PCR의 프리 머 F1과 R1을 사용하여 증폭하고, F3 및 R3, 각 S. 약 1 킬로바이트 업스트림 및 다운 스트림 sanguinis 유전자는 96도 형식은 각각 (그림 2A)에서 얻은되었습니다. 우리의 PCR 조건 및 사용하여 설계 프리 머에서 특정 제품 S.에서 증폭 된 각 PCR 반응에 sanguinis 게놈 DNA. 이 결과는 프리 머은 S.의 목표에 매우 구체적인이었다 표시 sanguinis. PCR을 통해 F1과 R3 프리 머와 DNA 템플릿, 선형 재조합 PCR 구조 (~ 3 KB) 3 개 amplicons을 사용하여 재 증폭은 높은 처리량 각 대상 유전자, kanamycin의 상류 지역으로 구성 96 - 웰 플레이트에 만들어졌습니다 카세트, 그 순서 (그림 2B)의 각 대상 유전자의 지역 하류. 재조합 PCR 구조는 다음 S.로 변환 ...

효율적인 게놈 전체의 단일 유전자 돌연변이 방법은 사용하는 설립되었습니다<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 모델 생물로. 이 방법은 높은 처리량 재조합 PCRs 및 변환을 통해 달성했다.

게놈 전체 유전자 삭제할에<em&gt; 연쇄상 구균 sanguinis</em&gt; 높은 처리량 PCR에 의한

트랜스포존 돌연변이 유발과 단일 유전자 결손은 박테리아의 전유전체 유전자 녹아웃에 적용되는 두 가지 방법입니다 1,2. 트랜스포존 돌연변이 유발은 ...

본 절차의 전반적인 목표는 고효율 PCR을 통해 streptococcus sanguine의 게놈 전반에 걸쳐 단일 유전자 결손을 유도하는 것입니다. 이는 먼저 고효율 PCR 증폭을 통해 항생제 내성 유전자를 포함하여 표적 유전자의 상류 및 하류 DNA 서열까지 총 3개의 앰플리콘(amplicon)을 확보함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 이 3개의 PCR 앰플리콘을 템플릿으로 사용하여 선형 재조합 PCR 앰플리콘을 얻는 것입니다.다음으로, 수용성 s sanguine 세포를 준비합니다. 마지막 단계는 선형 재조합 PCR 증폭 산물을 수용성 s sanguineous 세포로 형질전환하는 것입니다. 최종적으로 colon A PCR 증폭 및 DNA 시퀀싱을 통해 정확한 돌연변이체를 검증합니다.자살 플라스미드(suicide plasmid) 녹아웃과 같이 기존에 사용되던 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 고처리량을 통해 게놈 전반의 결손 돌연변이체를 직접 생성할 수 있다는 점입니다. PCR 프라이머는 streptococcus sanguineous SK 36 게놈 서열을 기반으로 한 내부 스크립트를 사용하여 서면 프로토콜에 기술된 대로 설계 및 합성할 수 있습니다. 타겟 유전자의 상류 1 kb 서열, A PHA 3 유전자 ENC 코딩, 카나마이신 내성 단백질, 그리고 타겟 유전자의 하류 1 kb 서열을 증폭하기 위해 세 세트의 프라이머가 설계되었습니다.유전자 특이적 프라이머. R1 및 F3는 표적 유전자의 5' 및 3' 서열을 기반으로 설계되어, 표적 S. sanguine genes의 상류 또는 하류 1 kb 영역을 고효율로 증폭합니다. 먼저 15 mL 원추형 튜브에 PCR 칵테일 혼합물을 얼음 위에서 조제합니다.s sanguineous 게놈 DNA를 포함하는 PCR 혼합물의 성분은 본문을 참조하십시오. 멀티채널 피펫을 사용하여 PCR 혼합물 23 µL를 96웰 PCR 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 표적 유전자의 상류 서열을 위해, 멀티채널 피펫을 사용하여 10 µM 농도의 작동 프라이머 플레이트에서 F1 및 R1 프라이머를 각각 1 µL씩 PCR 플레이트로 옮깁니다. 표적 유전자의 하류 서열을 증폭하기 위해 F3 및 R3 프라이머에 대해서도 동일하게 수행합니다. PCR 플레이트를 밀봉하고 94 °C에서 1분 동안 증폭을 수행한 후, 94 °C에서 30초 동안 30회 사이클을 반복합니다.54 °C에서

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체계적인 대규모 합성 유전자 (유전자 유전자 또는 epistasis) 상호 작용 화면은 유전 이중화 및 경로 간 대화를 탐험하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 높은 처리량 정량 합성 유전자 배열 검사 기술을 설명, eSGA 우리는 epistatic 관계를 elucidating과의 유전 적 상호 작용 네트워크를 탐험하기 위해 개발이...

에 박테리아 기능 네트워크 및 경로를 매핑<em&gt; 대장균</em&gt; 합성 유전자 배열을 사용하여

그린 몬스터 방법은 리포터 유전자 인코딩 녹색 형광 단백질로 표시된 여러 삭제의 급속한 조립이 가능합니다. 이 방법은 반복 삭제의 성적 구색의 사이클 등 삭제를 들고 세포의 형광 기반의 강화를 통해 효모 변종 운전에 기반을두고 있습니다.

여러 유전자 삭제를 운반 효모 종자의 생성에 대한 초록 괴물 프로세스

출처: Tomás, JM, et al. 박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 null 돌연변이체의 생성. J. Vis. 경험. (2022).이 비디오는 대장균  에서 자살 플라스미드의 개시자 의존적 증폭을 보여줍니다.항생제 내성 유전자를 운반하는 플라스미드는 숙주에 의해 암호화된 개시제 단백질이 있는 경우에만 복제됩니다. 전기천공 및 회수 배지에서 배양한 후, 혼합물을 항생제 함유 한천에 도금합니다. 플라스미드를 가진 박테리아는 개시제 단백질이 플라스미드의 항생제 내성 유전자를 발현할 수 있기 때문에 생존합니다.

박테리아 숙주에서 자살 플라스미드의 증폭

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

인핸서 활성의 실험적 검증은 기능 손실 분석으로 접근하는 것이 가장 좋습니다. 여기에 제시된 효율적인 프로토콜은 CRISPR/Cas9 매개 결실을 사용하여 하이브리드 게놈(Mus musculus129 x Mus castaneus)을 포함하는 F1 ES 세포에서 유전자 전사의 대립유전자 특이적 조절을 연구합니다.

생성 CRISPR은 / Cas9 중재 Monoallelic 삭제할 경우는 마우스 배아 줄기 세포의 증강 기능을 연구하는

이 원고를 동시에 엔테로 종을 정량화하는 데 사용할 수있는 이중 디지털 PCR 분석. 레크리에이션 바다에서 일반과 인간의 관련 분변 오염의 지표로 HF183 유전자 마커를 설명합니다.

동시 정량을위한 이중 디지털 PCR 분석<em&gt; 엔테로 종.</em&gt;과 바다에서 인간 방패 관련 HF183 마커

우리 유전자 교란 구 mutans 의 생성에 대 한 손쉬운, 신속한, 그리고 상대적으로 저렴 한 방법 설명 변종; 이 기술은 다양 한 종의 유전자 교란 종자의 생성에 대 한 적용할 수 있습니다.

유전자 교란 mutans 연쇄 상 구 균 긴장 없이 유전자 복제의 생성

여기 선물이 다른 대장균 변종에 삭제 돌연변이 만들기 위한 기반으로 기존의 항생제 저항-카세트 삭제 구문을 사용 하는 프로토콜. 이러한 삭제 돌연변이 동원 고 P1 살 균 소 변환을 사용 하 여 받는 사람 긴장의 해당 장소에 삽입 될 수 있습니다.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

배우세요 Streptococcus sanguinis에서 고처리량 PCR을 이용한 게놈 전체 단일 유전자 삭제 방법을. 이 기법은 세균 유전학 및 유전자 기능 연구에 효율적인 유전자 조작을 가능하게 합니다.

게놈 전체 유전자 삭제할에

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