마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 심장에서 세포와 같은 생존 가능한 심장 멜라닌 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 안락사된 쥐에서 심장을 적출하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 효소 소화와 기계적 교반을 사용하여 심장을 다지고 세포를 해리하는 것입니다.

다음으로, 세포의 슬러리를 원심분리하고 심근세포와 멜라닌 세포와 같은 세포를 포함하는 펠렛을 재현탁합니다. 마지막 단계는 플레이팅과 배양입니다. 세포는 궁극적으로 세포와 같은 심장 멜라닌 세포를 분리하여 세포 흥분성 또는 전사체의 상태를 평가하기 위해 병태생리학적 스트레스 요인에 대한 반응으로 패치 연구 또는 마이크로어레이 분석에 사용할 수 있습니다.

심근세포를 분리하고 배양하기 위해 고안된 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포와 같은 많은 착용 가능한 심장 멜라닌 세포를 분리할 수 있다는 것입니다. 글쎄요, 우리는 새로운 세포 집단인 쥐의 심장을 발견했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸고 그 생리학을 조사하고 싶었습니다. 먼저, 멸균된 수술 기구 두 세트를 준비하는데, 하나는 심장을 해부하기 위한 것이고 다른 하나는 조직을 다지기 위한 것입니다.

다음으로, 배지 보충제를 준비하되 세포를 도금하기 직전까지 배양 배지에 첨가할 때까지 기다립니다. 조직 배양 후드에서 작업하는 동안 용액을 멸균하기 위해 배양 배지 필터를 준비한 후 배지를 섭씨 4도에서 보관하십시오. DNA 0.05g, DPBS 1-100밀리리터에 10%FBS와 항생제를 첨가하여 DNA의 단일 용액을 준비합니다.

다음으로, 100ml의 DPBS와 항생제에 0.5g의 트립신을 첨가하여 0.5%tryin 용액을 준비합니다. 마지막으로, 페트리 접시, 50ml 원뿔형 튜브, 40미크론 세포 여과기, DPBS 및 항생제, 60mm 및 35mm 배양 접시를 포함하여 절차를 완료하는 데 필요한 다른 장비를 함께 모으십시오. P제로에서 P로 안락사시킨 후 두 마리의 신생아 쥐 새끼를 알코올로 가슴을 닦고 10cm P 두 접시에 담습니다.실체 현미경으로 작동하는 DPBS로 흉강을 조심스럽게 열고 심방을 부착한 상태에서 심장 전체를 제거합니다.

DPBS에서 심장을 씻고 새로운 10cm 페트리 접시로 옮깁니다. 절제된 심장이 있는 페트리 접시를 조직 배양 후드로 옮기고 다음 단계에 대한 멸균 기술을 따릅니다. 먼저 멸균된 DPBS와 항생제로 심장을 세 번 씻습니다.

심장을 60mm 배양 접시에 넣고 용액에 6-8 밀리리터의 0.5 % 트립을 첨가하십시오. 다음으로, 심장을 작은 조각으로 자르고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 접시에서 생성된 용액을 멸균 10ml 원추형 튜브로 당깁니다.

10ml 멸균 피펫을 사용하여 용액을 30-50회 빠르고 부드럽게 재평가하고, 생성된 현탁액을 40미크론 셀 스트레이너를 통해 깨끗한 새 50ml 원추형 튜브로 여과합니다. 원심분리 후, supinate를 부드럽게 흡입하고 나머지 펠릿을 6-8ml의 멸균 DPBS에 재현탁합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

원심분리 후 세 번째 헹굼 후 세척 용액을 조심스럽게 배출하거나 흡인하고 펠릿을 6ml의 보충 배양 배지에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 재현탁액을 멸균 전사 피펫에 끌어 넣고 세포를 35mm 접시에 넣습니다. 하룻밤 배양 후 3마리의 신생아 마우스에서 분리된 심장 세포를 추출하고, 부착되지 않은 세포와 함께 배양 배지를 흡인한 다음, DPBS로 플레이트를 한 번 헹구고 플레이트에 새 배지를 추가하고 배지를 교체합니다.

신생아 또는 배아 심장에서 분리된 세포는 이틀에 한 번씩 최대 3주 동안 배양에서 유지될 수 있는 반면, 성인 심장에서 분리된 세포는 최대 10일 동안 배양에서 유지될 수 있습니다. 성체 쥐 심장에서 세포와 같은 멜라닌 세포를 분리하려면 먼저 조직 배양 후드에서 항생제가 함유된 멸균 DPBS로 절제된 심장을 세척합니다. 구부러진 절개 겸자로 심장을 약간 짜서 남아 있는 혈액을 제거한 다음 DPBS로 심장을 한 번 더 헹굽니다.

다음으로, 심장에서 심방과 심실 고리를 제거하고 절제 조직 표본을 35mm 접시에 넣습니다. 구부러진 가위와 집게를 사용하여 하트를 작은 조각으로 자릅니다. 0.5% 트립 용액 6-8ml를 접시에 넣고 섭씨 37도에서 45-60분 동안 배양합니다.

배양 후, 이전에 성인 심장 세포와 플레이트의 현탁액을 얻기 위해 앞에서 설명한 단계를 반복합니다. 이 예에서 흰색 화살표는 두 패널 모두에서 심장 멜라닌 세포를 식별합니다. 형광 마커의 도움 없이는 심장 멜라닌 세포를 식별하고 접시에 부착된 심방 근세포와 구별하기 어렵고, 하늘색 화살표는 여기에 표시된 접시에 잘 부착되지 않은 심방 세포, 즉 신생아 마우스 심장에서 분리된 건강한 심장 멜라닌 세포를 가리킵니다.

그들은 광범위한 수지상 돌기를 개발했으며 피부 멜라닌 세포와 매우 유사합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 심장에서 생존 가능한 멜라닌 세포 세포를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이는 생리학 및 분자 분석에 적합합니다.