마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

본 절차의 전반적인 목표는 마우스 심장에서 생존 가능한 심장 멜라닌 세포 유사 세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 안락사시킨 마우스로부터 심장을 적출함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로 심장을 잘게 다진 후, 효소 소화와 기계적 교반을 이용해 세포를 해리합니다.

다음으로, 세포 슬러리를 원심분리하고 심근세포와 멜라닌 세포 유사 세포가 포함된 펠렛을 재현탁합니다. 마지막 단계는 플레이팅 및 배양입니다. 최종적으로 분리된 심장 멜라닌 세포 유사 세포는 패치 연구나 병리생리학적 스트레스 요인에 대한 마이크로어레이 분석에 사용하여 세포 흥분성 또는 전사체 상태를 평가할 수 있습니다.

심근세포를 분리하고 배양하기 위해 설계된 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 많은 수의 생존 가능한 심장 멜라닌 세포 유사 세포를 분리할 수 있다는 점입니다. 우리는 마우스 심장에서 새로운 세포군을 발견하고 그 생리학적 특성을 연구하고자 했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 우선, 심장을 적출하기 위한 도구 세트와 조직을 잘게 다지기 위한 도구 세트, 이렇게 두 세트의 멸균된 수술 기구를 준비하십시오.

다음으로, 배지 보충물을 준비하되 세포를 플레이팅하기 직전까지는 배지에 첨가하지 말고 기다리십시오. 조직 배양 후드 내에서 용액을 멸균하기 위해 배지 여과 준비를 마친 후, 배지를 4°C에서 보관하십시오. 10% FBS와 항생제가 포함된 DPBS 100 mL에 DNA's one 0.05 g을 첨가하여 DNA's one 용액을 준비하십시오.

다음으로, 항생제가 포함된 DPBS 100 milliliter에 trypsin 0.5 grams를 첨가하여 0.5% trypsin 용액을 준비합니다. 마지막으로, Petri dish, 50 milliliter conical tube, 40 micron cell strainer, 항생제가 포함된 DPBS, 60 millimeter 및 35 millimeter 배양 접시를 포함하여 실험 완료에 필요한 기타 장비를 모두 준비합니다. P0에서 P2 단계의 신생 생쥐를 안락사시킨 후, 가슴 부위를 알코올로 닦아내고 항생제가 포함된 DPBS가 담긴 10 centimeter P2 dish에 놓습니다. 실체 현미경 하에서 조심스럽게 흉강을 열고 심방이 부착된 심장 전체를 적출합니다.

심장을 DPBS로 세척하고 새로운 10 centimeter 페트리 접시에 옮깁니다. 적출된 심장이 담긴 페트리 접시를 조직 배양 후드로 이동시키고, 다음 단계부터는 멸균 기술을 준수하십시오. 먼저, 항생제가 첨가된 멸균 DPBS로 심장을 3회 세척합니다.

심장을 60 millimeter 배양 접시에 넣고 0.5% trypsin 용액 6~8 milliliters를 추가합니다. 다음으로, 심장을 작은 조각으로 자르고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 완료되면, 접시의 용액을 멸균된 10 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다.

10 mL 멸균 피펫을 사용하여 용액을 빠르게 하되 부드럽게 30~50회 리레이트(rerate)한 후, 결과물을 40 µm 셀 스트레이너로 걸러 깨끗한 새 50 mL 원심분리 튜브에 담습니다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 남은 펠릿을 6~8 mL의 멸균 DPBS에 재현탁합니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.

원심분리 후 세 번째 세척 단계가 끝나면, 세척액을 조심스럽게 따라내거나 흡입하여 제거하고 펠렛을 6 mL의 보충 배지에 다시 현탁합니다. 그다음, 현탁액을 멸균 전이 피펫으로 빨아들여 세포를 35 mm 디쉬에 옮깁니다. 하룻밤 동안 배양한 후 세 마리의 신생 쥐로부터 분리한 심장 세포에서 배양액과 부착되지 않은 세포를 함께 흡입하여 제거하고, DPBS로 플레이트를 한 번 세척한 뒤 새 배지를 추가하고 교체합니다.

신생아 또는 배아 심장에서 분리한 세포는 이틀마다 배지를 교체하여 최대 3주 동안 배양할 수 있는 반면, 성체 심장에서 분리한 세포는 최대 10일까지 배양할 수 있습니다. 성체 마우스 심장에서 멜라닌 세포 유사 세포(melanocyte like cells)를 분리하려면, 먼저 조직 배양 후드 내에서 절제된 심장을 항생제가 포함된 멸균 DPBS로 세척합니다. 곡선 해부용 핀셋으로 심장을 가볍게 짜서 남아 있는 혈액을 제거한 다음, DPBS로 심장을 한 번 더 헹굽니다.

다음으로, 심장에서 심방과 방실환을 제거하고 절제된 조직 표본을 35 millimeter 접시에 담습니다. 곡선 가위와 핀셋을 사용하여 심장을 작은 조각으로 자릅니다. 접시에 0.5%trips in 용액 6~8 milliliters를 추가하고 37 degrees Celsius에서 45~60분 동안 배양합니다.

배양 후, 앞서 시연한 단계를 반복하여 성체 심장 세포 현탁액과 도말 표본을 얻습니다. 본 예시에서 흰색 화살표는 두 패널 모두에서 심장 멜라닌 세포를 나타냅니다. 형광 마커의 도움 없이는 심장 멜라닌 세포를 식별하거나 디쉬에 부착된 심방 근세포와 구별하기 어렵다는 점에 유의하십시오. 연한 파란색 화살표 머리는 신생 생쥐 심장에서 분리한 건강한 심장 멜라닌 세포가 표시된 여기서 디쉬에 잘 부착되지 않은 심방 세포를 가리킵니다.

이들은 광범위한 수지상 돌기를 발달시켰으며 피부 멜라닌 세포와 매우 유사합니다. 일단 숙련되면, 적절하게 수행할 경우 이 기술은 몇 시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 심장에서 생존 가능한 멜라닌 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이는 생리학적 및 분자 분석에 적합할 것입니다.