인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 인간의 장점막 자극에 대한 체내(in vivo) 상황을 모사하는 것입니다. 이는 자극제가 기저측(basolateral)에 접촉하는 것을 방지하기 위해 조직의 정단측(apical side)에 케이브 실린더(cave cylinder)를 접착함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 자극제를 처리하며, 이를 통해 유도된 면역 반응을 분석할 수 있습니다.

다음으로, 조직의 생존력을 24~36시간 동안 유지하기 위해 조직의 정단측에서 자극을 제거합니다. 얻어진 결과는 면역조직화학 데이터, 사이토카인 분비, 프로파일 분석 등을 통해 다양한 프로바이오틱스 균주의 차별적 효과를 보여줄 수 있습니다. ASIC 챔버와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 최대 20가지 조건을 동시에 분석할 수 있다는 점입니다.

이를 통해 배양 시간을 최대 36시간까지 연장할 수 있으며, DNA/RNA 분석, 면역조직화학, 사이토카인 분비 분석 등 다양한 판독 분석을 위한 충분한 재료를 확보할 수 있습니다. 이 모델은 프로바이오틱스 분야에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 기술에 활용하거나 생물학적 제제, 항염증제 등 다른 면역조절제의 효과를 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 건강한 사람 또는 염증성 장질환 환자의 장점막 조직은 수술 중에 채취해야 합니다.

검체를 절제한 후, pen strep이 포함된 HBSS 내에서 냉장 상태를 유지하며 신속하게 실험실로 옮깁니다. 먼저 조직을 버퍼로 세척하고 장간막 물질을 제거하십시오. 다음으로, 조직을 HBSS 버퍼에 담근 상태에서 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 점막층을 점막하층으로부터 분리합니다.

페트리 접시 내에서 조직을 완전히 잠기게 유지할 필요는 없으나, 포셉으로 점막 표면을 가급적 적게 접촉하십시오. 다음으로, 멸균된 메스 두 개를 사용하여 음식을 자르는 방식과 유사하게 점막을 최소 1cm 너비의 최대한 긴 스트립 형태로 절단합니다. 절단 후에는 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS로 점막을 부드럽게 세척하여 깨끗이 씻어내십시오.

마지막으로, 점막 조각들의 apical side가 위를 향하도록 페트리 접시에 펼쳐 놓습니다. 먼저 신선한 TIS DMEM을 준비합니다. 다음으로, 10 centimeter 페트리 접시에 F-B-S-N-A 약 30 milliliters를 채우고 철제 그리드를 용액에 완전히 잠기게 넣습니다.

플레이트를 열어둔 상태에서 플라스틱 실린더를 플레이트 위에 배치합니다. 이제 3 µL의 외과용 접착제를 피펫으로 취해, 포셉으로 플라스틱 실린더를 단단히 잡은 채 실린더의 테두리 한 곳에 접착제를 조심스럽게 도포합니다. 그다음, 접착제가 마르는 동안 실린더를 점막의 첨단측(apical side)에 스트립 테두리와 최대한 가깝게 부드럽게 안착시킵니다.

조직 플레이트의 중앙 웰에 850에서 1000 µL의 배지를 분주하고, 철제 그리드를 플레이트 중앙 웰의 가장자리에 걸쳐 지지합니다. 두 개의 메스를 사용하여 실린더 가장자리에서 과잉 조직을 잘라냅니다. 이제 조직이 부착된 실린더를 조심스럽게 들어 올려, 조직의 기저측면을 플레이트 중앙의 철제 그리드 위에 놓습니다.

다음으로 조직 자극을 진행합니다. 원하는 농도로 준비한 관심 자극제를 플라스틱 실린더 중심부에 처리합니다. 피펫 팁으로 실린더나 점막 표면을 건드리지 않도록 주의하며, 실린더 내부 표면을 균일하게 덮어줍니다.

이제 조직을 최대 3시간 동안 배양하십시오. 더 적은 부피의 자극 용액을 사용하면 3시간 이상의 배양도 가능합니다. 배양 후, 조직의 정단 표면에서 자극제를 제거하되, 이를 신선한 배지로 교체하지 마십시오.

배지를 추가하면 조직이 질식할 수 있습니다. 이제 산소 용기를 1기압의 100% 산소로 채워 24시간 동안 배양하십시오. 산소 탱크를 다룰 때는 항상 주의하고, 사용 후에는 반드시 제대로 잠갔는지 확인하십시오.

24시간 동안의 자극 배양 후, 메스를 사용하여 접착제를 조심스럽게 긁어내어 조직에서 실린더를 제거합니다. 그 다음 IHC 또는 면역형광 분석을 위해서는 조직을 고정하고, 유전자 발현 또는 단백질 분석을 위해서는 조직을 액체 질소에 급속 냉동합니다.

다음으로, 사이토카인 분비 프로파일링을 위해 기저 외측 배지를 수확합니다. 그 후, 배지를 원심분리 튜브로 옮기고 명시된 프로토콜에 따라 부유물을 펠렛화합니다. 건강한 상태와 IBD 상태의 인간 장 점막은 조직의 상태를 유지하며 최소 24시간 동안 배양되었습니다.

이는 배양 시간의 최소 85%가 산소가 풍부한 환경에서 이루어졌을 때만 가능했습니다. 전통적인 방식으로 배양된 점막은 그만큼 좋은 결과를 보이지 않았습니다. 이후 건강한 조직에 염증 유발성 침습성 살모넬라를 처리하여 자극을 주었습니다.

접종 2시간 후, 대조군과 비교하여 상피층 상부의 파괴가 이미 관찰되었습니다. 24시간 후에는 퇴행성 변화가 상당히 광범위하게 나타났습니다. 출판된 결과가 포함된 실험적 응용에 관한 더 자세한 논의는 원고 개발 완료 후 서면 원고에서 확인하실 수 있습니다.

이 기술은 위장관 분야의 연구자들이 위장관 내 숙주-미생물 상호작용을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 인간 장 점막을 배양하고 국소적으로 자극하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 인간 시료를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행할 때는 항상 필요한 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.