Name: 인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 학습하세요 인간 장내 점막 explant 배양 및 편광 자극 방법을 통해 면역 반응을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 조직 극성을 유지하며 최대 20가지 조건을 동시에 분석할 수 있습니다.

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우리는 산소 챔버를 제공하는 우수한 기술 지원 및 박사 안토니오 디 Sabatino의를 위해 에리카 Mileti 감사합니다. 자금 조달 : MR에와 폰다 치오 Cariplo와 마리 퀴리 국제 교육 이동성 네트워크 (크로스 토크 부여 계약 번호 : 21553-2)에 의해 지원 :이 작품은 7 EU 프레임 워크 프로그램 (Dendroworld IBDase, ERC)에서 교부금에 의해 지원되었다 KT.

1. 얻기 및 조직 준비 <ol><li> 조직 (건강 또는 IBD 점막)이 수술하는 동안 얻을 수 있습니다. 일단 시편은 4 ° C에서 또는 얼음에 펜 / Strep의로 보충 칼슘 + + / 마그네슘 + + 무료 HBSS 버퍼에 유지 가능한 빨리 실험실로 전송을 절제합니다. </li></ol> 시편의 * 사이즈는 조직의 가용성에 따라 달라 얻은 조직의 부분은, 진단을 위해 필요하지 않습니다 것을 엄격 건강하고 IBD 주제 사이에서 크게 다를 수 있습니다. 건강한 조직은 대장 암 수술을받은 환자에서 절제합니다. <ol start="2"><li> 부드럽게 조직을 세척하고 모든 장간막 물질을 청소합니다. 페트리 접시 (반드시 immerged되지 않음)에 HBSS 버퍼에 조직을 유지하면서 멸균 가위와 집게를 사용하여 점막하에서 점막 층을 분리합니다. 가능한 조금 집게와 점막 표면을 터치합니다. </li><li> 최소 1 C는 줄무늬의 점막을 잘라m 폭과 가능한 한 오래. 당신의 음식을 절단하는 것처럼 많은 두 멸균 메스를 사용합니다. </li><li> HBSS에 부드럽게 점막을 청소하고 위쪽을 향하게 정점면 페트리 접시에 그것을 확장 씻으십시오. </li></ol> 2. 조직을 설치 <ol><li> 새로운 배지 (tisDMEM)를 준비합니다. DMEM는 글루타민 (2 ㎜)와 NaPyr (1 ㎜)로 보완 사용하고 FBS - 나 15 %를 추가 (태아 혈청 - 북미), 1 % ITS-X 및 사용시 200 NG / ML EGF. </li><li> FBS - 나 (금속 그리드가 완전히 빠져들 수 있도록 약 30 mL를 사용한다) 및 잠수함 금속 격자의 나머지 부분과 10cm 페트리 접시를 채우십시오. 접시는 꼭지 플라스틱 실린더를 열고 지원하십시오. </li></ol> * 금속 격자 철의 만들어집니다. 메쉬 0.5 mm의 측면 사각형 모양입니다. <ol start="3"><li> 10 20 μL 피펫 수술 접착제의 3 μL를 가져 가라. 이 f를 누른 상태에서 플라스틱 실린더의 경계 중 하나에 조심스럽게 적용집게와 IRM. </li><li> 부드럽게 최대한 가까이 스트립의 경계 중 하나, 점막의 정점 측에 실린더를 놓습니다. </li><li> 물론 중앙에 매체의 850 μL-1 ML을 분배하고 플레이트의 중앙 우물의 가장자리에 금속 격자를 지원 단단히 조직에서 실린더를 연결하는 접착제 시간을주고, 가운데 잘 장기 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 멀리 이전과 같이 두 개의 멸균 메스를 사용하여 실린더의 경계에서 여분의 조직을 잘라. </li><li> 부드럽게 연결된 조직으로 실린더를 들고 접시의 중앙에 금속 격자의 기저 측면을 놓습니다. </li></ol> 3. 자극 <ol><li> 원하는 농도 선택의 자극을 사용합니다. </li><li> 피펫 팁 실린더 또는 점막 표면을 방해하지 않고 플라스틱 실린더의 중앙에 적절한 볼륨을 적용합니다. 선택한 볼륨을 균일하게 실린더 내부 표면을 커버해야합니다. 에dicated 볼륨 : 큰 플라스틱 실린더 : 200 μL 보통 플라스틱 실린더 : 100 μL 작은 플라스틱 실린더 : 50 μL </li><li> 까지 기존의 배양기에서 3 시간에 대한 품어. </li></ol> * 당신은 긴 시간 포인트를 배양하고자하는 경우 (3.5 참조) 자극의 아주 작은 볼륨 (20 μL)을 사용하여 확인하고 직접 1 기압의 압력에서 100 % O 2 분위기에서 조직을 배치 . <ol start="4"><li> 혀끝의 얼굴에 매체의 두꺼운 층이 가스 교환 수없는 경우 조직이 2 O 충분하지 않기 때문에, 조직의 혀끝의 표면에 떨어져 자극으로 매체를 가지고 신선한 배지로 교환하지 않는다. 플레이트를 커버. </li><li> 1 기압의 압력에서 100 % O 2 분위기에서 조직을 놓습니다. </li></ol> 4. 수확 <ol><li> 전체 문화 시간 (± 2.5 시간) 24 시간 후주의 일에서 실린더를 제거전자 메스 부드럽게 긁어 접착제 오프의 도움으로 조직하고 (RNA 정화 및 유전자 발현 프로파일 또는 단백질 정제와 서양 얼룩 분석 액체 N2의 면역 및 / 또는 면역 분석, 또는 스냅 동결 수정하여 원하는 분석에 따라 저장 ). </li><li> 사이토 카인 분비 프로파일에 대한 기저 매체를 수확. 펠렛 파편에 7 분 동안 8,000 rpm으로 원심 분리, 에펜 도르프 튜브 (또는 분취)의 상층 액을 전송하고 즉시 -20 ° C.에 저장 </li></ol> * 당신이 이상 상층 액을 유지하려는 경우, -80에서 보관 ° C.를

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

인간의 장 점막에 대한 치료가 유효하게 테스트 할 수있는 생리학 관련 모델에 대한 필요성은 오랫동안 강조하고있다. 많은 연구자들은 그 목적을 위해 지금까지 사용한 셀 5와 마우스 모델 모두 6 잠재적 인 유물과 결함을 발견했습니다. 유망한 전임상 데이터가 자주 얻을 수있다하더라도, 실제로, 이들은 거의 중요한 임상 이득으로 변환하지 않습니다. 이 작품에서 설명하는 방법은, 문화와 편광 방식으로 인간의 창자 점막 절편의 자극에 대한 기존의 프로토콜을 7, 8, 비교적 간단하면서도 효과적인 새로운 적응을 제공합니다. 이 모델은 클리닉에 어떤 종류의 잠재적 인 치료를 복용하기 전에 유효한 사전 임상 데이터의 생성에 대한 훌륭한 보완적인 접근 방법을 제공 할 수 있습니다. 따라서, 불행한 임상 결과 9 잠재적으로 피할 수와 연구자들은 더 많은 수안전 급성...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;시약&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strepto</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>100X ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;재료&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>클로닝 실린더 6x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 실린더 8x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 실린더 10x10 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>금속 그리드</td><td>자체 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>센터 웰 장기 배양 플레이트</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>외과용 접착제 (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>산소 Jar</td><td>자체 제작</td><td></td><td></td></tr><tr><td>산소 탱크</td><td>Air Liquid Sanit&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

인간의 장내 점막의 explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

몇 가지 모델은 현재 현실적으로 상호 작용의 다양한 일어나는 복잡한 인간의 대장의 미세 환경을 시뮬레이션하기 위해 존재한다. 동시에 실수로 음식을 섭취하는 병원성 미생물에 대하여 효과적인 면역 반응을 설치하는 동안 그들은 음식 항원에 대한 전체 면역 반응을 유도 내성 형성으로 적절한 항상성이 직접 이러한 상호 작용에 따라 달라집니다. 장내 항상성은 점액의 부착 / 분해를 조절하는 미생물 (식품 관련 유익한 박테리아 변종 포함)와 호스트 간의 여러 복잡한 상호 작용을 통해도 보존되어, 상피 장벽 항균 펩타이드의 생산, 그리고 &quot;교육&quot; 인구의 고유, 장내 상주 림프 세포의 tolerogenic 또는 면역 표현형 제어 &#39;를 상피 세포. 이러한 상호 작용은 생체 분석에로 재현하는 지금까지 매우 어려웠을배양 세포주 또는 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여. 또한, 마우스 모델은 인간의 창자에 대하여 장 점막 (점액 층 조직, 공생 박테리아 사회)의 구성 요소에 실질적으로 차이가 있습니다. 따라서, 이러한 과민성 대장 증후군, 염증성 장 질환이나 대장 암과 같은 중요한 스트레스 관련 또는 병적 조건을 병원에 데려 수 치료의 다양한 연구가 수행하기 어려운되었습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 우리가 편광 방식으로, 호스트 미생물 및 면역 반응에 의해 현장 조화에서 자신을 유지 인간의 창자 점막의 절편을 자극 할 수있는 새로운 시스템을 개발했다. 편광 혀끝의 자극의 결과에 대한 매우 중요 면역 반응을 이끌어. 그것은 반복적으로 그들이 장 EPI의 정점 얼굴을 무시할 때 동일한 자극이 완전히 다른 반응을 일으킬 수 것으로 나타났습니다thelium, basolaterally 상피 세포를 자극하거나 고유 층의 구성 요소와 직접 접촉으로 오는 tolerogenic에서 면역 원성에 대한 표현형을 전환하고 지역에서 불필요하고 과도한 염증을 일으키는 원인. 우리는 접착에 의해 점막의 정점 얼굴에 자극의 영역이 같은 프로토콜에 설명한다 구분 동굴 실린더 편광 자극을 달성했다. 우리는 다른 세 가지 유산균 균주의 차등 효과 사이 검토하기 위해이 모델을 사용했다. 우리는이 모델 시스템이 건강과 질병 상태에서 프로바이오틱스의 면역 특성을 평가하는 매우 강력한 것을 보여줍니다.

우리는 조직의 웰빙을 유지 적어도 24 시간 동안 문화 건강하고 IBD 인간의 창자 점막을 유지에 성공했다. 문화 시간의 대부분 (전체의 85 % 이상) O 2에서 일어났다면 이전의 관찰 1 항에 따라,이 조직이 기존의 인큐베이터에서 24 시간 (그림 2) 생존하지 않았습니다으로 만 가능했다. 우리는 또한 절편의 다양한 반응을 자극 (혀끝 대 기저)과 자극 2,3의 면역 원성의 극성에 따라이 모델에서 관찰 될 수있는 것으로 나타났습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 다른 프로 바이오 틱 균주는 조직의 부분에 서로 다른 반응을 유도 할 수 보여줍니다. 유산균 plantarum NCIMB8826는 건강한 조직에 놀라 울 정도로 면역 것으로 판명. 두 개의 다른 유산균 균주는 달리, 그것은에 림프 세포의 이동을 유도하지 않았다 만<html> 점막의 와드는 최...

우리는 적어도 24 시간 동안 자극의 다양한 종류에 대한 응답의 문화와 모니터링 인간의 장 점막의 유지 관리를위한 새로운 방법을 소개합니다. 우리의 방법으로, 조직의 극성이 혀끝의 경로를 통해 생리적 자극 수 있도록 유지됩니다.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

다양한 상호작용이 일어나는 복잡한 인간 장내 미세환경을 사실적으로 모사할 수 있는 모델은 현재 거의 존재하지 않습니다. 적절한 ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간의 장점막 자극에 대한 체내(in vivo) 상황을 모사하는 것입니다. 이는 자극제가 기저측(basolateral)에 접촉하는 것을 방지하기 위해 조직의 정단측(apical side)에 케이브 실린더(cave cylinder)를 접착함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 자극제를 처리하며, 이를 통해 유도된 면역 반응을 분석할 수 있습니다.다음으로, 조직의 생존력을 24~36시간 동안 유지하기 위해 조직의 정단측에서 자극을 제거합니다. 얻어진 결과는 면역조직화학 데이터, 사이토카인 분비, 프로파일 분석 등을 통해 다양한 프로바이오틱스 균주의 차별적 효과를 보여줄 수 있습니다. ASIC 챔버와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 최대 20가지 조건을 동시에 분석할 수 있다는 점입니다.이를 통해 배양 시간을 최대 36시간까지 연장할 수 있으며, DNA/RNA 분석, 면역조직화학, 사이토카인 분비 분석 등 다양한 판독 분석을 위한 충분한 재료를 확보할 수 있습니다. 이 모델은 프로바이오틱스 분야에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 다른 기술에 활용하거나 생물학적 제제, 항염증제 등 다른 면역조절제의 효과를 연구하는 데에도 사용될 수 있습니다. 건강한 사람 또는 염증성 장질환 환자의 장점막 조직은 수술 중에 채취해야 합니다.검체를 절제한 후, pen strep이 포함된 HBSS 내에서 냉장 상태를 유지하며 신속하게 실험실로 옮깁니다. 먼저 조직을 버퍼로 세척하고 장간막 물질을 제거하십시오. 다음으로, 조직을 HBSS 버퍼에 담근 상태에서 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 점막층을 점막하층으로부터 분리합니다.페트리 접시 내에서 조직을 완전히 잠기게 유지할 필요는 없으나, 포셉으로 점막 표면을 가급적 적게 접촉하십시오. 다음으로, 멸균된 메스 두 개를 사용하여 음식을 자르는 방식과 유사하게 점막을 최소 1cm 너비의 최대한 긴 스트립 형태로 절단합니다. 절단 후에는 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS로 점막을 부드럽게 세척하여 깨끗이 씻어내십시오.마지막으로, 점막 조각들의 apical side가 위를 향하도록 페트리 접시에 펼쳐 놓습니다. 먼저 신선한 TIS DMEM을 준비합니다. 다음으로, 10 centimeter 페트리 접시에 F-B-S-N-A 약 30 milliliters를 채우고 철제 그리드를 용액에 완전히 잠기게 넣습니다.플레이트를 열어둔 상태에서 플라스틱 실린더를 플레이트 위

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: 인, J. G. 외. 병원체, 공존체, 숙주 장 상피 간 상호작용을 연구하기 위한 인간 대장장 단층. J. Vis. 경험 (2019).이 영상은 콜라겐 코팅된 Transwell 시스템에서 대장유래 상피세포를 배양하여 장벽을 모델링하고 숙주-병원체 상호작용 연구를 가능하게 하는 점액 생성 단일층을 생성하는 절차를 시연합니다.

숙주-병원체 상호작용을 연구하기 위한 장벽 기능을 가진 인간 대장층 단층 생성

이 비디오에서는 쥐의 장 조직 조각과 특정 장내 세균 간의 상호 작용을 연구하기 위해 생체 외 장 장기 배양 시스템을 설정하는 방법론을 설명합니다. 이 장치는 두 쌍의 입력-출력 포트로 구성되며, 첫 번째는 장 조직 내강을 연결하고 특정 박테리아 현탁액을 공급하고, 두 번째는 생체 외 조직 생존력을 유지하기 위해 장치의 웰에 매체를 지속적으로 공급합니다.

숙주-미생물총(Microbiota) 상호작용을 연구하기 위한 생체 외 장기 배양 시스템

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

여기서, 수확 유지하고, 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 리스테리아 마우스 소장 organoids을 치료하는 프로토콜뿐만 아니라, 유전자 발현 및 단백질 적절한 정규화 기술에 중점으로 설명한다.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

우리는 인간의 장 - 온 - 어 - 칩 microphysiological 시스템을 사용하여 확장 된 기간 동안 체외 프로토콜 공동 문화 장내 마이크로 바이 옴과 장 융모에 대해 설명합니다.

에 Microengineered 인간의 장내 융모와 생활 마이크로 바이 옴의 공동 문화 창자 - 온 - 어 - 칩 미세 유체 장치

이 프로토콜은 혼합 된 쥐의 소장 세포의 분리 및 문화에 대해 설명합니다. 이러한 기본 장 배양 기법들을 사용하여 장내 펩타이드 분비 하부 신호 전달 경로의 조사를 가능하게한다.

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

이 프로토콜은 인간 줄기 세포 유래 장전 단층 및 그들의 발달을 평가하는 방법에서 M 세포의 분화를 유도하는 방법을 기술한다.

인간 줄기 세포 유래 Ileal 장용 단층에서 M 세포 유사 세포의 분화 유도

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 연구는 조직 줄기세포에서 유래한 장 오가노이드를 이용한 세균 감염의 시험관 내 조사 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 2차원에서 오가노이드를 배양하고 구분하는 방법, 침착성 대장균으로 감염시키는 방법, 그리고 상피 장벽 돌파, 감염 영상, 상피 RNA 반응 등 주요 측정값을 평가하는 방법을 설명합니다.

숙주-박테리아 상호작용을 연구하기 위한 침입 또는 저저막 추출물에 적용한 2차원 오가노이드 배양

학습하세요 인간 장내 점막 explant 배양 및 편광 자극 방법을 통해 면역 반응을 분석하는 기술입니다. 이 방법은 조직 극성을 유지하며 최대 20가지 조건을 동시에 분석할 수 있습니다.

인간의 장내 점막의 Explants의 문화와 편광 자극을위한 새로운 방법

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