명금의 청각 자극 기능성 자기 공명 영상 (fMRI)

이 절차의 전반적인 목표는 기능적 MRI(fMRI)를 사용하여 송버드의 뇌 내 청각 및 노래 제어 영역에서 소리 인지와 처리를 성공적으로 시각화하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시하는 것입니다. 이를 위해 먼저 고품질의 청각 자극을 준비하며, 이는 기능적 MRI 또는 fMRI 스캔 중에 새에게 제시할 온-오프 블록 패러다임(on-off block paradigm)에 통합될 수 있습니다. 두 번째 단계는 새를 마취시킨 후, 개조된 동물용 베드에 배치하여 MRI 스캐너의 보어(bore) 내에 위치시킴으로써 스캔 준비를 하는 것입니다. 그 다음, 청각 자극 중에 fMRI 영상을 획득할 수 있습니다.

마지막 단계는 획득한 MRI 데이터를 전처리하는 것이며, 여기에는 이미지를 제브라 핀치 아틀라스(zebra finch atlas)에 맞게 정규화하는 과정이 포함됩니다. 최종적으로, 획득한 결과의 시각화와 청각 자극으로 유도된 뇌 활성화 부위를 국소화하기 위해 통계적 복셀 기반 분석(voxel based analysis)을 사용합니다. 전기생리학, 조직학 및 분자 매핑 기술과 같이 태양새 연구에서 더 흔히 사용되는 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 fMRI가 비침습적인 생체 내(in vivo) 방법이라는 점이며, 이를 통해 동일한 개체를 시간에 따라 연구할 수 있고 조사 대상 공정 유발 신경 기질의 위치에 대한 사전 가설 없이도 뇌 전체를 한 번에 분석할 수 있습니다.

이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 조류에게 기능적 MRI를 적용하는 것이 인간이나 설치류에게 동일한 방법을 사용하는 것과는 매우 다르고 훨씬 더 어렵기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이는 대상 동물의 뇌 크기가 작을 뿐만 아니라, 두개골이 수많은 공기강으로 구성되어 있어 자화율 아티팩트(susceptibility artifacts)를 유발하기 때문입니다. 경사 시퀀스(gradient sequence)에 비해 이러한 아티팩트에 덜 민감한 스핀 에코 시퀀스(spin echo sequence)를 사용함으로써, 매우 우수한 공간적 특이성을 가지고 송버드의 전뇌 기능 영상을 촬영할 수 있습니다. 스캐너 보어(bore)는 청각 자극을 왜곡시킬 수 있는 제한된 공간입니다.

따라서 본 프로토콜의 준비를 시작하기 위해, 광섬유 마이크를 사용하여 7T MR 시스템의 보어 내부에서 재생되는 소리 자극을 녹음하고, 사용된 MRI 시스템에 대한 왜곡 정도를 확인하십시오. 여기서는 스캐너 외부와 자석 보어 내 새의 머리 위치에서 녹음한 백색 소음을 통해 강화되거나 억제된 주파수를 확인할 수 있습니다. 이러한 인위적인 강화를 보정하기 위해, 해당 설정에 맞춰 wave lab 소프트웨어를 사용하여 각 자극에 이퀄라이저 기능을 적용하십시오.

본 프로토콜에서 함수는 화면에 표시된 매개변수를 가진 가우시안 커널로 구성됩니다. 여기서 노래 자극은 특정 조류의 여러 개별 노래 모티프가 침묵 구간과 교차하며 구성되어야 하며, 모든 자극에 대해 총 소리 및 침묵의 양이 동일하게 유지되도록 이 침묵 구간의 길이를 조정하십시오. 각 자극의 총 길이는 16초이며, 이는 두 개의 FMRI 영상 획득 시간과 일치합니다.

전체 자극으로 통합하기 전, prep 소프트웨어를 사용하여 매칭된 평균 제곱근(matched root means square)과 400 hertz의 하이패스 필터를 통해 각 곡의 강도를 정규화합니다. 실험은 프레젠테이션 소프트웨어를 사용하여 청각 자극 기간과 휴식 기간이 교대로 나타나는 on off 블록 설계로 구성할 수 있습니다. 각 블록은 이미지 2장의 획득 시간에 해당하는 16초 동안 지속되어야 하며, 각 자극 유형을 25회씩 제시하여 피험자당 자극별로 50장의 이미지를 획득합니다.

조건의 제시 순서는 피험자 내 및 피험자 간에 무작위로 설정해야 합니다. 또한, 스캐너로부터 트리거를 받을 수 있도록 실험 패러다임을 설정하십시오. 이렇게 하면 fMRI 시퀀스의 매 반복 스캔 시 스캐너 소프트웨어가 청각 제시 소프트웨어로 트리거를 보내고, 소프트웨어는 이를 통해 스캔 번호를 등록한 뒤 해당 명령을 실행하게 됩니다.

여기서는 성체 금강앵무새(zebra finches) 사용에 맞게 특별히 조정된 프로토콜을 제시합니다. 금강앵무새는 12시간 명기, 12시간 암기의 광주기 조건의 새장에서 사육해야 하며, 연구 기간 전반에 걸쳐 음식과 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 해야 합니다. 실험당 최소 개체 수는 15마리입니다.

이 수치는 스핀 에코(spin echo) fMRI의 민감도와 실험에서 측정되는 생물학적 현상의 자연적인 개인 간 변동성을 고려한 것입니다. 실험 준비를 위해, 먼저 부리 마스크를 플라스틱 튜브를 이용해 가스 제어 장치에 연결하고, 7T MR 시스템의 MRI 베드에 설치합니다. 산소 및 질소 가스통을 모두 열고 가스 제어 장치의 전원을 켭니다.

또한 피드백 제어 시스템과 온풍 장치를 켭니다. 다음으로, 부리를 마스크에 넣고 새가 완전히 마취될 때까지 머리를 고정하여 산소와 질소가 혼합된 3% isof fluorine으로 금화조를 마취합니다. 이는 발을 살짝 당겨 확인하여 검증할 수 있습니다.

조류가 완전히 진정되면 발을 움츠리지 않게 됩니다. 또한, 조류의 눈이 감기게 됩니다. 실험 전반에 걸쳐 체온을 측정하기 위해 총배설강 온도 프로브를 삽입하고, 호흡률을 모니터링하기 위해 배 아래에 공압 센서를 배치하십시오.

그 다음, 실험 전반에 걸쳐 조류의 몸을 고정하기 위해 재킷을 착용시킵니다. 호흡수를 분당 40~100회로 유지하고 체온을 40°C로 일정하게 유지합니다. 호흡 범위가 너무 낮거나 높으면 그에 맞춰 마취 수준을 조절하십시오.

문제가 지속되면 실험을 중단하고 장치에서 동물을 제거해야 합니다. 회복을 위해 비자성 동적 스피커를 금강앵무새 머리 양옆에 배치하고 이를 앰프에 연결하십시오. 스피커 전선이 온도 프로브에서 멀리 떨어지도록 배치해야 하며, 그렇지 않으면 온도 측정값에 영향을 줄 수 있습니다.

표면 RF 코일을 금강앵무의 머리 위에 배치합니다. 그런 다음 금강앵무를 자석의 중심에 위치시킵니다. 마지막으로, 스캔 전 마취 수준을 1.5% ISO fluorine으로 낮춥니다.

스캔을 시작하려면 먼저 마그넷 내 뇌의 위치를 결정하십시오. 시상면, 수평면, 관상면에서 단일 슬라이스 그래디언트 에코 스카우트 영상을 한 세트 획득하고, 이후 기능적 스캔의 위치 설정에 사용할 멀티 슬라이스 스카우트 영상을 획득하십시오. 그런 다음 그래디언트의 램프 시간을 1000 microseconds로 늘려 그래디언트 노이즈를 줄이십시오.

다음으로, rapid acquisition relaxation enhanced 또는 rare T2 weighted fMRI라고 알려진 시퀀스를 준비합니다. 그 다음, 뇌의 거의 전체를 포함하는 15개의 시상면 슬라이스를 설정하십시오. 이제 프레젠테이션 소프트웨어에서 청각 프로토콜을 선택하여 청각 프레젠테이션 소프트웨어가 스캐너의 트리거를 놓치지 않도록 합니다.

먼저 청각 프로토콜을 시작하십시오. 프로토콜이 완전히 로드되면 fMRI 시퀀스를 시작하십시오. 각 fMRI 실험은 청각 자극을 시작하기 전 신호가 정상 상태(steady state)에 도달할 수 있도록 10장의 더미 이미지(dummy images)를 먼저 획득해야 합니다.

데이터 획득이 완료되면, 데이터를 64 by 64 크기로 채웁니다. 데이터의 품질을 결정하기 위해, 기능 도구를 사용하여 결과물을 예비 검토하십시오.

ParaVision 소프트웨어를 사용하여 모든 on 블록과 베이스라인 사이의 차등 BOLD 반응을 계산하십시오. 일차 청각 영역에서 활성화가 관찰되지 않는다면, 기술적인 문제나 마취 수준으로 인해 조류가 청각 자극을 듣지 못했거나 처리하지 못했을 가능성이 큽니다. 이 경우 설정을 확인하고 측정을 반복해야 합니다.

기능적 영상 획득 후, 이전 fMRI 스캔과 동일한 방향으로 해부학적 3D T2 강조 영상을 촬영하십시오. 그 다음, 이 데이터를 256 x 256 x 256으로 제로 필링(zero fill) 하십시오.

마지막으로 제브라핀치를 MRI 베드에서 제거하고, 열등이 설치된 케이지 내에서 마취로부터 회복될 수 있도록 합니다. 일반적으로 제브라핀치가 ISO fluorine 마취에서 회복되는 데는 5분 미만이 소요됩니다. 단 몇 분 후면 새가 일어서려 할 것이며, 완전히 회복되면 케이지 바닥에 앉아 있는 대신 나뭇가지에 앉게 되는데, 이때부터 데이터 처리를 시작합니다.

먼저, MR 데이터를 analyze 또는 nifty 형식으로 변환합니다. 그다음 SPM에서 데이터 프로세싱을 시작하기 전에, 복셀 크기에 10을 곱하여 송버드의 fMRI 데이터를 조정해야 합니다. fMRI 분석 소프트웨어는 인간에서 획득한 fMRI 데이터를 처리하도록 개발되었으므로, MRI Crow 소프트웨어를 사용하여 조류 fMRI 데이터의 복셀 크기를 인위적으로 늘리는 것이 가장 간단한 진행 방법입니다.

이러한 조정이 데이터 자체에는 영향을 미치지 않는다는 점에 유의하십시오. 재샘플링이나 기타 데이터 수정은 적용되지 않습니다. 다음으로, 획득한 데이터를 전처리합니다.

SPM8을 사용하여 먼저 fMRI 데이터를 재정렬하고, 해부학적 3D 데이터셋을 fMRI 시계열 데이터에 코레지스트레이션(coregister)합니다. 그 다음, 3D 데이터와 코레지스트레이션된 fMRI 시계열 데이터를 제브라 핀치 뇌 MRI 아틀라스(MRI Atlas)에 맞게 정규화합니다.

변환 행렬을 fMRI 데이터 세트에 적용하고, 0.5 mm 가우시안 커널로 데이터를 평활화합니다. 그 다음 SPM 8에서 통계적 복셀 기반 분석을 수행하며, 먼저 개별 조류 수준에서 분석하고 이어서 그룹 수준에서 분석을 진행합니다. 마지막으로 결과를 시각화하고 기능적 활성화 부위를 국소화하기 위해, 통계적 파라미터 맵을 고해상도 3D 제브라피نش 뇌 아틀라스인 제브라피نش 아틀라스에 투영합니다. 본 제브라피نش fMRI 결과 분석에 사용된 정위 좌표계는 Bioimaging lab의 MRI 아틀라스 데이터 세트에서 이번 실험을 위해 설계되었습니다.

뇌 구획 및 핵 구획 정보는 여기 보이는 웹사이트를 통해 자유롭게 이용할 수 있습니다. 여기서는 아틀라스에서 구획된 구조들이 정중시상면 슬라이스에 투영된 좌반구 3D 표현의 측면도가 표시되어 있습니다. 여기서 휴식 상태와 비교하여 서로 다른 청각 자극에 의해 유발된 일차 청각 영역 field L 및 인접한 이차 청각 영역의 fMRI BOLD 반응 예시를 확인할 수 있습니다.

T 값은 그림에 표시된 척도에 따라 색상으로 구분되며, T-검정 결과 유의미한 것으로 나타난 복셀만 표시됩니다. 이는 제브라피니치를 대상으로 한 FMRI 실험의 또 다른 사례입니다. 영상은 뇌 영역인 area XMLD 및 HVC에서 새 자신의 노래에 대한 선택적 반응을 보여줍니다.

이미지 아래의 숫자는 정중선으로부터의 좌표를 밀리미터(mm)로 나타낸 것입니다. 양수(+) 부호는 슬라이스와 통계 결과가 우반구에서 얻어졌음을 의미합니다. 이 비디오에서 설명하는 프로토콜은 찌르레기와 같은 다른 송버드류 응용 분야에 쉽게 적용할 수 있습니다.

이것은 이러한 fMRI 실험 결과의 예시입니다. 찌르레기에서, 이 그림은 동일 개체에서 계절에 따라 청각 자극과 휴식 상태 간에 유도된 활성화를 보여줍니다. 송버드(songbirds)에 대한 기능적 MRI의 구현 및 최적화는 송버드 연구 분야에서 새로운 연구 경로를 열어줍니다.

이 기술은 이미 이러한 동물 모델의 음성 통신 기저에 있는 복잡한 감각 운동 및 인지 과정의 실험적 분석을 위한 가치 있는 기법임이 입증되었습니다. 또한, 비침습성과 전뇌 접근 방식 덕분에, 모든 FMRI는 더 일반적으로 수행되는 국소적 및 침습적 방법들을 보완하는 방법으로 사용될 수 있습니다. SUNBIRDS에서의 FMRI 실험 수가 증가하고 있다는 점은 인지 연구 질문에 대한 적용 가능성을 보여주며, 향후 MRI 실험을 청각 처리 과정 너머로 더욱 확장하기 위한 노력이 필요합니다. 청각 처리는 마취 상태에서도 활발하게 유지되는 과정이며, 이를 확장하는 방법은 영상 촬영 프로토콜에 적응된 각성 상태의 피험자를 이용하는 것입니다.

이는 조류가 EMI 실험에 능동적으로 참여하고 조류의 주의 집중을 실험적으로 제어할 수 있는 새로운 연구 가능성을 제공할 수 있습니다.