간 간선 재건과 부분 Orthotopic 간 이식의 쥐 모델에 대한 외과 절차

본 절차의 전반적인 목적은 이식 연구를 위한 재현 가능한 실험 모델로서 쥐에서 부분 정위성 간 이식을 수행하는 것입니다. 이는 우선 공여자 쥐로부터 간을 적출함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 50% 간 절제를 포함한 간 이식편의 ex vivo 준비 과정입니다.

다음으로, 수혜 쥐의 자가 간을 절제합니다. 마지막 단계는 부분 간 이식편을 수혜 쥐에게 이식하는 것입니다. 최종적으로, 이식 후 간 이식편의 간세포 손상을 평가하기 위해 혈청 알라닌 아미노전이효소 수치를 측정합니다.

일반적으로 이 실험을 처음 접하는 연구자들은 고도의 미세수술 기술이 요구되는 전체 과정의 복잡함으로 인해 어려움을 겪습니다. 이 절차를 시작하려면, 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 동물이 완전히 마취되었는지 확인한 후 마취된 공여 랫드를 가온 패드 위에 놓으십시오. 그 다음 자기 고정 견인 시스템(magnetic fixator retraction system)을 사용하여 상완을 고정하십시오. 랫드의 복부 전체 영역의 털을 깎고, 해당 피부를 포비돈 요오드 용액으로 멸균하십시오.

정중선 절개와 양측 확장을 통해 복부를 엽니다. 5 mL 주사기를 쥐의 등 아래에 배치하여 간상정맥(supra hepatic vena cava)이 복측으로 들어 올려지게 하고, 모스키토 포셉 클램프를 사용하여 해당 부위를 머리 쪽으로 당긴 뒤 늑골 하 견인기를 적용하여 수술 시야를 확보합니다. 시술 중 견인기와 5 mL 주사기를 빈번하게 조작해야 하므로, 절개 부위 주변에는 수술용 드레이프를 사용하지 않습니다. 16배 배율의 수술 현미경 하에서 낫인대(falciform ligament)와 좌측 삼각인대를 박리하고 좌측 횡격막 정맥을 분리한 후, 젖은 거즈 스왑으로 중앙엽과 좌측 외측엽을 위쪽으로 견인합니다.

양극성 핀셋을 사용하여 왼쪽 외측엽과 전측 협동엽 사이의 식도 주위 혈관을 응고시키고 분리합니다. 장을 복강 밖의 쥐 왼쪽으로 옮기고 젖은 거즈 솜으로 덮어줍니다. 젖은 거즈 솜을 사용하여 오른쪽 외측엽을 위쪽으로 견인합니다.

후복막 조직으로부터 간하대정맥을 분리하고 우측 부신정맥을 결찰합니다. 이 정맥은 추후 이식물 제거 직전 담관에 스텐트를 삽입하기 위해 절단될 예정입니다. 먼저 위십이지장동맥의 분지 지점에서 담관을 결찰합니다. 결찰 지점의 근위측 담관 전벽에 작은 절개를 가한 다음, 왼손의 직형 미세 포셉으로 절개된 전벽을 잡고 오른손의 만곡형 미세 포셉을 사용하여 담관 내에 스텐트를 삽입합니다. 6-0 실크사로 이를 고정합니다.

나중에 문합술을 수행할 때 실을 잡을 수 있도록 담관에 묶은 실의 절단단 한쪽을 4 mm 길이로 남겨둡니다. 문맥을 문정맥 및 비정맥으로부터 결찰하고 절단하여 분리하고, 위십이지장동맥을 결찰 및 절단합니다. 그런 다음 췌장 머리 부분부터 뿌리까지의 총간동맥을 분리합니다.

면봉을 사용하여 간을 오른쪽으로 회전시키고, 준비 과정이 완료되면 간 뒷부분과 식도 주변의 인대를 절개합니다. 간 적출을 위해 리트랙터와 검상돌기 고정용 모스키토 포셉, 그리고 쥐의 등 아래에 놓인 5 mL 주사기를 제거합니다.

장(intestines)을 복강으로 되돌려 놓습니다. 2 mL의 생리식염수에 희석한 500 IU의 heparin natrium을 음경 정맥을 통해 주입합니다. 약 3분 후, 5 mL 주사기, 모스키토 포셉(mosquito forceps) 및 리트랙터(retractor)를 다시 준비하여 간동맥의 근위부 뿌리 쪽을 결찰합니다.

절단된 실의 한쪽 끝을 총간동맥용 결찰용으로 남겨둡니다. 하간정맥을 클램핑한 후 충분한 시간이 지난 뒤, 모스키토 포셉을 사용하여 우측 신정맥 근처를 폐쇄합니다.

비장정맥의 절단단 아래쪽에서 일회용 미세 혈관 클램프로 간문맥을 고정합니다. 간문맥의 전벽을 절개하고 18 gauge 카테터를 간문맥 내로 삽입합니다. 60 milliliters의 차가운 histidine tryptophan ketoglutarate 용액으로 간을 in situ 관류합니다.

20 centimeters의 정수압 상태에서, 횡격막, 흉강 내 대정맥, 그리고 간하 대정맥의 전벽을 즉시 절개하여 관류액이 간에서 씻겨 나가도록 합니다. 간 바로 아래의 간하 대정맥을 미세 혈관 클램프로 고정합니다. 간하 대정맥을 박리하여 간을 적출합니다.

간문맥, 횡격막, 나머지 인대, 우측 부신정맥 및 총간동맥을 절단합니다. 절제한 간을 쇄빙제로 채운 플라스틱 상자 안에 설치된 금속 컵 내의 차가운 HTK 용액에 넣습니다. 간 이식편에 대한 처치는 얼음처럼 차가운 HTK 용액이 채워진 금속 컵에서 수행하며, 간문맥에 커프를 부착하기 위해 DeBakey 불독 클램프로 간문맥 주간을 집고 클램프를 컵 위에 가로지르는 위치에 둡니다.

간문맥을 커프(cuff)에 통과시킨 후, 12시 방향에서 커프의 연장 부분과 함께 간문맥을 다시 클램프로 고정합니다. 간문맥 벽을 커프 위로 젖혀 비정맥의 단단(stump)이 7시 방향의 커프 바깥쪽에 위치하도록 하고, 간동맥에 스텐트를 삽입할 수 있도록 6-0 실크사로 간문맥을 고정합니다. 포셉으로 횡격막의 양 끝을 클램핑하여 간을 고정하고, DeBakey 불독 클램프와 직선 마이크로 가위로 결찰된 실을 잡아 총간동맥을 곧게 폅니다. 왼손을 사용하여 총간동맥의 앞벽에 작은 절개를 만듭니다.

직선 마이크로 포셉으로 절개창의 전벽을 잡고, 오른손으로 총간동맥에 스텐트를 삽입합니다. 곡선 마이크로 포셉을 사용하여 6-0 실크사로 스텐트를 고정하고, 절단된 실의 한쪽 끝 길이를 4mm로 유지합니다. 50% 간 절제를 위해 동맥 카테터를 통해 5mL의 차가운 HTK 용액으로 간을 세척합니다.

먼저 후좌표엽을 모스키토 포셉으로 집어 고정합니다. 그 다음 4-0 실크사로 그 경부를 결찰하고 엽을 절제합니다.

전방 관상엽을 동일한 방식으로 제거합니다. 다음으로, 플라스틱 상자를 90도 회전시킵니다. 횡격막의 오른쪽 가장자리와 중앙엽의 왼쪽 부분을 클램프로 고정합니다.

내측 엽(medial lobe) 양측 부위 경계의 상단 가장자리에 작은 절개를 가한 후, 결찰 후 왼쪽 부분을 제거합니다. 4-0 실크사로 혈관경을 결찰한 다음, 좌측 외측 엽(left lateral lobe)을 제거하고, 양극성 포셉으로 절제된 간 표면을 조심스럽게 소작합니다. 이제 상간정맥(supra hepatic vena cava) 성형술을 위해 간 질량이 약 50% 감소되었습니다.

먼저, 모스키토 포셉(mosquito forceps)으로 횡격막의 양쪽 가장자리를 집어 간의 위치를 고정합니다. 그런 다음 해당 횡격막 부위를 제거하여 간상대정맥(supra hepatic vena cava)의 전벽을 다듬습니다. 이후 문합을 위해 양쪽 모서리에 외부에서 내부 방향으로 2 7 0 폴리프로필렌 봉합사를 고정 봉합사(stay sutures)로 부착합니다.

그 후, 간상대정맥(supra hepatic vena cava)의 후벽을 다듬습니다. 간 이식편을 HTK 용액에 담아 4 °C의 냉수조에 보관하십시오. 공여자의 수술과 동일한 방식으로 수혜자의 수술 준비를 하고, 정중선 절개를 통해 복부를 엽니다.

적신 거즈 면봉을 십이지장 우측과 소장 전체 위에 놓습니다. 간하대정맥 주변에 수술 부위를 확보하십시오. 좌측 외측엽과 중앙엽을 좌측 횡격막하강에 넣고, 적신 거즈 면봉으로 우측 외측엽을 위쪽으로 견인합니다.

후복막 조직의 인대를 통해 간하대정맥을 분리하고, 젖은 거즈와 면봉을 사용하여 우측 부신정맥을 절단합니다. 간을 왼쪽으로 회전시키고 간 뒷부분의 인대를 박리합니다. 미상엽에서 분지되는 부위 바로 아래에서 담관을 절단합니다.

실의 절단된 끝단 중 하나를 4mm 길이의 담관 결찰용으로 남겨둡니다. 위십이지장동맥과 고유간동맥을 총간동맥 분지점으로부터 3mm 거리에서 결찰하고 절단하여, 총간동맥 끝부분에 동맥의 넓은 구조를 형성합니다. 우측 신정맥 바로 위쪽의 간하대정맥과 간문부 분지 지점의 문맥을 금속 미세혈관 클램프로 클램핑합니다. 횡격막과 함께 간상대정맥을 말초혈관 클램프로 클램핑하고, 클램프를 유성 점토 덩어리에 고정합니다. 이소플루레인 마취 농도를 0.4 volume percent로 낮춥니다. 간상대정맥과 간의 경계 부위에서 간상대정맥을 박리하여 수혜자의 원래 간을 절제합니다.

모기 집게(mosquito forceps)의 조(jaw) 바로 윗부분의 문맥과 간과 우신정맥 사이 중간 지점에서 약간 아래쪽의 간하대정맥을 확인합니다. 간 이식편을 정위(orthotopically)로 배치합니다. 혈관 재건은 이 절차에서 가장 어렵고 중요한 부분입니다.

상간정맥의 연속 봉합 문합술은 매우 주의하면서도 신속하게 수행해야 합니다. 이식편의 오른쪽 모서리에 부착된 7-0 폴리프로필렌사를 사용하여 수혜자의 상간정맥 안쪽에서 바깥쪽으로 견인 봉합사를 배치한 후, 동일한 방식으로 매듭을 짓습니다. 왼쪽 모서리에 두 번째 견인 봉합사를 배치합니다.

이 단계는 연속 봉합의 시작점이 됩니다. 문합부를 넓히기 위해, DeBakey 불독 클램프를 사용하여 양쪽 모서리의 봉합사를 잡고 위쪽 외측으로 부드럽게 견인하며 유지합니다. 다음으로, 왼쪽 모서리에서 그라프트 쪽 벽의 외부에서 내부로, 외부의 매듭과 가깝게 봉합사를 통과시킨 후, 정맥관(vena cava)의 후열 내강을 오른쪽 모서리까지 7~8바늘 봉합합니다.

내측 루멘이 정확한 모서리에서 서로 마주하도록 처음 몇 바늘을 주의 깊게 꿰맵니다. 7-0 폴리프로필렌 봉합사를 그라프트 쪽 혈관을 통해 바깥쪽으로 통과시킵니다. 바깥쪽에서 오른쪽에서 왼쪽 방향으로 전열을 약 10바늘 정도 봉합합니다.

내부를 젖산 링거액(lactated ringer solution)으로 세척합니다. 기포를 제거하기 위해 마지막 봉합을 유지 봉합(stay suture) 가까이에 실시한 후, 이들을 함께 묶어줍니다. 문맥 재건을 위해 미세 혈관 클램프로 문맥을 집고, 모스키토 포셉(mosquito forceps)을 점토에 고정합니다. 다음으로 모스키토 포셉의 턱 바로 아래쪽 문맥 전벽을 절개합니다.

수신측 문맥 내부와 커프를 젖산 링거액으로 세척합니다. 커프를 문맥에 삽입하고 6-0 실크사로 원주 방향으로 묶어 고정합니다. 마지막으로 간을 재관류합니다.

쥐의 등 부분에서 5 mL 주사기를 제거하고, 스텐트 기법을 이용한 간 재건을 위해 isof fluorine의 농도를 0.8 volume percent로 높입니다. 먼저, 모스키토 포셉으로 고유간동맥의 실을 잡고 점토에 고정합니다. 그 다음 수혜측 총간동맥을 클램핑합니다.

총간동맥 끝부분의 Y자 구조 분기점에 작은 절개를 가하여 깔때기 모양의 개구부를 만듭니다. 이식편 총간동맥에 배치된 스텐트를 곡선형 미세 핀셋으로 잡습니다. 스텐트를 수혜자의 총간동맥 안으로 밀어 넣고 6-0 실크사로 고정합니다. 이 실의 한쪽 끝과 이식편 총간동맥의 4mm 실을 함께 묶어, 두 총간동맥이 서로 가까워지게 함으로써 문합 부위의 긴장도를 낮춥니다.

그 후, 간하대정맥의 문합을 위해 클램프를 제거하고, 간상대정맥과 동일한 방식으로 연속 봉합술을 시행하되, 더 가느다란 바늘땀으로 더 많은 횟수의 봉합을 실시합니다. 클램프 제거 후, 담도 재건을 위해 마취제 농도를 1.0 volume percent로 높입니다. 수혜측 담도의 실을 모스키토 포셉으로 잡고 점토에 고정합니다.

재건된 담도가 너무 길어지지 않도록 적절한 높이의 담관에 작은 절개를 만듭니다. 스텐트를 삽입하고 6-0 실크사로 고정합니다. 이 실과 이식 담관의 실을 함께 묶습니다.

이제 모든 재건 과정이 완료되었습니다. 4-0 Vicryl 봉합사를 사용하여 복부 절개 부위를 층별로 연속 봉합하여 닫습니다. 수술 직후, 수혜 쥐에게 1.5 mL의 생리식염수에 희석한 sphero sodium과 buprenorphine을 피하 주사하여 처치합니다.

쥐를 일반 케이지로 옮기기 전, 따뜻한 공기와 산소가 공급되는 특수 집중 치료 케이지에서 60분 동안 회복하도록 합니다. 모든 수혜 쥐는 문맥 재관류 후 1, 3, 24 및 168시간에 혈액 샘플링을 위해 계획된 안락사 시점까지 생존했습니다. 혈청 샘플을 분석하여 이식 후 간 이식편의 간세포 손상 정도를 반영하는 알라닌 아미노전이효소 수치를 측정하였습니다.

이 그래프에서 보시는 바와 같이, LT 수치는 24시간에 정점에 도달한 후 168시간 이내에 정상 범위로 감소했습니다. 이 영상을 통해 이식 연구를 위한 재현 가능한 실험 모델로서 쥐의 부분 국소 간 이식을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다.