의 해부, 문화, 및 분석

본 실험의 전반적인 목적은 Xenopus 망막 세포의 일차 세포 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 주변 조직을 제거하여 망막을 노출시킨 후, 두 번째 단계로 망막 조직을 절제함으로써 수행됩니다.

다음으로, 망막 조직을 단일 세포로 분리합니다. 마지막 단계는 UnCloned 디시에 망막 세포를 플레이팅하고 calcium imaging을 위해 flu oh 4:00 AM을 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 망막 세포 배양의 칼슘 활성을 검출합니다.

이 방법은 망막 발달에서 칼슘과 전기적 활동의 역할뿐만 아니라 단일 세포 수준의 유전자 발현과 같이 발생 생물학, 신경 생물학 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 실험 절차가 처음인 사람은 적시에 정확한 박리를 수행하기 위해 미세한 운동 능력이 필요하므로 어려움을 겪을 것입니다. 정교한 손-눈 협응 능력이 필수적이어서 박리 단계가 까다롭기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.

후드 내에서 이 절차를 시작하려면, 해부 플레이트로 사용할 10 mL의 세포 배양 배지가 담긴 60 mm 플라스틱 페트리 접시 하나를 준비하여 라벨을 붙입니다. 선택 사항으로, 25단계 이하 배아의 해부를 위해 조직층 분리를 돕고자 최종 농도가 1.0 mg/mL가 되도록 10 mg의 collagenase B를 해부 플레이트에 추가할 수 있습니다.

또한, 배양 플레이트로 사용할 2 mL의 세포 배양 배지가 담긴 35 mm 론 표면 디쉬(lon surface dish) 1개를 준비하십시오. 조직 해리 튜브로 사용할 빈 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 1개와 15 mL가 담긴 15 mL 원추형 팰콘 튜브 1개를 준비하십시오.

세포 배양 배지입니다. 그 다음, 해부를 위해 2mL의 CMF가 담긴 35mm 플라스틱 페트리 접시 2개를 준비하며, 하나는 조직편 해리 플레이트로, 다른 하나는 후드 외부에서 조직편 세척 플레이트로 사용합니다. 10mL가 담긴 60mm 플라스틱 페트리 접시 2개를 준비하십시오.

0.1 XMMR을 준비하며, 하나는 유지 플레이트로, 다른 하나는 형제 플레이트로 사용하고, 추가로 10 mL의 0.1 XMMR과 0.5 mg/mL MS 2 22가 포함된 60 mm 플라스틱 페트리 접시를 준비합니다. 그 후, 해리 플레이트의 설명 부분에 40 µL의 5% CMF 내 trypsin을 첨가합니다.

소용돌이 모양으로 섞은 후 그대로 둡니다. 다음으로, 두 쌍의 미세 핀셋을 사용하여 해부 현미경으로 해부를 진행합니다. 배아의 후단에서 시작하여 배아 앞부분의 시멘트 샘(cement gland)을 통과하도록 복측에 정중시상절개를 가합니다.

절단 부위의 양측을 벌려 배아를 조심스럽게 엽니다. 이렇게 하면 배아의 등쪽이 해부판을 향하게 됩니다. 그런 다음 복측 외배엽을 열어 내배엽과 중배엽을 노출시킵니다.

다음으로, 이 조직의 첫 번째이자 가장 큰 층인 내배엽과 중배엽을 제거합니다. 내배엽은 큰 세포들로 구성되어 있으며 뚜렷한 조직화가 거의 보이지 않는 매우 푹신한 외형을 띱니다. 이 층을 제거하고 나면 체절(somites)과 신경관(neural tube)이 보이게 됩니다.

대조도를 높이기 위해, 배아를 10 mL의 세포 배양 배지와 1% Nile blue sulfate 용액 100 µL가 포함된 별도의 60mm 플라스틱 페트리 접시로 옮겨 2~3분 동안 배양합니다. 그 후, 다시 해부 플레이트로 옮깁니다. 이 과정은 외배엽, 체절 및 Noor를 염색하여 더 쉽게 식별하고 방향을 잡을 수 있게 합니다.

배아의 전단부에 집중하여, 뇌와 시각포가 드러나도록 신경판과 남아있는 중배엽을 조심스럽게 제거합니다. 뇌와 시각포가 완전히 노출되면, 핀셋을 사용하여 뇌 바로 뒤쪽의 신경관과 그 아래의 외배엽을 절단합니다. 외배엽이 위로 오도록 이 부분을 뒤집습니다.

하부의 optic vesicles가 손상되지 않도록 주의하며 ectoderm를 조심스럽게 제거하십시오. 마지막으로, stage 25 이후의 배아를 해부할 때는 포셉을 사용하여 optic vesicles를 뇌에서 분리하십시오. 먼저, 마취 플레이트에서 포셉으로 배아의 복측 부분을 제거하십시오.

대조도를 높이기 위해, 외배엽을 염색시키고자 배아를 10 milliliters의 0.1 XMMR과 100 microliters의 1% Nile blue sulfate가 포함된 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시에 2~3분 동안 옮겨둡니다. 그런 다음 이를 해부 플레이트로 옮깁니다. 이어 배아를 고정시킨 상태에서 상단의 외배엽 바로 아래에 위치한 망막 또는 시포를 조심스럽게 제거합니다.

시각낭 또는 망막을 적출한 후, 에어로졸 방지 팁이 장착된 P 100 마이크로 파이펫을 사용하여 X 조직 세척 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다. 이때 조직이 공기-액체 경계면에 닿지 않도록 주의하십시오. 그 다음, 조직을 30초 동안 그대로 둡니다.

다음으로, explant 분리 플레이트에서 0.1% trypsin in CMF 80 µL를 explant 분리 튜브로 옮깁니다. 그 후, explant 세척 플레이트에서 망막 또는 optic vesicle을 explant 분리 튜브로 옮깁니다. 이때 explant 세척액이 함께 옮겨지지 않도록 주의하십시오.

그 후 조직을 explant 해리 튜브에 넣고 상온에서 1시간 동안 해리시킵니다. 실험 과정 전반에 걸쳐 세포 이미지를 여러 번 촬영해야 하는 경우, 소량의 순간접착제를 사용하여 배양 플레이트 바닥면에 그리드를 부착하십시오. 이렇게 하면 세포 플레이팅 과정의 서로 다른 시점에서 동일한 방향의 동일한 세포 이미지를 촬영할 수 있습니다.

먼저, explan 해리 튜브에서 용액 40 µL를 천천히 제거하여 버립니다. 그다음 에어로졸 방지 팁이 장착된 P 100을 사용하여 세포를 배양 플레이트로 천천히 옮깁니다. 플레이트에 세포를 분주할 때는 천천히 피펫팅하며, 세포가 플레이트 중앙의 좁은 영역에 모이도록 합니다.

이 그림은 1시간의 이미징 동안 단일 세포의 칼슘 활성 예시를 보여줍니다. 이 그림들은 서로 다른 발달 단계에서 분석된 배아 망막 세포의 칼슘 이미징 실험에 대한 대표적인 결과를 제공합니다. 간단히 요약하면, 결과는 특정 프로브 양성 세포와 칼슘 활성의 상관관계를 통해, 칼슘이 발달 단계에 따라 조절되며 35단계에서 스파이킹 피크(spiking peaks)가 나타남을 보여줍니다.

어류 실험에서 통계적으로 유의미한 차이는 없었으나, GABA 작동성 마커 양성 세포가 글루탐산 작동성 마커 양성 세포나 GABA 작동성 표현형 촉진과 상관관계가 있는 전사 인자를 인코딩하는 PT F1 A.A 유전자 양성 세포보다 더 높은 수준의 칼슘 스파이킹 활성을 보이는 경향이 있었습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 플레이트 하나당 약 3시간 30분 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에 세포 배양, C two 하이브리드화 또는 전기생리학적 기록과 같은 다른 방법들을 사용하여 어떤 세포가 특정 표현형 마커를 발현하는지와 같은 추가 질문에 답하거나 전기생리학적 기록을 분석할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 망막 조직을 박리하고, 망막 조직을 해리하며, 망막 세포를 플레이팅하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.