Name: 의 해부, 문화, 및 분석 Xenopus laevis 배아 망막 조직 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 학습하세요 Xenopus laevis 배아 망막 조직의 해부, 단일 세포 분리 및 배양 방법을 통해 칼슘 활성을 공초점 현미경으로 분석하는 기술입니다. 이 방법은 망막 세포 생리학 연구에 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 스크립트에 박사 존 헤이즈 감사, Drs. 에릭 브레 디하고 공 촛점 현미경과 지원 크리스토퍼 델 흑인, 드류 휴즈, 프로젝트를 개발하고 예비 데이터를 제공에서 그의 작품을위한 로라 Odorizzi, 알렉스 Garafalo, 레베카 Lowden, 그리고 리즈 MacMurray, 통계 분석에 대한 유용한 제안 박사 그렉 스미스. 이 작품은 MSS에 대한 NIH 보조금 (NINDS IR15N5067566-01)와 윌리엄과 메리의 대학에 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 교부금에 의해 지원되었다.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

모든 vertebrates에서 보존 아르는 잘 특징 세포 유형으로, 망막은 셀 타입 사양과 차별화에 관한 분자 - 세포 프로세스를 공부에 유용한 모델을 제공합니다. 기본 세포 배양은 유전자 발현, 단백질 역학, 그리고 칼슘 및 단일 셀 해상도 수준의 전기 활동을 포함한 과정의 광범위한 조사를위한 강력한 방법을 갖게. 여기에 우리가 추정 망막 개발하고 기본 세포 배양의 매우 초기 단계에서 쉽게 액세스 할 수 있는지 Xenopus laevis, 주어진 이러한 연구 특히 의무가 유기체의 해부 추정 망막 조직의 기본 세포 배양을위한 간단한 기술을 제시가에 발생할 수 있습니다 간단한 생리 식염수로 구성된 정의 미디어. 대부분의 실험실 설정에 쉽게 적응하지만, 특히 세심한주의가 필요합니다 몇 가지 단계가 있습니다. Dissecti기능은 신선한 날카롭게 포셉을 수행해야합니다. 세포 배양 매체와 혼합 Collagenase B 치료의 젊은 단계 (&lt;ST. 30) 혜택을 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Dissections 및 배양을위한 </td></tr><tr><td> BD 팔콘 쉬운 그립 조직 문화 요리, 35mm </td><td> 어부 </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> 일회용 폴리스티렌 페트리 요리, 60 X 15mm </td><td> 어부 </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35mm Nunclon 표면 배양 접시 (Airvent 포함) </td><td> 어부 </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> 뒤몽 좋은 집게 (Dumostar # 55) </td><td> 어부 </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice 마이크로 지배 플라스틱 coverslip, 25mm </td><td> 어부 </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> 에틸 m-Aminobenzoate Methanesulfonate 소금 (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicin 황산 </td><td> 엔조 생명 과학 </td><td> 380-003 - G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco 트립신 (1:250) 파우더 </td><td> 생명 기술 </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> 클로스 트리 디움 histolyticum에서 Collagenase B </td><td> 로슈 </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> 나일 블루 황산 (선택 사항) </td><td> Pfaltz &amp; 바우어 </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ML 진공 필터 / 저장 병 시스템, 0.22 μm 기공 33.2 cm 두 CN 막 </td><td> 코닝 </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> 칼슘 이미징을위한 </td></tr><tr><td> Fluo-4는 DMSO의 1 ㎜ 솔루션, 영구 세포 AM </td><td> 생명 기술 </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> 물에 Pluronic F-127 10 % 솔루션 </td><td> 생명 기술 </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 공 촛점 현미경 시스템 </td><td> Zeiss </td><td> 모델 중단 </td><td></td></tr><tr><td> 시약 차단 </td><td> 로슈 </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 현장 하이브리드 화에 형광등 (물고기)의 경우 </td></tr><tr><td> 안티 Digoxigenin-POD, 팹 조각 </td><td> 로슈 </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> 안티 - DNP-HRP 항체 </td><td> Perkin-엘머 </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS 에스테르 </td><td> GE 헬스 케어 </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluorescein </td><td> 열 과학 </td><td> 46,409 </td><td></td></tr><tr><td> 포름 아미드, Deionized </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA 타입 IX </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> 돼지 창자 점막에서 헤파린 나트륨 소금, </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> 고맙네 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 2. 특정 시약 및 장비. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 용액 </td><td> 참고 </td><td> 내용 </td></tr><tr><td> 세포 배양 매체 </td><td> 장과 스피처 2009 년 54 </td><td> 116 MM NaCl 0.67 MM KCl 이 MM CaCl 2 1.31 MM MgSO 4 4.6 MM 트리스 1퍼센트 (V : V) 페니실린 / 스트렙토 마이신 HCL와 7.8 산도를 조정합니다. 0.22 μm의 CN 필터를 통과하여 소독을 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C.에 저장 </td></tr><tr><td> 칼슘 마그네슘 무료 매체 (CMF) </td><td> 번지 외 1994 년 42,. 번지와 스피처, 1995 55 </td><td> 116 MM NaCl 0.67 MM KCl 4.6 MM 트리스 0.4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1퍼센트 (V : V) 페니실린 / 스트렙토 마이신 HCL와 7.8 산도를 조정합니다. 0.22 μm의 CN 필터를 통과하여 소독을 필터링 할 수 있습니다. 4 ° C.에 저장 </td></tr><tr><td> Maleic 산 버퍼 (적인 mAb) </td><td> Sive 외., 2000 53 </td><td> 100 MM maleic 산성 150 MM NaCl (산도 7.5). </td></tr><tr><td> 10X 마크의 수정일 Ringers (MMR), </td><td> Sive 외., 2000 53 </td><td> 100 MM NaCl MM KCl 1 ㎜ MgSO 4 이 MM CaCl 2 5 MM HEPES pH는 NaOH와 7.4로 조정 0.1X MMR은 50 MG / ML gentamicin 황산과 산도가 NaOH와 7.4로 조정이 포함되어 있습니다. </td></tr><tr><td> MEMFA 솔루션, 10X </td><td> Sive 외., 2000 53 </td><td> 0.1 M를 처리 (PH 7.4) 이 MM EGTA 1 ㎜ MgSO 4 3.7 %의 포름 알데히드 10X 솔루션은, 포름 알데히드없이, 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 포름 알데히드는 (표준 37% 주식의 10분의 1 볼륨) 신선한 추가됩니다. </td></tr><tr><td> 현장 하이브리드 화 버퍼에서 </td><td> Siv전자 외., 2000 53 </td><td> 50 % 포름 아미드 5 배 SSC 1 MG / ML Torula RNA 100 MG / ML 헤파린 1X Denhart의 솔루션 0.1 % 십대 초반 20 0.1 % 챕스 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산). </td></tr></tbody></table> 페니실린과 스트렙토 마이신은 우리의 문화 미디어에 사용되는 동안 솔루션. * Gentamicin, 항생제는 우리 MMR 솔루션에서 사용됩니다. </td></tr></tbody></table>

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

신경 판의 앞쪽 영역이 척추 망막에 상승을 제공하는 과정은 임상과 기초 모두 연구의 주요 초점이되고 있습니다. 망막 질환을 이해하고 치료에 대한 명백한 의료 관련뿐만 아니라, 척추 망막의 개발을 이해 neuronal 세포 유형 결정과 차별화 1-16에 대한 중요하고 우아한 모델 시스템으로 제공하고 있습니다. 신경 망막은 틀에 박힌 층에 배치 여섯 개별 세포 유형 (신경절, 수평, amacrine photoreceptors, 양극성 세포와 뮐러 glial 세포), 대체로 모든 vertebrates 12,14-18 사이에 보존되어있는 패턴으로 구성됩니다. 그대로 개발 배아에서 망막을 공부하는 것은 분명이 복잡한 기관은 계층 구조로 forebrain의 돌출부에서 어떻게 전개되는지 이해가 필요합니다 동안 이리저리 혜택을 많은 질문이 있습니다m 추정 망막 세포의 주요 세포 배양 7,19-23을 사용하여 방식을 채용. 예를 들어, 서로 다른 단계에서 제거 dissociated 조직의 세포를 분석하는 것은 하나는 다른 발달 단계에서 개별 셀의 사양의 상태를 분별 할 수있다 즉, 주변 조직 8,19-22와의 상호 작용의 부재에있는 세포의 운명 ,24-33. 기본 세포 배양은 또한 탐정 특정 시약과 문화를 처리하고 단일 세포 수준 5,8,21,24,27-30,33-39에 결과를 분석 할 수 있습니다. Xenopus laevis의 연구 고전 모델 시스템은 초기 신경 발달 19,27,29,31-32,40-42은 망막 기본 세포 배양 10,38,43-45에 특히 적합한 시스템으로 제공하고 있습니다. 추정 망막 조직은 즉시 신경 유도 25,38,43 따라 개발 초기 단계에서 액세스 할 수 있습니다. 또한, 일을 부여태아의 각 셀 노른자의 공급을 포함에서 망막 세포가 버퍼 소금 솔루션으로 구성된 매우 간단한 정의 미디어에서 배양 할 수 있습니다, 따라서 부화 또는 기타 커 기반 제품 10,24,44-45의 혼란 효과를 제거 . 그러나, 주변 조직 및 후속 처리에서 망막 조직의 격리 도전하고 있습니다. 여기, 우리는 결과적으로, 단일 세포의 해상도 칼슘 활동 및 유전자 표현 분석됩니다 기본 셀 문화를 준비하는 데 사용됩니다 Xenopus laevis의 망막 세포의 분해 및 분리하기위한 방법을 제시한다. 본 논문에서 제시 한 주제 자발적인 칼슘 과도의 분석이지만, 기술은 연구 질문 및 접근 방법 (그림 1)의 다양한 배열 광범위하게 적용됩니다.

성공적으로 해부하는 광 소포 (단계 25)와 retinae (무대 35)의 예는 2E와 2J 그림에 표시됩니다. 이 프로토콜이 개발의 여러 단계에서 사용할 수 있지만, 더 실험에 대한 정확성을 보장하기 위해 만 망막 조직을 얻는 것이 중요합니다. 조심스럽게 모든 단계에서 표피를 제거하고 포셉의 망막 조직을 주사하지 않도록. 단계 35 세 이상에서, 렌즈는 망막 위에 맑은 층으로 간주 할 수 있으며, 포셉을 사용하여주의 해주세요하여 제거 할 수 있습니다. 성공적으로 도금 기본 세포 배양은도 3a에 표시됩니다. 조직을 dissociating 때, 세정 솔루션에 dissociating에서 조직을 방지하기 위해 권장되는 30 초 배양 시간보다 더 오래 씻어 솔루션에 망막 explant을 떠나지 않는 것이 중요합니다. 또한, 조직 전체 시간 동안 트립신 용액에 해리 할 수​​ 있는지 확인문화 판에서 세포의도 배포 할 수 있도...

Xenopus laevis는 세포의 운명 사양 및 기본 세포 배양의 개별 망막 세포의 생리 기능을 연구하기위한 이상적인 모델 시스템을 제공합니다. 여기 망막 조직을 해부하고 칼슘 활동 이미징 및 현장 하이브리드 화에 의해 분석 기본 셀 문화를 생성하는 기법을 제시한다.

의 해부, 문화, 및 분석<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; 배아 망막 조직

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

본 실험의 전반적인 목적은 Xenopus 망막 세포의 일차 세포 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 먼저 주변 조직을 제거하여 망막을 노출시킨 후, 두 번째 단계로 망막 조직을 절제함으로써 수행됩니다.다음으로, 망막 조직을 단일 세포로 분리합니다. 마지막 단계는 UnCloned 디시에 망막 세포를 플레이팅하고 calcium imaging을 위해 flu oh 4:00 AM을 첨가하는 것입니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 망막 세포 배양의 칼슘 활성을 검출합니다.이 방법은 망막 발달에서 칼슘과 전기적 활동의 역할뿐만 아니라 단일 세포 수준의 유전자 발현과 같이 발생 생물학, 신경 생물학 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 실험 절차가 처음인 사람은 적시에 정확한 박리를 수행하기 위해 미세한 운동 능력이 필요하므로 어려움을 겪을 것입니다. 정교한 손-눈 협응 능력이 필수적이어서 박리 단계가 까다롭기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.후드 내에서 이 절차를 시작하려면, 해부 플레이트로 사용할 10 mL의 세포 배양 배지가 담긴 60 mm 플라스틱 페트리 접시 하나를 준비하여 라벨을 붙입니다. 선택 사항으로, 25단계 이하 배아의 해부를 위해 조직층 분리를 돕고자 최종 농도가 1.0 mg/mL가 되도록 10 mg의 collagenase B를 해부 플레이트에 추가할 수 있습니다.또한, 배양 플레이트로 사용할 2 mL의 세포 배양 배지가 담긴 35 mm 론 표면 디쉬(lon surface dish) 1개를 준비하십시오. 조직 해리 튜브로 사용할 빈 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브 1개와 15 mL가 담긴 15 mL 원추형 팰콘 튜브 1개를 준비하십시오.세포 배양 배지입니다. 그 다음, 해부를 위해 2mL의 CMF가 담긴 35mm 플라스틱 페트리 접시 2개를 준비하며, 하나는 조직편 해리 플레이트로, 다른 하나는 후드 외부에서 조직편 세척 플레이트로 사용합니다. 10mL가 담긴 60mm 플라스틱 페트리 접시 2개를 준비하십시오.0.1 XMMR을 준비하며, 하나는 유지 플레이트로, 다른 하나는 형제 플레이트로 사용하고, 추가로 10 mL의 0.1 XMMR과 0.5 mg/mL MS 2 22가 포함된 60 mm 플라스틱 페트리 접시를 준비합니다. 그 후, 해리 플레이트의 설명 부분에 40 µL의 5% CMF 내 trypsin을 첨가합니다.소용돌이

dissection-culture-analysis-xenopus-laevis-embryonic-retinal

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

Xenopus 배아 상피 조직은 상피 morphogenesis 동안 극성 개발 및 형태의 변화와 같은 세포 행위를 연구하는 이상적인 모델 시스템입니다. 고정 샘플 전통 조직학 점점 라이브 셀 이미징 공촛점에 의해 보완되고있다. 여기 개구리 조직을 분리 및 라이브 세포 공촛점 현미경을 사용하여 라이브 상피 세포 및 cytoskeleton을 시각화하는 방법을 보여줍니다.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

이 문서는 망막 안료 상피 하나에서 세 일 postfertilization의 배아에게 부착과 않고 zebrafish의 망막 microdissect하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

이 비디오는 번데기에서 눈-뇌 복합체를 해부하고 분리하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 예를 들어 면역 염색 및 다른 유전자 발현 실험과 호환되는 고품질 조직을 생성하는 절차를 보여줍니다.

파리 번데기에서 눈-뇌 복합체의 해부: 망막 조직을 분리하는 방법

이 프로토콜은는 Xenopus laevis의의 neurulas에서 premigratory 두개골 신경 능선 (NC)를 해부하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 외식은 피브로넥틴 및 체외 배양에 도금, 또는 다시 호스트 배아에 이식 할 수 있습니다. 이 기술은 NC 상피 - 투 - 중간 엽 이행, 이주 및 분화의 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.

의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

이 연구는 절제 처리 중 망막 무결성을 손상시키는 것을 방지하는 새로운 인간 organotypic 망막 문화 (HORC) 모형을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이것은 과대 유리체와 근본적인 망막 안료 상피 코로이드 (RPE-choroid) 및 clera로 망막을 배양해서 달성됩니다.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

이 프로토콜은 성인 마우스로부터 수득한 망막 외식편의 분리, 해부, 배양 및 염색을 위한 단계를 제시하고 설명한다. 이 방법은 당뇨병 성 망막증과 같은 다양한 망막 신경 혈관 질환을 연구하기위한 생체 외 모델로서 유익합니다.

망막 신경혈관 질환 연구를 위한 생체 외 모델로서의 성인 마우스 망막의 망막 외 이식편

망막은 층류 구조 전반에 걸쳐 복잡한 공간 조직을 나타냅니다. 현대의 공간 전사체학 및 염기서열분석 기술에는 20μm 두께&lt; 조직 절편이 필요하기 때문에 망막 연구 적용이 제한됩니다. 이 신선 냉동 냉동 절편 방법은 평면 공간 관계를 유지하면서 마우스 망막의 얇은 표면 부분을 생성하여 층판 전반에 걸쳐 포괄적인 분자 매핑을 가능하게 합니다.

En 얼굴 High-dimensional Spatial Molecular Analysis (고차원 공간 분자 분석을 위한 마우스 망막의 동결 절편)

학습하세요 Xenopus laevis 배아 망막 조직의 해부, 단일 세포 분리 및 배양 방법을 통해 칼슘 활성을 공초점 현미경으로 분석하는 기술입니다. 이 방법은 망막 세포 생리학 연구에 활용됩니다.

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