Name: 오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 학습하세요 닭 배아 신경관에서 miRNA 기반 플라스미드를 이용한 in ovo 전기천공으로 유전자 발현을 세포 특이적으로 저해하고 축삭 유도 결함을 평가하는 방법을. 형광 염료 주입과 현미경 분석으로 신경 발달 메커니즘을 규명합니다.

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ES의 연구실에서 작업은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원됩니다. 우리는 촬영과 도움 박사 비트 Kunz 감사드립니다.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
<li>Avraham, O., Hadas, Y., Vald, L., Zisman, S., Schejter, A., Visel, A., Klar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Development. 4, 21(2009).</li>
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<li>Das, R. M., van Hateren, N. J., Howell, G. R., Farrell, E. R., Bangs, F. K., Porteous, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental Biology. 294, 554-563 (2006).</li>
<li>Perrin, F. E., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lipophilic+dyes+in+studies+of+axonal+pathfinding+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Use of lipophilic dyes in studies of axonal pathfinding in vivo.</a> Microscopy Research and Technique. 48, 25-31 (2000).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29, 123-132 (2001).</li>
<li>Kieleczawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+modifications+of+the+standard+DNA+sequencing+protocol+allow+for+sequencing+through+siRNA+hairpins+and+other+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Techniques%22%5BJournal%5D)">Simple modifications of the standard DNA sequencing protocol allow for sequencing through siRNA hairpins and other repeats.</a> Journal of Biomolecular Techniques. 16, 220-223 (2005).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 간단한, 벡터 기반의 인공 miRNA 표현 전략은 닭 신경 튜브에 최저 내생 유전자 발현에 사용할 수 있습니다. 이 기능 도구는 복잡한 발달 경로의 해설을 촉진하기 위해 여러 유전자 입을, 시간적 제어 및 세포 유형 특이성을 제공합니다. plasmids은 commissural 뉴런에 또는 중간 타겟, floorplate 3 최저 별개의 유전자하는 데 사용할 수 있기 때문에 특히, 우리는 commissural 축삭지도에서 이러한 plasmids의 유틸리티를 증명하고있다. miRNA - 표현의 plasmids (및 따라서, 침묵 세포)에서 생성 된 형광 단백질 표현의 강도와 위치는 다음 매개 변수에 따라 달라집니다 : <ol><li> 증폭기는 사용 : <ol class="lalpha"><li> β-고를업자는 ubiquitously 활성화 </li><li> Math1 증강은 dI1 뉴런 12 활성 </li><li&gt;을 Hoxa1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 0.5 mm 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> 유리 바늘 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard 실리콘 엘라스토머 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> 텅스텐 와이어, 0.075 mm </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> 곤충 핀, 0.20 mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> 곤충 핀, 0.10 mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> 봄 가위 </td><td> 로 정밀 과학OLS </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 55 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> 빠른 DiI </td><td> 분자 프로브 </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

오픈 책 준비에 dii 주입하여 개발 신경 튜브와 phenotypes의 평가에 mirna 기반 plasmids의 비켜 electroporation에

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 뉴런은 광범위하게 개발 1,2 동안 축삭 안내를 근간 메커니즘을 명료하게하다하는 연구되었습니다. 이 뉴런은 등쪽 척추에 위치하고 있으며, 틀에 박힌 궤도를 따라 자신의 axons을 보내 수 있습니다. Commissural axons는 처음으로 다음 floorplate에서 ventrally 프로젝트. 중간 선을 넘어 한 후에는 다음과 axons은 길이 방향으로 뇌에 대한 날카로운 뱃 부리 장식이있는 회전과 프로젝트를합니다. 다음 단계에 각각 매력적이고 혐오스러운지도 단서의 조율 된 활동에 의해 조절된다. 이러한 신호의 올바른 해석은 demarcated 경로를 따라 axons의지도에 매우 중요합니다. 따라서, commissural 축삭 안내에 특정 분자의 생리 기여 이상적인 생활 배아의 맥락에서 조사하고 있습니다. 따라서, 생체 내 유전자 최저는 정확하게 신중하게 여러 재생할 수 있습니다 유전자의 축삭 유도 활동을 구분하기 위해 통제되어야합니다개발하는 동안 역할. 여기, 우리는 셀 타입 별, 추적 방식으로 닭 신경 튜브의 분해 유전자 발현하는 방법을 설명합니다. 우리는 3 셀 타입 별 발기인 / 형광 단백질 마커의 표현을 유도 강화를 품고 miR30-RNAi의 성적표 4 (cDNA 인코딩 형광 단백질의 3&#39;-UTR 내에있는 ()에 의해 직접 다음 소설 플라스미드 벡터를 사용하여 그림 1). 개발 신경 튜브에 electroporated 때,이 벡터는 유전자 발현의 효율적인 downregulation을 유도하고 최저 3 체험 세포의 추적 직접 사용 밝은 형광 마커 단백질을 표현한다. electroporation하기 전에 다른 RNAi 벡터를 혼합하면 척추의 독립적 인 지역에서 두 개 이상의 유전자의 동시 분해 할 수 있습니다. 이 빠른 방식, S에서 개발되는 동안 검사되는 복잡한 세포와​​ 분자 상호 작용을 허용, imple 정확하고 저렴. 오픈 도서 준비 5 commissural 축삭의 탄도의 DiI 추적과 함께,이 방법은 commissural 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 생체 연구를위한 유용한 도구입니다. 원칙적으로 모든 발기인 / 인핸서는 잠재적으로 개발 6시 유전자 기능의 생체 연구에 대한 기술이 널리 적용하고, 사용할 수 있습니다. 이 동영상을 먼저 처리하는 방법을 보여줍니다 및 창 계란, 신경 튜브에 DNA의 plasmids의 주입과 electroporation 절차. commissural 축삭 안내를 조사하려면, 척추은 오픈 북 준비로 배아에서 제거 고정하고, 축삭 경로를 추적 할 수 있도록 DiI으로 주입된다. 척추 코드는 coverslips 사이에 장착 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화합니다.

신경 튜브의 유전자 발현은 세포 유형의 특정, 추적 방식으로 downregulated 할 수있는이 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 방법을 보여줍니다<em&gt; 비켜에서</emspatiotemporally 제어 RNA 간섭을 이끌어내는 microRNA 기반 plasmids의&gt; electroporation은 개발 신경 튜브에 commissural 축삭 안내를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

교차성 dI1 뉴런은 발달 과정 중 축삭 유도(axon guidance)의 기저 메커니즘을 규명하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다1,2. 이 뉴런들은 ...

본 절차의 목적은 세포 유형 특이적인 추적 가능 방식으로 유전자 발현을 억제한 후, 닭의 신경관에서 축삭 유도 결함을 평가하는 것입니다. 이는 달걀 껍질에 창을 내어 신생아 내 전기천공법(innovo electroporation)을 위해 수정란을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 microRNA를 인코딩하는 DNA 구조물을 신경관에 주입하고 전기천공을 실시하는 것입니다.다음으로, 전기 자극을 받은 척수를 절개하여 평면 마운트 오픈 북(flat mount open book) 형태로 고정합니다. 마지막 단계는 축삭 투사(axonal projections)를 시각화하기 위해 형광 염료를 주입하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 유전자 침묵(gene silencing)이 일어난 세포를 확인하고, 이것이 교차 축삭 유도(commiss axon guidance)에 미치는 후속 영향을 평가합니다.이 기술이 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 세포 유형 특이적인 유전자 억제가 가능하다는 것입니다. 플라스미드 제작 방법은 작성된 프로토콜의 지침을 확인하십시오. 알을 38.5 °C, 습도 약 45%에서 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배양하십시오. 교차 신경세포(commissural neurons)의 축삭 유도(Axon guidance)를 연구하려면 배아를 약 3일 동안 배양하여 hamburger and Hamilton Stage 17~18 단계에 도달하게 하십시오.원하는 발달 단계에 도달하고 표적 단백질이 배아 내에 축적되기 전에, 알을 인큐베이터에서 꺼내어 20분 동안 안정적인 수평 상태로 둡니다. 이는 배아가 알의 위쪽 노른이 상단으로 다시 위치하도록 하기 위함입니다. 배아가 노른이 위로 재배치되면, 알을 인큐베이터에서 꺼내 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 알의 장축을 따라 테이프 조각을 붙이고, 메스를 사용하여 알의 뭉툭한 끝부분과 윈도잉(windowing)할 영역의 모서리에 작은 구멍을 각각 뚫습니다.그다음 18게이지 바늘이 장착된 주사기를 알의 둔단에 있는 구멍에 45도 각도로 삽입하고, 노른자가 손상되지 않도록 주의하며 알부민 약 3mL를 흡입합니다. 가위의 날을 수평으로 유지하여 배아에 손상을 주지 않도록 알에 창을 냅니다. 그 후 테이프를 사용하여 창을 밀봉합니다.마지막으로, 브러시를 사용하여 녹인 파라핀 왁스를 발라 알의 뭉툭한 끝부분에 있는 구멍을 밀봉하고, 알에 생긴 다른 균열

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신경과학

이 동영상은 이용 배아 여자 척수에서 뉴런의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 시각화하는 방법을...

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

우리는 Ciona intestinalis의, 미세 주입하고 전기 기술을 사용하여 척추 동물에 척색 자매 그룹에 과도 형질 전환 유전자 최저를 제시한다. 이러한 방법은 척색 머리 감각 상피, 인간의 질병 관련 유전자의 많은 orthologs을 포함한 척추 동물의 기본적인 특성, 기능이 단순한 무척추 동물에서 기능 유전체학을 용이하게한다.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

학습하세요 닭 배아 신경관에서 miRNA 기반 플라스미드를 이용한 in ovo 전기천공으로 유전자 발현을 세포 특이적으로 저해하고 축삭 유도 결함을 평가하는 방법을. 형광 염료 주입과 현미경 분석으로 신경 발달 메커니즘을 규명합니다.

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