Name: 오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: 학습하세요 닭 배아 신경관에서 miRNA 기반 플라스미드를 이용한 in ovo 전기천공으로 유전자 발현을 세포 특이적으로 저해하고 축삭 유도 결함을 평가하는 방법을. 형광 염료 주입과 현미경 분석으로 신경 발달 메커니즘을 규명합니다.

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ES의 연구실에서 작업은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 지원됩니다. 우리는 촬영과 도움 박사 비트 Kunz 감사드립니다.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 간단한, 벡터 기반의 인공 miRNA 표현 전략은 닭 신경 튜브에 최저 내생 유전자 발현에 사용할 수 있습니다. 이 기능 도구는 복잡한 발달 경로의 해설을 촉진하기 위해 여러 유전자 입을, 시간적 제어 및 세포 유형 특이성을 제공합니다. plasmids은 commissural 뉴런에 또는 중간 타겟, floorplate 3 최저 별개의 유전자하는 데 사용할 수 있기 때문에 특히, 우리는 commissural 축삭지도에서 이러한 plasmids의 유틸리티를 증명하고있다. miRNA - 표현의 plasmids (및 따라서, 침묵 세포)에서 생성 된 형광 단백질 표현의 강도와 위치는 다음 매개 변수에 따라 달라집니다 : <ol><li> 증폭기는 사용 : <ol class="lalpha"><li> β-고를업자는 ubiquitously 활성화 </li><li> Math1 증강은 dI1 뉴런 12 활성 </li><li&gt;을 Hoxa1...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 0.5 mm 유리 모세관 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> 유리 바늘 풀러 </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard 실리콘 엘라스토머 </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> 텅스텐 와이어, 0.075 mm </td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> 곤충 핀, 0.20 mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> 곤충 핀, 0.10 mm </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> 봄 가위 </td><td> 로 정밀 과학OLS </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 5 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> 뒤몽 # 55 포셉 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> 빠른 DiI </td><td> 분자 프로브 </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> 형광 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

오픈 책 준비에 dii 주입하여 개발 신경 튜브와 phenotypes의 평가에 mirna 기반 plasmids의 비켜 electroporation에

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 뉴런은 광범위하게 개발 1,2 동안 축삭 안내를 근간 메커니즘을 명료하게하다하는 연구되었습니다. 이 뉴런은 등쪽 척추에 위치하고 있으며, 틀에 박힌 궤도를 따라 자신의 axons을 보내 수 있습니다. Commissural axons는 처음으로 다음 floorplate에서 ventrally 프로젝트. 중간 선을 넘어 한 후에는 다음과 axons은 길이 방향으로 뇌에 대한 날카로운 뱃 부리 장식이있는 회전과 프로젝트를합니다. 다음 단계에 각각 매력적이고 혐오스러운지도 단서의 조율 된 활동에 의해 조절된다. 이러한 신호의 올바른 해석은 demarcated 경로를 따라 axons의지도에 매우 중요합니다. 따라서, commissural 축삭 안내에 특정 분자의 생리 기여 이상적인 생활 배아의 맥락에서 조사하고 있습니다. 따라서, 생체 내 유전자 최저는 정확하게 신중하게 여러 재생할 수 있습니다 유전자의 축삭 유도 활동을 구분하기 위해 통제되어야합니다개발하는 동안 역할. 여기, 우리는 셀 타입 별, 추적 방식으로 닭 신경 튜브의 분해 유전자 발현하는 방법을 설명합니다. 우리는 3 셀 타입 별 발기인 / 형광 단백질 마커의 표현을 유도 강화를 품고 miR30-RNAi의 성적표 4 (cDNA 인코딩 형광 단백질의 3&#39;-UTR 내에있는 ()에 의해 직접 다음 소설 플라스미드 벡터를 사용하여 그림 1). 개발 신경 튜브에 electroporated 때,이 벡터는 유전자 발현의 효율적인 downregulation을 유도하고 최저 3 체험 세포의 추적 직접 사용 밝은 형광 마커 단백질을 표현한다. electroporation하기 전에 다른 RNAi 벡터를 혼합하면 척추의 독립적 인 지역에서 두 개 이상의 유전자의 동시 분해 할 수 있습니다. 이 빠른 방식, S에서 개발되는 동안 검사되는 복잡한 세포와​​ 분자 상호 작용을 허용, imple 정확하고 저렴. 오픈 도서 준비 5 commissural 축삭의 탄도의 DiI 추적과 함께,이 방법은 commissural 축삭의 성장과지도의 세포와 분자 메커니즘의 생체 연구를위한 유용한 도구입니다. 원칙적으로 모든 발기인 / 인핸서는 잠재적으로 개발 6시 유전자 기능의 생체 연구에 대한 기술이 널리 적용하고, 사용할 수 있습니다. 이 동영상을 먼저 처리하는 방법을 보여줍니다 및 창 계란, 신경 튜브에 DNA의 plasmids의 주입과 electroporation 절차. commissural 축삭 안내를 조사하려면, 척추은 오픈 북 준비로 배아에서 제거 고정하고, 축삭 경로를 추적 할 수 있도록 DiI으로 주입된다. 척추 코드는 coverslips 사이에 장착 공 촛점 현미경을 사용하여 시각화합니다.

신경 튜브의 유전자 발현은 세포 유형의 특정, 추적 방식으로 downregulated 할 수있는이 방법이 설명되어 있습니다. 우리는 방법을 보여줍니다<em&gt; 비켜에서</emspatiotemporally 제어 RNA 간섭을 이끌어내는 microRNA 기반 plasmids의&gt; electroporation은 개발 신경 튜브에 commissural 축삭 안내를 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

교차성 dI1 뉴런은 발달 과정 중 축삭 유도(axon guidance)의 기저 메커니즘을 규명하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다1,2. 이 뉴런들은 ...

본 절차의 목적은 세포 유형 특이적인 추적 가능 방식으로 유전자 발현을 억제한 후, 닭의 신경관에서 축삭 유도 결함을 평가하는 것입니다. 이는 달걀 껍질에 창을 내어 신생아 내 전기천공법(innovo electroporation)을 위해 수정란을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 microRNA를 인코딩하는 DNA 구조물을 신경관에 주입하고 전기천공을 실시하는 것입니다.다음으로, 전기 자극을 받은 척수를 절개하여 평면 마운트 오픈 북(flat mount open book) 형태로 고정합니다. 마지막 단계는 축삭 투사(axonal projections)를 시각화하기 위해 형광 염료를 주입하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경을 사용하여 유전자 침묵(gene silencing)이 일어난 세포를 확인하고, 이것이 교차 축삭 유도(commiss axon guidance)에 미치는 후속 영향을 평가합니다.이 기술이 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 세포 유형 특이적인 유전자 억제가 가능하다는 것입니다. 플라스미드 제작 방법은 작성된 프로토콜의 지침을 확인하십시오. 알을 38.5 °C, 습도 약 45%에서 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배양하십시오. 교차 신경세포(commissural neurons)의 축삭 유도(Axon guidance)를 연구하려면 배아를 약 3일 동안 배양하여 hamburger and Hamilton Stage 17~18 단계에 도달하게 하십시오.원하는 발달 단계에 도달하고 표적 단백질이 배아 내에 축적되기 전에, 알을 인큐베이터에서 꺼내어 20분 동안 안정적인 수평 상태로 둡니다. 이는 배아가 알의 위쪽 노른이 상단으로 다시 위치하도록 하기 위함입니다. 배아가 노른이 위로 재배치되면, 알을 인큐베이터에서 꺼내 70% ethanol로 닦아냅니다. 그다음 알의 장축을 따라 테이프 조각을 붙이고, 메스를 사용하여 알의 뭉툭한 끝부분과 윈도잉(windowing)할 영역의 모서리에 작은 구멍을 각각 뚫습니다.그다음 18게이지 바늘이 장착된 주사기를 알의 둔단에 있는 구멍에 45도 각도로 삽입하고, 노른자가 손상되지 않도록 주의하며 알부민 약 3mL를 흡입합니다. 가위의 날을 수평으로 유지하여 배아에 손상을 주지 않도록 알에 창을 냅니다. 그 후 테이프를 사용하여 창을 밀봉합니다.마지막으로, 브러시를 사용하여 녹인 파라핀 왁스를 발라 알의 뭉툭한 끝부분에 있는 구멍을 밀봉하고, 알에 생긴 다른 균열들도 동일한 방식으로 밀봉합니다. 그런 다음 알을 인큐베이터로 되돌립니다. 전기천공을 수행할 모든 알에 대해 이 과정을 반복합니다.창이 만들어진 알 중 하나에서 테이프를 제거하고, hamburger and Hamilton 기준에 따라 배아의 단계를 확인합니다. 그 다음 핀셋을 사용하여 좌우 주요 난황정맥이 위치한 배아의 등쪽 절반 부위에서 배외막을 들어 올립니다. 몸통 부위에 조심스럽게 스프링 가위로 막을 찢거나 자른 후, 꼬리 방향으로 젖힙니다.이제 완만한 흡입을 이용해 전기천공법으로 도입할 DNA 혼합물을 튜빙이 연결된 유리 미세 모세관에 로딩합니다. 미세 모세관을 뒷다리 바로 위쪽의 신경관 중앙관에 삽입하고, 입으로 주입량을 조절하며 DNA 용액을 주입합니다. 청색 염료가 꼬리 끝에서부터 발달 중인 뇌의 뇌실까지 퍼져나가야 합니다.배아 위에 멸균된 PBS를 몇 방울 가하고, 배아나 혈관에 닿지 않도록 전극을 배아의 전후축과 평행하게 배치합니다. 그런 다음 전극을 고정하고 전기천공을 수행합니다. 전기천공 후에는 전극을 제거하고 멸균수로 빠르게 헹구어 난백의 변성 단백질을 제거합니다.마지막으로, 배아 위에 멸균 PBS를 조금 더 떨어뜨린 후 테이프로 알을 다시 밀봉합니다. 이전과 마찬가지로, 배아의 탈수를 방지하기 위해서는 적절한 밀봉이 매우 중요합니다. 그 다음, 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 배아를 인큐베이터에 넣고 배양합니다.배아가 Hamburger Hamilton 단계 25~26에 도달하면, 포셉을 사용하여 배아를 알에서 꺼내 sil guard 엘라스토머가 코팅된 페트리 접시에 놓습니다. 포셉을 사용하여 배외막을 제거하고 배아의 등쪽이 아래로 향하도록 놓습니다. 이제 0.2 mm 곤충 핀을 사용하여 목과 꼬리 부분을 통해 배아를 조심스럽게 펴서 고정합니다.그 다음 배아의 사지를 핀으로 고정하되, 이후의 해부 과정에 방해가 되지 않도록 핀을 비스듬히 꽂습니다. 조직의 밀도를 인식할 수 있도록 배아가 담긴 접시 아래쪽에서 조명을 비춥니다. 스프링 가위를 사용하여 복강을 열고, 핀셋으로 조심스럽게 긁어내어 심장과 내부 기관을 제거합니다.모든 장기가 완전히 제거되면, 분절된 척추와 척수가 보일 것입니다. 다음으로, 배아를 180도 회전시킨 후 스프링 가위를 사용하여 목 부분의 척수를 덮고 있는 척추를 얕게 절개합니다. 그런 다음 목에서 꼬리까지 척수의 양측 척추를 따라 짧게 두 번 종절개합니다.포셉을 사용하여 척추뼈를 척수에서 들어 올린 다음, 꼬리 방향으로 척추뼈를 하나의 띠 형태로 벗겨냅니다. 그 다음 배아의 꼬리와 사지를 통해 조심스럽게 늘려 다시 고정합니다. 이제 신경관과 등쪽 뿌리 신경절(dorsal root ganglia) 사이에 어둡고 조밀한 조직선으로 나타나는 척수 수막을 확인하고, 스테르 니들(ster needle)이나 미세 외과용 메스를 사용하여 목부터 꼬리까지 척수의 양측을 따라 수막을 세로로 절개합니다.고정된 배아의 신장으로 인해 뇌수막이 척수에서 쉽게 분리되어야 합니다. 마지막으로, 날개싹 높이와 사지싹의 미측(caudal) 지점에서 척수를 절단합니다. 그 다음 핀셋을 사용하여 척수가 계속 PBS에 잠겨 있도록 유지하면서, 척수를 두측에서 미측 방향으로 들어 올립니다.분리된 척수를 스패출러 위에 펼쳐 PBS에 희석한 4% 파라포름알데히드가 들어 있는 새로운 syl guard 코팅 접시에 옮깁니다. 그 다음 0.1 mm 곤충 핀을 사용하여 척수를 내측과 사분면 방향으로 조심스럽게 고정하여 평면 표본(flat mount preparation)을 만들고, 파라포름알데히드에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 이때 과고정되지 않도록 주의하십시오.이렇게 하면 배경 신호가 증가하고 다이오드 확산 효율이 감소하게 됩니다. 그런 다음 파랄데하이드를 조심스럽게 따라내고 PBS로 교체하십시오. 에탄올에 5 mg/mL 농도로 fast di를 준비한 후, 플라스틱 튜브가 연결된 소구경 유리 마이크로 피펫의 팁을 부러뜨려 피펫 내부로 용액을 빨아들입니다.충전된 바늘을 PBS가 담긴 접시에 넣고 염료가 바늘에서 새어 나오지 않는지 확인하십시오. 만약 염료가 샌다면 직경이 너무 넓은 것이므로 새로운 바늘을 준비해야 합니다. open book 표본의 하단에서 조명이 공급되는지 확인하고, Hemi book 외측 가장자리에서 너비의 약 5분의 1 지점에 위치한 더 조밀한 조직의 세로 줄무늬를 찾으십시오. 교차 신경세포(commissural neurons)의 세포체는 이 어두운 선의 바로 등쪽에 위치합니다.유리 마이크로 피펫의 팁을 조직에 삽입하고, 바늘을 빼면서 마우스 피펫을 사용하여 소량의 D eye를 빠르게 분사합니다. 이 과정을 오픈 북(open book)의 길이를 따라 0.5 밀리미터 간격으로 반복하십시오. 주입이 완료되면 트랜스퍼 피펫을 사용하여 과잉분인 di를 흡입하여 제거합니다. 이를 수행하지 않으면 배경 신호가 높게 나타납니다.모든 open book 표본에 대해 동일한 절차를 반복합니다. 그런 다음, 염색약이 축삭을 따라 퍼질 수 있도록 주입된 표본이 담긴 디쉬를 4°C에서 약 3일 동안 보관합니다. 이 시간이 지난 후, 서면 프로토콜의 지침에 따라 표본을 마운트합니다.Hamburger Hamilton Stage 18 단계의 닭 배아에 전기천공을 실시한 후, Hamburger Hamilton Stage 25에서 26 단계의 닭 배아로부터 횡단면과 개방형 표본을 제작하였습니다. 여기 횡단면에서 보는 바와 같이, beta-actin 프로모터는 보편적 발현을 유도합니다. 화살표는 배측-복측 방향을 나타냅니다.이 이미지는 플라스미드 벡터의 전기천공법 시행 후 얻어진 형광 단백질 발현 패턴의 예를 보여줍니다. 여기서는 오픈 북(open book) 표본에서 베타 액틴 프로모터에 의한 보편적 발현이 관찰됩니다. 화살표는 吻측 척수 방향을 나타냅니다.이 이미지는 math one 인핸서를 포함하는 컨스트럭트로 전기천공법을 시행한 후의 단면을 보여줍니다. 이는 di one 뉴런에서의 발현을 유도합니다. 여기서는 open book 표본 제작법을 통해 math one 인핸서 컨스트럭트에 의한 발현이 관찰됩니다.이 횡단면은 양측 전압천공법으로 컨스트럭트를 주입한 후, hawk A one 인핸서로부터의 발현을 보여줍니다. hawk A one 인핸서는 바닥판(floor plate)에서 특이적으로 발현을 유도합니다. 이 오픈 북(open book) 표본 제작법은 바닥판 내 hawk a one 컨스트럭트의 발현 패턴을 보여줍니다.이 이미지는 Dai 주입 부위의 명시야(bright field) 이미지입니다. 오픈 북(open book) 표본 제작 시, Dai를 오픈 북의 외측 가장자리 근처에 점상 패턴으로 주입하였습니다. 전기영동 처리된 쪽의 이미지는 동일한 표본에서의 GFP 발현 시각화를 보여주며, 여기서 Dai가 시각화되었습니다.3일간의 확산 후, 궤적 상의 교차 신경 섬유의 이완을 형광 현미경으로 관찰할 수 있어야 합니다. 정상적인 축삭 궤적은 바닥판(floor plate)을 향해 성장하고, 바닥판을 가로지른 후, 방향을 틀어 성장하게 됩니다. 여기에서 보는 것과 같이 정렬됩니다.여기에 제시된 것과 같이 유전자 knockdown으로 인해 발생하는 비정상적인 표현형은 전형적인 궤적과 비교할 수 있습니다. 예시에서 일부 축삭은 바닥판(floor plate)에서 정지하거나 반대측에서 잘못된 회전 결정을 내립니다. 이 절차를 수행할 때는 미세 주입 및 해부 단계 전반에 걸쳐 주의를 기울이고 인내심을 갖는 것이 중요합니다.이 과정은 어느 정도의 연습이 필요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 신경관 발달 과정 중 특정 세포 유형에서 유전자 기능을 조사하기 위해 RNAI 플라스미드를 주입하고 투여하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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신경과학

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활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

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Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장<em&gt; 자궁에</em&gt; Electroporation 또는 바이러스 성 Stereotaxic 주입

이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

우리는 Ciona intestinalis의, 미세 주입하고 전기 기술을 사용하여 척추 동물에 척색 자매 그룹에 과도 형질 전환 유전자 최저를 제시한다. 이러한 방법은 척색 머리 감각 상피, 인간의 질병 관련 유전자의 많은 orthologs을 포함한 척추 동물의 기본적인 특성, 기능이 단순한 무척추 동물에서 기능 유전체학을 용이하게한다.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

이 프로토콜에서는 E7.5의 마우스 양수에 렌티 바이러스를 주입하여 생존 또는 배아 발달에 미치는 해로운 영향을 최소화하면서 전체 신경판을 균일하게 형질 도입하는 방법을 설명합니다.

배아 일 7.5에서 자궁 내 나노 주사 (NEPTUNE)에 의한 뮤린 신경 판 표적화

학습하세요 닭 배아 신경관에서 miRNA 기반 플라스미드를 이용한 in ovo 전기천공으로 유전자 발현을 세포 특이적으로 저해하고 축삭 유도 결함을 평가하는 방법을. 형광 염료 주입과 현미경 분석으로 신경 발달 메커니즘을 규명합니다.

오픈 책 준비에 DiI 주입하여 개발 신경 튜브와 Phenotypes의 평가에 miRNA 기반 Plasmids의 비켜 Electroporation에

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