Name: 1 F O ATPase의 소포의 준비와 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌에서 F1FO ATPase가 풍부한 소포를 분리하여 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을. 이 기법은 미토콘드리아 ATP 합성 효소 활성과 기능을 상세히 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 뇌 미토콘드리아 절연 (브라운 MR 등에서 적응. 9) <ol><li> 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 방법을 사용하여 쥐를 희생. </li><li> 잘린 동물의 머리를 잘라 피부를 잘라 두개골을 노출합니다. </li><li> 가위 또는 rongeur로 절단하여 부드럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거합니다. </li><li> 절연 버퍼에있는 소뇌 (표 1 참조)없이 정밀하게 뇌를 말하다 5 ML 유리 / 테프론 균질화 (장비 목록 참조)로 전송할 수 있습니다. </li><li> 조직 가볍게 10 회 (거품 없음), 약 5 분 균질화. </li><li> 4 10 분 ° C 벤치 탑 원심 분리기에서 1,500 × g에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 저장 (미토콘드리아와 synaptosomes)와 펠렛을 (핵 물질 및 세포 파편) 폐기합니다. 벤치 탑 원심 분리기 ° C 4에서 10 분간 16,000 × g에서 원심 분리기. </li><li> 폐기상층 액을 다시 중단 절연 버퍼 500 μL에 펠렛을. 세포 분열 용기 (장비 목록을 참조) synaptosomes을 방해. 빠른 압축 해제 한 다음 10 분, 1,200 PSI의 압력을 적용합니다. </li><li> 126,500에서 레이어 Ficoll 그라디언트 위에 혼합물 (표 2 참조), SW-50.1 로터와 원심 분리기에서 개최 × g에서 4시 20 분 ° 원심 분리기에서 C (장비 목록을 참조). 펠렛 정제 미토콘드리아이며, Ficoll의 서로 다른 밀도 사이의 계층 undisrupted synaptosomes입니다. </li><li> 16,000 절연 버퍼에서 원심 분리 × g을 4시 10 분 ° C에 대한 벤치 탑 원심 분리기에 의해 펠렛을 씻으십시오. </li></ol> 2. Submitochondrial 소포는 (SMV) 절연 (장 등. 10에서 발췌) <ol><li> 1 % digitonin의 동일한 볼륨과 함께 200 μL 절연 버퍼에 미토콘드리아 다시 중단하고 15 분 동안 얼음에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 더 격리 버프 추가16,000 어 원심 분리 × 4시 10 분 g ° 벤치 탑 원심 분리기 C. 두 번이 작업을 수행합니다. </li><li> 200 μL 절연 버퍼에 펠렛을 다시 일시 중지하고 10 % Lubrol PX (C12E9) 2 μl를 추가합니다. 혼합하고 15 분 동안 얼음에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 182,000에 절연 버퍼, SW-50.1 회에서 장소와 원심 분리기 위에 레이어 혼합 × 4에서 g ℃에서 1 시간 동안 C. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 16,000에서 절연 버퍼의 탁상용 원심 분리기 × g에서 원심 분리하여 최종 펠렛을 씻으십시오 </li></ol> 3. 전기 생리학 기록 <ol><li> 전형적인 전기 생리학 장비는 증폭기, pClamp10.0 소프트웨어, 매니퓰레이터, 현미경, 진동 절연 테이블, 패러데이 케이지와 함께 Digidata 1440A 아날로그 - 디지털 컨버터 인터페이스가 장착 된 PC 시스템을 포함하고 있습니다. </li><li> 붕규산 유리 모세관 튜브는 불타는 / 브라운 micropipette의 풀러 모델 P-87에 삽입됩니다. 피펫 풀러 프로그램에 최적화되어 있습니다MΩ 80-100 사이의 저항과 피펫을 생성합니다. </li><li> 연 소식 기화기는 생리 세포 내 용액 (ATP를 촬영하는 동안 적절한시기에 추가됩니다) (표 3)에 배치됩니다. 패치 클램프 피펫은 동일한 솔루션 (아무 ATP)로 채워집니다. 녹음은 상온에서 연 소식 기화기 위에 기가 옴 실을 형성하여 만들어집니다. 소포는 니콘 자이스 거꾸로 현미경과 위상차 현미경에 의해 시각입니다. </li><li> 막 전위는 -100 MV ~ 10 초 동안 + mV에서 100 mV까지 전압으로 유지됩니다. 녹음은 앰프 회로를 사용하여 5 kHz에서 필터링됩니다. 이하 연평균 길잃은 전기 또는 비 특정 소음 수준은 레코딩하는 것이 바람직합니다. </li><li> 데이터 주파수 단일 채널 이벤트의 진폭을 결정하는 예를 들어 Clampfit 10.0 소프트웨어와 분석됩니다. 전압 의존성 전류 전압 관계를 플롯에 의해 결정됩니다. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법에서와 같이 본 발명이 방법으로 phenotypes.SMVspurified 세포의 구별없이 뇌 전체에서 2 단계 이후 단계 1 submitochondrial 소포 (연 소식 기화기)의 끝에서 다른 세포 내 소기관에 의한 오염이 필수적으로 순수 미토콘드리아의 분리를하는 수 기술 그림 1과 우리의 이전 작업 (Alavian KN 등. 8)와 이전의 동결 구조적 및 기능적 무결성을 유지합니다. 냉동 및 해동 후, 미토콘드리아 격리 또는 연 소식 기화기는 녹음 및 생화학 분석하는 데 사용됩니다,하지만 호흡 연구에. 이 방법은 또한 동일한 단계를 사용하여 간에서 미토콘드리아 분리 할 수​​ 있습니다. 미토콘드리아와 연 소식 기화기는 전기 생리학 녹음 챔버에 도금 할 때 클러스터를 형성하는 경향이 있기 때문에,주의가 과도한 응집 과도한 희석로 샘플을로드하는 주어져야한다는 possibili을 줄일 수 있습니다인감 형성의...

<table><tbody><tr><td>PTFE 페스틀 포함 Potter-Elvehjem 조직 분쇄기</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 원심분리기 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>4639 세포 파쇄 용기</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 원심분리관</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>SW-50.1 로터 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L8-70M 초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>매니퓰레이터</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러 모델 P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</subsubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; atpase의 소포의 준비와 기술

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

미토콘드리아는 신진 대사, 생존 1, 개발 및 칼슘 2 신호 등 많은 중요한 세포 기능에 참여하고 있습니다. 가장 중요한 미토콘드리아 기능의 두 ATP, 산화 인산화에 의한 세포의 에너지 통화 및 프로그램 된 세포의 죽음 3 신호 조정의 효율적인 생산에 관련되어 있습니다. ATP의 생산을 주로 담당하는 효소는 ATP 합성 효소 4-5이라는 F1FO-ATP 합성 효소이다. 최근 몇 년 동안, 세포 자멸사 및 괴사 세포 죽음에서 미토콘드리아의 역할은 상당한 주목을 받고있다. 사멸 세포 죽음, 이러한 백스 같은 BCL-2 가족 단백질은 미토콘드리아 외막를 입력 올리고머 및 세포질 6에 직업 세포 사멸 인자를 방출, 외부 막을 permeabilize. 고전적인 괴사 된 세포의 죽음, 이러한 신경 세포의 허혈이나 excitotoxicity에,이 Larg에 의해 생성 된 것과매트릭스 칼슘 전자, 제대로 규제 증가는 내부 멤브레인 기공, 미토콘드리아 투과성 전이 기공 또는 MPTP의 개통에 기여하고 있습니다. 이 내부 막 탈분극 및 외부 막 파열, 직업 세포 사멸 인자의 릴리스 및 신진 대사 장애에 기여하고, 삼투압 변화가 발생합니다. BCL-XL 7을 (를) 포함하여 많은 단백질 F1FO ATP 합성 효소, 조절의 기능과 상호 작용합니다. BCL-XL은 F1FO ATP 합성 효소의 베타 소단위와 직접 상호 작용이 상호 작용 F1FO ATPase의 활성 8시 F1FO에 의한 H +의 그물 전송함으로써 증가하는 미토콘드리아의 효율성을 증가 F1FOATPasecomplex에서 누수가 전도성을 감소시킨다. ATP 합성 효소의 활동 및 변조를 연구하기 위해, 우리는 F1FO ATPase의를 포함한 설치류 뇌 submitochondrial의 소포 (연 소식 기화기)에서 분리. Alavian 등과 같이 연 소식 기화기는 F1FO ATPase의의 구조와 기능 무결성을 유지합니다. 여기, 우리는 방법을 설명우리는 쥐의 뇌에서 연 소식 기화기의 격리를 위해 성공적으로 사용하고 우리는 연 소식 기화기 (이온 누출 전도도) 채널의 활동을 분석 할 수있는 패치 클램프 기술을 묘사합니다.

우리의 프로토콜의 첫 번째 단계는 그림 1과 서양 얼룩에 의해 그림과 같이 미토콘드리아 정제 분리 할 수 있습니다. 그림 2에서 두뇌 파생 submitochondrial 소포 패치 기록의 예를 보여줍니다. 내부 아웃 패치 구성을 사용하여 우리는 ATP에 의해 변조 채널 활동을 보여줍니다. 제어 (CTL) 녹음 (왼쪽) 평균 600 P의 최대 전도도와 멀티 전도성 채널 활동을 보여줍니다. 그 즉시 화장실에 ATP 1 ㎜의 추가에 따라 감소 하였다. ATP의 전반적인 효과는 농도 의존적​​으로 연 소식 기화기 패치의 전도성을 감소하는 것입니다. SMV 별도 H + 표시 ACMA의 형광 강도의 감소를 측정 그림 3과 같이 F1FO ATPase의의 효율성을 측정하기 위하여 차단 후, 우리는 ATP 가수 분해에 대한 응답으로 연 소식 기화기에 H + 이온의 움직임을 측정 하였다. ATP에 민감한 H + 연 소식 기화기에 이온 격리를 추가 한 후 ...

쥐의 뇌에서 F1FO ATP 합성 효소 복합체 충실 submitochondrial 소포를 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 소포는 F1FO ATPase의 복잡하고 패치 클램프 녹음의 기술을 사용하여 변조의 활동의 연구를 할 수 있습니다.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial 소포 막 패치 클램프 녹음을 공연&gt; ATPase의 소포의 준비와 기술

미토콘드리아는 대사, 생존1, 발달 및 칼슘 신호 전달2을 포함한 많은 중요한 세포 기능에 관여합니다. 가장 ... 중 두 가지는...

이 절차의 전반적인 목표는 패치 클램프 기록을 수행하기 위해 쥐의 뇌에서 F1 F zero APA 소포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 쥐로부터 뇌를 적출하여 균질화함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 압력을 가하여 시냅스 구역을 파괴하는 것입니다.다음으로, 시냅토솜을 파이알 구배(phial gradients) 위에 층상으로 올립니다. 마지막 단계는 digitonin 및 L과 함께 배양하여 패치 클램프 기록을 위한 최종 소포를 얻는 것입니다. 미토콘드리아의 중요한 기능 중 하나는 산화적 인산화를 통한 ATP 생성입니다.ATP 생성의 책임이 있는 효소는 미토콘드리아 내막에 위치한 ATP 합성효소입니다. ATP 합성효소의 기능을 상세히 연구하기 위해, 당사는 SMV라고 부르는 특수한 하위 미토콘드리아 소낭을 분리합니다. 이들은 ATP 합성효소 효소를 안팎이 뒤집힌 형태로 포함하고 있습니다.그런 다음 패치 클램프 전극을 사용하여 이러한 SMV를 기록하고, 막의 누출도를 측정합니다. 이를 통해 미토콘드리아의 TP 생성 효율을 알 수 있습니다. 오늘 이 과정을 시연할 사람은 예일 대학교 제 실험실의 박사후 연구원인 Sylvia ti입니다.본 절차에서는, 참수로 쥐의 머리를 얻은 후 피부를 절개하여 두개골을 노출시키고, 가위나 Rons를 사용하여 두개골을 조심스럽게 절개하여 엽니다. 이어서 뇌를 적출하고 소뇌를 제외한 뇌 조직을 잘게 다진 후 최종적으로 격리된 버퍼 내에서 분리합니다. 그 다음, 조직을 5 mL 유리 테플론 균질기에 옮겨 약 5분 동안 총 10회 조심스럽게 균질화합니다. 이후 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4 °C에서 1,500 ×g로 10분간 시료를 원심분리합니다.미토콘드리아와 시냅토좀이 포함된 상층액을 회수하고 펠릿은 제거합니다. 그런 다음 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 다시 원심분리합니다. 다음으로 상층액을 제거하고 펠릿을 500 µL의 분리 버퍼(isolation buffer)에 재부유시킨 후, 세포 파쇄 용기(cell disruption vessel)를 사용하여 1,200 PSI의 압력을 10분 동안 가해 시냅토좀을 파쇄하고 빠르게 감압합니다. 파쇄된 시냅토좀을 두 가지 서로 다른 농도의 피콜(Fial)이 들어 있어 두 개의 층을 형성하는 원심분리관 위에 층층이 쌓습니다.다음으로 튜브를 SW 50.1 로터에 넣고 4°C에서 126,500 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 초원심분리기를 사용하면 펠릿 부분은 정제된 미토콘드리아가 됩니다. 층별 밀도 차이 사이에 형성된 층은 파괴되지 않은 시냅토좀입니다.그 후, 분리 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 벤치탑 원심분리기를 사용하여 4°C에서 16,000 ×g로 10분간 원심분리하십시오. 그런 다음, 미토콘드리아를 200 µL의 분리 완충액과 동일한 부피의 1% digitonin 혼합액에 재현탁합니다.얼음 위에 15분 동안 둡니다. 다음으로, 분리 버퍼를 더 추가하고 4°C에서 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 이 과정을 두 번 반복한 후, 펠렛을 200 µL의 분리 버퍼에 재현탁시키고, 10% Lybra PX 믹스 2 µL를 추가하여 얼음 위에 15분 동안 둡니다.그 후, 혼합물을 분리된 버퍼가 담긴 원심분리 튜브에 층층이 쌓습니다. 튜브를 SSW 50.1 로터에 넣고 4°C에서 182,000 ×g로 1시간 동안 원심분리합니다. 1시간 후에.최종 펠릿을 분리 버퍼(isolation buffer)에서 4°C, 16,000 ×g로 10분 동안 원심분리하여 세척합니다. 일반적인 전기생리학 장비는 증폭기, digi data 1, 440이 장착된 PC 컴퓨터, P clamp 10.0 소프트웨어와 연동되는 아날로그-디지털 변환기 인터페이스, 조작기, 현미경, 진동 절연 테이블 및 패러데이 케이지로 구성됩니다. 먼저, 화염식 brown 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 피펫을 뽑아냅니다.피펫의 최적 저항은 80에서 100 MΩ 사이여야 합니다. 생리학적 세포내 용액에 하위 미토콘드리아 소포를 첨가하십시오. 그 다음 패치 클램프 피펫을 동일한 용액으로 채우십시오.위상차 현미경으로 소포를 관찰합니다. SMV 패치 클램핑은 상온에서 수행합니다. 막전위를 -100 mV에서 +100 mV 범위까지 각각 10초 동안 유지하며 활성을 기록합니다.기록된 데이터는 증폭기 회로를 사용하여 5 kHz에서 필터링되며, clamp fit 10.0 소프트웨어로 분석합니다. 이 그림은 세포질과 미토콘드리아에서 준비한 용해물의 블롯을 보여줍니다. 상단 패널은 세포질 단백질인 GA dh에 대한 항체를 이용한 면역 블롯을 보여줍니다.하단 패널은 미토콘드리아 내막 단백질인 Cox four에 대한 항체를 사용한 블롯을 보여줍니다. 여기에는 1 mM ATP 첨가 전후의 대표적인 패치 클램프 기록 두 가지가 제시되어 있습니다. 유지 전위는 +70 mV입니다. 점선은 0 pA를 나타냅니다.각 트레이스는 10초 동안 기록되며, 트레이스 사이에는 10초의 간격이 있습니다. 다음은 SMV가 존재할 때, 그리고 TP가 없을 때와 있을 때의 시간 경과에 따른 CMA 지시약의 형광 강도 변화를 나타낸 예시 트레이스입니다. 이 영상을 시청하고 나면 미토콘드리아와 F1 FO 80 TP Synthes를 포함하는 하위 미토콘드리아 소포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 소포 막에 전극을 사용하여 I 저항성 씰을 형성하고 ATP Syntase Complex의 채널 활성을 분석하는 방법을 이해하게 될 것입니다.

f1fo-atpase-vesicle-preparation-technique-for-performing-patch-clamp

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

BK 채널 이온 전류는 패치 클램프 기법을 사용하여 기록됩니다. BK 채널로...

이온 채널 유학을위한 패치 클램프 및 재관류 기법으로 표현 Xenopus oocytes

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

우리는 zebrafish의 배아에서 MAUTHNER 뉴런과 다른 reticulospinal 세포 패치 클램프 녹음을 통해 전기적 활동을 기록하고 모니터링 할 수있는 그대로 뇌 - 척수 준비를 개발했습니다. 따라서, 우리는 배아의 주요 신경 세포에서 흥분성과 억제 성 시냅스 전류, 전압 문 채널 활동 및 활동 전위를 기록 할 수 있습니다.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

TRPV4의 연구에 일반적으로 사용되는 방법을 보완하기 위해 두 가지 방법이 설명되어 있습니다 : 그것의 mechanosensitivity는 저자 삼투 도전에 따라 형질 전환 효모에서 칼슘 2 + - 애큐 오린 luminometry으로 공부하실 수 있습니다. 그것은 또한 TRPV4-RNA에서 조사 할 수있는 온 - 셀 또는 절제 모드 클램프 전체 셀 두 전극 전압 클램프 또는 패치로 Xenopus의 난자를 주입했다.

효모 Luminometric 및 Xenopus의 난자 전기 생리 시험

전기 주조, 젤 이용한 붓기 - 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 횡단 단백질, KvAP의 재구성은 두 탈수 수분 보충 방법에 대한 설명된다. 두 방법 모두에서, 상기 단백질을 포함하는 작은 소포 단층이어서 형광 현미경 및 패치 클램프 전기 생리학에 의해 연구 할 수 GUVs을 형성하기 위하여 함께 융합된다.

횡단 단백질의 재구성, 현미경 및 패치 클램프 연구 거대한 단일 층 소포에 전압 게이트 이온 채널, KvAP,

이 방법 기사는 미토콘드리아의 열 생성 능력을 연구하기위한 새로운 접근 방식 인 패치 클램프 기술로 내부 미토콘드리아 막을 가로 지르는 H + 누출을 측정하는 주요 단계를 자세히 설명합니다.

미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

이 방법은 야생형 대조군에 비해 증가된 심근세포 미토콘드리아 코엔자임 Q 함량을 갖는 신생아 깨지기 쉬운 X 증후군 마우스에서 기공 개방에 대한 전압 역치를 결정하기 위해 낮은 전도도 양성자 누출에 대한 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 기여를 이용한다.

코엔자임 Q 과량의 설정에서 미토콘드리아 투과성 전이 기공의 개방 확률의 평가

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

이 프로토콜은 수동 endolysomal patch-clamp system을 사용하여 세포 내 소포의 이온 채널 활성을 직접 측정하는 방법을 자세히 설명합니다. 엔도리소좀(endolysosome)을 확대하고 이러한 소포를 수동으로 분리하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 통해 연구원은 절차를 정확하게 복제하고 적용할 수 있습니다.

단일 Endolysosomal 소포 분석을 위한 Patch-Clamp 기법

학습하세요 쥐 뇌에서 F1FO ATPase가 풍부한 소포를 분리하여 패치 클램프 기록을 수행하는 방법을. 이 기법은 미토콘드리아 ATP 합성 효소 활성과 기능을 상세히 연구하는 데 활용됩니다.

더 많은 동영상 탐색