₁ F _{O ATPase의 소포의 준비와 기술}

이 절차의 전반적인 목표는 패치 클램프 기록을 수행하기 위해 쥐의 뇌에서 F1, F, F, zero, APA 소포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 쥐의 뇌를 제거하고 균질화함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 압력을 가하여 시냅스 영역을 방해하는 것입니다.

다음으로, 시냅토솜(synaptosome)은 파이알 구배(phial gradients) 위에 층을 이룹니다. 마지막 단계는 패치 클램프 기록을 위한 최종 소포를 얻기 위해 digit toin 및 L로 배양하는 것입니다. 미토콘드리아의 중요한 기능은 산화적 인산화에 의한 TP 생성입니다.

TP 생성을 담당하는 효소는 미토콘드리아 내막에 위치한 A TP 합성효소입니다. A TP synthase 기능을 자세히 연구하기 위해 SMV라고 하는 특수 미토콘드리아 소포를 분리합니다. 그들은 Inside Out 구성으로 A TP synthase 효소를 포함합니다.

그런 다음 패치 클램프 전극으로 이러한 SMV를 기록하고 멤브레인의 누출 정도를 결정합니다. 이는 미토콘드리아에 의한 TP 생산의 효율성에 대해 알려줍니다. 오늘 이 절차를 시연할 사람은 예일 대학의 제 연구실에서 박사 후 연구원인 실비아 티(Sylvia ti)가 시연할 것입니다.

이 절차에서는 참수로 쥐의 머리를 얻은 후 피부를 잘라 두개골을 드러낸 다음 가위나 Rons로 잘라 두개골을 부드럽게 엽니다. 연속적으로, 두뇌를 제거하고, 고립시켜서 소뇌 없이 두뇌를 마지막으로 다진 것은, 완충기, 그 후에 5 밀리리터 유리제 테플론 균질화기로 그것을 온화하게 조직을 10 번, 합계에 있는 대략 5 분 균질화합니다 옮깁니다. 그 후, 벤치탑 원심분리기에서 섭씨 4도에서 10분 동안 1, 500배 G로 샘플을 원심분리하십시오.

상등액을 미토콘드리아와 시냅토솜으로 저장하고 펠릿을 버립니다. 다음 16, 000 시간, 벤치탑 분리기에 있는 4 섭씨 온도에 10 분 동안 G에 그것을 다시 분리기로 하십시오. 다음으로, 상등액을 버리고 입천장을 다시 현탁시킵니다 500 마이크로 리터의 분리 버퍼에서 1, 200 PSI의 압력을 10 분 동안 가하여 세포 파괴 용기로 시냅토솜을 파괴 한 다음 두 개의 층을 형성 할 두 가지 다른 농도의 fial로 원심 분리기 튜브에 파괴 된 시냅스 영역을 급속 감압 층

그런 다음 SW 50.1 로터와 원심분리기에 튜브를 126, 500회 G에서 섭씨 4도에서 20분 동안 놓습니다. 울트라 원심분리기에서 입천장은 정제된 미토콘드리아입니다. 서로 다른 밀도의 fial 사이의 층은 중단되지 않은 시냅토솜입니다.

그 후, 단독으로 원심 분리하여 펠릿을 세척하십시오. 16, 000 시간 G에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 벤치 탑 원심 분리기에서 버퍼링합니다. 이제 Resus는 200 마이크로 리터의 절연 버퍼에 미토콘드리아를 현탁시키고 1 % 손가락 toin의 동일한 부피와 결합시킵니다.

얼음 위에 15분 동안 놓습니다. 다음으로, 16, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 10 분 동안 고립, 완충액 및 분리기를 추가하십시오. 이 절차를 두 번 반복한 다음 200마이크로리터의 격리 버퍼에 입천장을 다시 부유시키고 2마이크로리터의 10% Lu 브래지어, PX를 넣고 섞어 15분 동안 얼음 위에 놓습니다.

그 후, 혼합물을 분리하여 층을 이루고 원심 분리기 튜브에 완충하십시오. 튜브를 SSW 50.1 로터에 넣고 섭씨 4도에서 1시간 동안 182, 000배 G로 원심분리합니다. 한 시간 후.

최종 팔레트를 16, 000 회 G의 절연 버퍼에서 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리하여 세척합니다. 일반적인 전기생리학 장비에는 증폭기, digi data 1, 440이 장착된 PC 컴퓨터, P 클램프와 함께 아날로그-디지털 변환기 인터페이스, 10.0 소프트웨어 매니퓰레이터, 현미경, 진동 차단 테이블 및 패러데이 케이지가 포함됩니다. 먼저, 불타는 갈색 마이크로 피펫 풀러에 있는 Boros 규산염 유리 모세관 튜브에서 피펫을 당깁니다.

피펫의 최적 저항은 80에서 100 메가 옴 사이 여야합니다. sub mitochondrial vesicles를 생리학적 intracellular solution에 추가합니다. 그런 다음 패치 클램프 피펫에 동일한 용액을 채웁니다.

위상 대비 아래에서 소포를 시각화합니다. SMV를 실온에서 패치한 후 현미경 검사. 멤브레인 전위가 각 기간 10초 동안 음의 100밀리볼트에서 양의 100밀리볼트 범위의 전압으로 유지될 때의 활동을 기록합니다.

기록된 데이터는 증폭기 회로를 사용하여 5kHz에서 필터링되고 클램프 핏 10.0 소프트웨어로 분석됩니다. 이 그림은 세포질과 미토콘드리아에서 제조된 용해물의 블롯을 보여줍니다. 상단 패널은 세포질 단백질 GA dh에 대한 항체를 사용하는 면역 블롯을 보여줍니다.

하단 패널은 미토콘드리아 내막 단백질에 대한 항체를 사용한 오점을 보여줍니다. Cox four 다음은 1 밀리 몰 TP를 추가하기 전과 후의 두 가지 대표적인 패치 클램프 녹음입니다. 유지 전위는 양의 70밀리볼트입니다. 파선은 0 피코암페어를 나타냅니다.

각 추적은 10초 동안 기록되며 추적과 표시 사이에는 10초가 있습니다. 다음은 SMV의 존재 및 TP의 부재 및 존재 여부에 따라 시간이 지남에 따라 A CMA 지시약의 형광 강도 변화의 흔적의 예입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 F1 FO 80 TP Synthes를 포함하는 미토콘드리아 소포인 미토콘드리아를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한, A TP Syntase Complex의 채널 활성을 분석하기 위해 소포의 막에 전극이 있는 Form I resistant seal을 이해해야 합니다.