Name: 대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 배우세요 CyTOF 질량 세포측정기의 일일 조정 및 샘플 분석 방법. 최적의 신호 획득과 정확한 단일 세포 데이터 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 익혀 연구 효율성을 높이세요.

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우리는 피드백을 박사 에반, 뉴웰 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 또한 멀티 란탄 족 함유 폴리스티렌 구슬의 샘플에 대한 DVS 과학 박사 숀 Bendall 감사드립니다. 우리는 NIH 보조금이 U19 AI057229에서 자금에 감사합니다.

CyTOF의 모든 세포 샘플은 고정 per​​meabilized해야합니다. 이 이리듐 함유 DNA의 intercalator의 큰 항목을 가능하게하고, 또한 대량 cytometer에 주입하기 전에 즉시 MilliQ 물 세척 및 resuspension 단계 동안 세포 용해를 방지 할 수 있습니다. 1. 시작 - 최대 질량 Cytometer의 <ol><li> CyTOF 소프트웨어 프로그램을 엽니 다. 악기 설정을 선택합니다. 카드 케이지 탭에서 오른쪽 하단 모서리로 이동하고 버​​튼을 &quot;ON&quot;히터를 클릭합니다. 200 ° C.에 도달하는 스프레이 챔버 맨틀에 대한 충분한 시간을 허용하도록 히터에 원하는 시간 전에 적어도 15 분을 돌려 </li><li> MilliQ 물로 가득 찬 신선한 주사기와 주사기 펌프에 흰색 규격-Ject 3 ML의 주사기를 교체합니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 작은 액체 소개 포트와 큰 가스​​ 도입 포트 모두를 통해 5% citranox 2 ~ 3 배를 끌어 주사기와 튜브를 사용하여 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 Backflush. MilliQ 물 t으로 backflushing 반복잔여 citranox를 제거 O. </li><li> CyTOF의 전면 패널에있는 표시등은 그림 1에서와 같이 불이되어 있는지 확인하십시오. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> 시작하기 전에 그림 1. CyTOF 패널 등. <ol start="5"><li> 아르곤 가스 탱크 밸브를 엽니 다. 이 켜하기 위해 전면에있는 &#39;아르곤&#39;빛의 원인이됩니다. </li><li> 가스 유입을 업 할 수있는 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 연결합니다. 나사가 빠지다 가스 튜브 커넥터를 메이크업과 검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 제거합니다. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 가스 도입 포트 줄기에있는 넓은 &quot;마디&quot;를합니다. 가스 도입 포트에 커넥터를 배치합니다. 가스 포트의 끝 부분 위에 검은 색 O-링을 배치하고, 포트 줄기의 넓은 부분을 통과 O-링을 강제로. 화장 가스 튜브로 하얀 원뿔 플라스틱 지적 좁은 끝으로 상단에 작품과 나사를 배치합니다. </li><li&gt; 액체 소개 관에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 첨부합니다. 조심스럽게 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝에 개통에 작은 튜브를 삽입합니다. micropipettor에 정류장에 느끼는 유사한 두 정거장이 될 것입니다. 당신은 가벼운 저항을 만날 때까지 첫째, 키를 눌러, 작은 튜브의 끝은 유리의 직선 섹션의 끝 부분에 있어야합니다. 둘째, 피팅에 더욱 유리의 직선 부분의 끝을 강제하기 위해 더 열심히 눌러 밀봉 할 나사 피팅 조입니다. 가열 망태에있는 하얀 개방에 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 끝을 삽입합니다. </li><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;시작 플라즈마&quot;를 누르십시오. 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요이 이미 삽입되어 있기 때문에, &quot;OK&quot;를 누릅니다. 이 소프트웨어는, 냉각기를 켜 가스의 흐름을 시작하고 플라즈마에 불을 지필 것입니다. 검출기 전압 두는 것입니다. 완료되면 &quot;플라즈마 시동 순서가 성공적으로 완료되었습니다&quot;라는 팝업 창이있을 것이다; 보도 &quot;OK&quot;. 새로운 불빛 (그림 2 전면 패널에에 있어야합니다 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> 그림 2. 플라즈마 점화 및 시동 성공적으로 완료 CyTOF 패널 등 후. <ol start="9"><li> 주사기 펌프 켜기. 오른쪽 상단에서 주사기 펌프를 시작하고 튜브를 통해 액체를 흐르는과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요에서 분사를 시작 녹색 &#39;재생&#39;버튼을 누릅니다. 기본 주사기 설정 물 3 ML위한 것입니다. 이 물 부족하면 샘플 샘플 루프를 통해 흐르는 될 위해서는, 주사기 펌프는 주기적으로 변경해야합니다. 화면의 상단에 액체가 주사기 펌프 밖으로 흘러이 얼마나 나타내는 카운터가 있습니다. 주사기 펌프이 카운터가 주사기의 끝을 도달 &quot;3.000&quot;또는 플런저에 도달 할 때 중단됩니다. 주사기를 충진 할 때, &quot;그만하세요&quot;가 아닌 카운터를 재설정 할 수있는 파란색 &#39;일시 중지&#39;버튼을 누르해야합니다. </li></ol>대량 Cytometer의 전자 &quot;&gt; 2. 매일 보정 <ol><li> 대량 cytometer는 보정 전에 뜨거운 안정적인 플라즈마를 달성하기 위해 약 20 분 필요합니다. 높은 가치의 3 % 이하 신호, 조정 단계의 목적은 &quot;Gd155&quot;을 (La139 + O16 산화) 유지하면서 Tm169 또는 Tb159의 원하는 신호를 극대화하는 것입니다. 데이터 수집 설정 창을 엽니 다 수집 설정 버튼을 클릭합니다. Analytes 탭에서 동위 원소 선택 패널을 열려면 주기적으로 테이블을 클릭합니다. 설명서에 나와있는 DVS 과학 튜닝 솔루션에서 동위 원소를 선택한 다음, &#39;저장&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 창 당 질량을 (ES) 열 버튼을 읽기 당 동위 원소를 클릭합니다. 새 번호를 입력하고 &quot;입력&quot;키를 눌러 &quot;펄스 카운트&quot;, 그리고 rescale y 축을 선택합니다. </li><li> 튜닝 솔루션을 그린 한 ML 규격 - Ject의 주사기를 채우십시오. &quot;로드&quot;를 샘플 포트 선택기를 돌려, 튜닝 솔루션 450 μl를 삽입 한 다음 &#39;삽입&#39;할 수있는 선택기를 켜십시오. 데이터 Acquisit의 질량 보정 탭에서<html> 이온 설정 창은 군중에 의해 흐르는되는 모니터링하기 위해 &#39;실행&#39;을 누르십시오. 오른쪽은 높은 질량 상태에서 창 왼쪽은 낮은 질량입니다. 참고 : 이미 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소 (그림 3)에 의한 TOF 9400-9800 지역에서 신호가있을 것입니다. 튜닝 솔루션 동위 원소가 디스플레이에 줄무늬 (그림 4)로 표시되기 시작 때까지 기다리십시오. </li></ol><img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> 세탁 솔루션과 물 헹굼 후 다양한 동위 원소에 대한 배경 수준을 보여주는 그림 3. 질량 보정 탭 창. TOF 9400-9800 주변 지역은 아르곤 가스의 크세논의 동위 원소에 해당하는, 항상 존재해야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 4 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg &quot;/&gt; 그림 4. 질량 보정 탭 창, DVS 튜닝 솔루션의 다양한 동위 원소에 대한 수직 줄무늬를 보여주는이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <ol start="4"><li> 창을 읽기 당 질량 (ES)로 돌아가서 왼쪽 상단 모서리에있는 녹색 &quot;재생&quot;버튼을 누르십시오. 단계 2.1에서 선택한 각 동위 원소는 다른 색 선으로 표시됩니다. 기본 x 축은 초에 &quot;시간&quot;입니다. 사람들이 안정된 때까지 서로 다른 동위 원소의 양을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 현재의 조정. 데이터 수집 설정 윈도우의 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &#39;현재&#39;를 선택합니다. = 0, 마무리 = 10, 단계 값 = 0.5, 정착 시간 = 200을 시작하자,하고 &#39;저장&#39;을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)에 돌아 가기를 클릭합니다. x 축은 이제 &quot;현재&quot;입니다. 참고 곳 동위 원소 피크 (그림 5), 그리고 R의 신호<html> ecord. 악기 설정 창 DAC 채널 설정 탭에서 &#39;현재&#39;아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol><img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> 그림 5. 현재 튜닝 프로필. <ol start="6"><li> 화장 가스의 조정. 드롭 다운 메뉴 변경 &#39;메이크업 가스를. &quot; = 0.95, 단계 값 = 0.05, 정착 시간 = 200 = 0.55, 최종을 시작하자. 저장을 누릅니다. 읽기 창 히트 플레이 당 질량 (ES)로 돌아 가기. x 축은 이제 &quot;메이크업 가스&quot;유량입니다. 기록 곳 동위 원소 피크의 신호. 끝 부분의 &quot;Gd155&quot;신호 (그림 6)의 급속한 증가를 관찰. DAC 채널 설정 탭으로 돌아 가기로 &quot;메이크업 가스&quot;를 아래로 스크롤하고 새 값을 입력합니다. 보도는 &quot;실제 현재 값을 설정&quot;을 선택한 다음 &quot;저장&quot;을 클릭하십시오. </li></ol>igure 6 &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6. 메이크업 가스 조정 프로필. <ol start="7"><li> 의 녹화 비율은 동위 원소 대 산화물을 원하는. 튜닝 솔루션의 두 번째 450 μl 주사를합니다. 매개 변수 탭에서 드롭 다운 메뉴에서 &quot;시간&quot;을 선택, 시간 = 200 정착, = 0, 최종에게 = 10, 단계 값 = 1을 시작해보세요. &quot;저장&quot;을 누르십시오. 창을 읽기에 따라 대용량의 &#39;재생&#39;(ES)를 누르십시오. 라인 (그림 7) 안정화 한 후 Tm169 또는 Tb159 (높은 값)에 대한 왼쪽 상단 상자에 값을 읽어 커서를 사용하고 또한 &quot;Gd155&quot;값 (높은 값의 &lt;3 %). 이 값은 나중에 참조 할 수 있도록 조정 파일에 저장할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> 그림 7. 현재 및 메이크업 가스를 최적화 한 후 튜닝 솔루션 신호 강도의 측정. <ol start="8"><li> 샘 청소ple 루프. DVS 워시 솔루션 500 μl 다음, 샘플 루프를 통해 MilliQ 물 3 ML를 삽입. 질량 보정 탭에서 &quot;실행&quot;을 눌러 청소의 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. 줄무늬의 강도는 (그림 4) 배경 수준 (그림 3)으로까지 MilliQ 물 및 모니터 3 ML에 따라 다음 감소하기 시작 때까지 씻는다. </li></ol> 3. 실행 샘플 <ol><li> 취득 창을 엽니 다. 기본 설정 : 즉석에서 분석 = 수행 = 듀얼, 듀얼 카운트 보정 = 데이터를 분석하는 신호. 노이즈 감소가 선택됩니다. 원하는 경우 다음의이 변경 될 수 있습니다. 파일 이름을 입력합니다. 모든 파일은 E의 :/ / 드라이브에 저장해야합니다. </li><li> 인수 지연을 설정합니다. 샘플 루프와 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 사이의 튜브의 길이에 따라 약 30 초의 전지 이벤트를 등록에 다소 시간이 지연 될 수 있습니다. 따라서, 합 &quot;취득 지연&quot;총과 &quot;감지기 세인트능력 지연은 &quot;최소 30 초이어야합니다. 탐지기 안정성 지연은 적어도 20 초이어야합니다. </li><li> 데이터 수집 시간을 설정합니다. &quot;취득 시간은&quot;당신이 샘플을 실행하려면 시간 (초)입니다. 전체 450 μl 샘플 루프를 작성하면 600 초 완료 할 필요합니다. 그것은 50-100 초는 샘플을 수행 오버 최소화하기 위해 런타임의 마지막에 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 시료의 Resuspension. 기계에 염분의 빌드 업 최소화하기 위해, 그것은 MilliQ 물에서 최종 resuspension 다음, 세포 염색의 끝에서 MilliQ 물에서 적어도 두 개의 세차가 완료하는 것이 좋습니다. MilliQ 물의 볼륨 펠릿은 당신이 시작 셀 및 전체 염색 절차 후 세포 회복의 수에 따라 달라집니다 셀을 resuspend하는 데 사용됩니다. 좋은 시작 장소는 10 6 (시작) 셀 / ML입니다. resuspension 후, 응집체를 제거 할 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. </li><li> 시작 샘플 실행합니다. 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력합니다.<html> , &quot;로드&quot;샘플을 삽입, 취득 창에서 다음 누르 &quot;실행&quot;을 &quot;주입&quot;로 전환하려면 샘플 루프 밸브를 전환합니다. </li><li> 셀 이벤트를 등록. 셀은 각 수직 동위 원소 / 마커 채널 (그림 8)에서 마르크의 수평 모음으로 스냅 샷 창에 표시됩니다. 대량 cytometer 1,000 세포 / 초를 등록 할 수 있지만, 셀 이벤트 사이의 더 나은 해상도는 일반적으로 300-500 셀 / 초에서 얻어진다. 이 ~ 1 셀 / 화면 재생의 평균에 해당합니다. 셀 이벤트 카운터가 뜨기 시작하기 전에 30 초까지 걸릴 수 있습니다. 이것은 &quot;에 On-The-Fly&quot;데이터 처리로 인해, 더 셀 이벤트 정보가 손실되지 않습니다. </li></ol><img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> 8 그림. 샘플 동안 수집 창에 별도의 세 가지 세포 사건과 관련된 요소에 해당하는 장소의 수평 행을 보여 실행할 수 있습니다.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <ol start="7"><li> 세포 사건의 품질. 각 동위 원소 채널뿐만 아니라 셀 이벤트 요금 좋겠어 어떤 배경을 확인할 수 있습니다. 대량 cytometer는 배경 위에 신호의 특정 증가로 &quot;셀 이벤트&quot;, 이렇게 무료로 금속 또는 언 바운드 항체는 &quot;셀 이벤트&quot;수를 변경할 수에서 배경 신호를 인식합니다. 또한, 너무 높은 농도에서 세포를 실행하는 것은 쌍으로 된 것 이벤트의 증가 된 수의 원인이 될 수 있습니다. 배경은 추가 세차 이상 세포 희석가 감소 할 수 있습니다. Doublets이 증가 런타임의 비용에서 큰 세포 희석하여 최소화 할 수 있습니다. </li><li> 샘플 데이터 수집을 완료. 수집 시간에 도달하면 데이터 수집이 완료된다. 있는 팝업 창이하기 전에 약간의가있을 것 &quot;OK&quot;버튼이 나타납니다, 다시이 &#39;에 On-The-Fly &quot;데이터 처리 때문입니다. 샘플 획득도 premat 중지 할 수 있습니다urely &quot;중지&quot;버튼을 눌러. 이 경우 이미 등록 모든 셀 이벤트는 출력 파일에 포함하여 처리됩니다. </li><li> 각 샘플 사이의 MilliQ 물을 적어도 500 μl의 주입은 또한 샘플 carryover를 최소화하는 데 도움이됩니다. </li></ol> 4. 사용 후 기계 청소 <ol><li> 솔루션을 씻으십시오. 최종 샘플을 실행하고 물 플러시 샘플 루프, 샘플 루프로 세척 솔루션의 450 μl를 삽입 한 후. 단계 2.8에서와 같이 데이터 수집 설정 창 (그림 9)의 질량 보정 탭에서 무료로 금속의 릴리스를 모니터링 할 수 있습니다. 무료 금속 신호가 감소하기 시작하면, MilliQ 물 3 ML로 플러시하고 배경 수준이 달성 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol><img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> DVS 워시 솔루션과 사후 운영 청소하는 동안 그림 9. 질량 보정 탭 창,. TOF 지역 9800-11000의 수직 줄무늬는 기계 청소하는 항체 - 라벨 동위 원소입니다. TOF 11,500 주변의 수직 줄무늬가 두 적외선 intercalator의 동위 원소에 해당합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 5. 컴퓨터를 종료 <ol><li> 악기 설정 창 RFG 컨트롤러 탭에서 &quot;플라즈마를 중지&quot;를 선택합니다. 절차가 완료되면 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거하라는 팝업 창이있을 것입니다. &quot;OK&quot;를 누릅니다. 카드 케이지 탭에서 히터를 끄십시오. 아르곤 공급 장치의 밸브를 닫습니다. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 제거. 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 제거합니다. 나사가 빠지다 샘플 소개 단계 1.6에서 관 그리고 옆 넣습니다. 약간 느슨하게하기 위해 돌려서 메이크업 가스 도입 연결 한 다음, 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 당긴다. 함께 망 피팅으로 남겨두면 리터의 가능성을 줄일 수 있습니다검은 색 고무 O-링과 흰색 원뿔 플라스틱 조각을 osing. </li><li> 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요 청소. 단계 1.3에서와 같이 주사기와 튜브를 사용하여 5 %의 citranox과 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요의 두 포트를 Backflush. 스토어, 다음 사용 때까지 5 % citranox에 덮여. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

인간 면역 감시 센터, 대량 세포 계측법을 포함한 assays의 비용을 복구 전적으로 사용자의 비용을 청구 스탠포드 대학에서 서비스 센터에서 저자는 일 모두.

지난 몇 수십 년 동안 형광 유동 세포 계측법은 표면 표현의 측면과 기능 assays에서 모두 단일 세포를 분석 주력 방법이었습니다. 그러나, 형광 염료의 스펙트럼 중복의 문제가 동시에 마커의 수를 제한하고 있습니다. 12 개 이상의 동시 마커를 사용하여 실험이보고 된 반면, 필요한 보상의 양이 기술적으로 어려워집니다. 대신 fluorophores의, 대량 세포 계측법은 항체에 대한 라벨과 같은 금속에 킬레이트 사이트와 폴리머를 사용하여 DVS 과학에 의해 개척. 1-3 금속의 순도와 ICP-MS의 질량 해상도로 인해 효율적으로 더 &quot;스펙트럼 중복이 없다&quot;고 말했다. 사용 요소의 대부분은 생물학적으로 관련이없는 때문에, 원인 약간의 배경도 있습니다 &quot;autofluoresence가.&quot; 이러한 사실은 하나의 실험에서 30 개 이상의 동시 마커의 사용을 허용합니다. 넓은 마구도 6,7 있습니다전형적인 형광 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> CyTOF TM 대량 cytometer </td><td> DVS 과학 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 솔루션을 씻으십시오 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201071 </td><td> 물에 0.05 % 불화 수소산 산 </td></tr><tr><td> 솔루션을 튜닝 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm으로 라, CS, TB, TM, IR, 추적 질산 </td></tr><tr><td> 유럽​​ 연합 (EU) 함유 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 201073 </td><td> 약 1,000,000 / ML에서 제공 구슬, 자연 풍부한 유럽 연합 (EU) 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 멀티 란탄 족 함유 (라 / 홍보 / TB / TM / 루) - 폴리스티렌 구슬 </td><td> DVS 과학 </td><td> 아직 상업적으로에 사용할 수 </td><td> 등록 된 란탄 계열 원소의 자연 풍부한 동위 원소를 포함 </td></tr><tr><td> 질산 (집중) </td><td> 피셔 과학 </td><td> A467-500 </td><td> Optima 추적 메탈 순수 ICP-MS 학년 </td></tr><tr><td> 폴리스티렌 내내 아래로 튜브 셀 스트레이너 캡-5mL로 </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> 주입하기 전에 세포 샘플을 필터링하는 데 사용 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject tuberkulin 주사기-1mL </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010-200V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> 규격 - Ject의 주사기-3 ML </td><td> 헨케 말대꾸 늑대 </td><td> 4010.000V0 </td><td> 실리콘 무료, 라텍스 무료 </td></tr><tr><td> MilliQ 물 </td><td></td><td></td><td> 18 MΩ 순수한 물, 유리 또는 상업적 세제 (바륨 현재의 높은 수준으로 인해)으로 세척 한 플라스틱 병에 저장해서는 안됩니다. </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z273236 </td><td> 산성 세제 </td></tr><tr><td> 아르곤 가스 </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999 % 초 고순도 </td></tr></tbody></table>

대량 세포 계측법 : cytof 질량 cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

최근 몇 년 동안, 단일 세포의 급속한 분석은 일반적으로 유동 세포 계측법과 휘황-라벨 항체를 사용하여 수행되었습니다. 그러나, 형광 방출의 스펙트럼 중복의 문제는 동시 프로브의 수를 제한하고 있습니다. 반면, 오히려 fluorophores보다 ICP-MS. 1 액체 단일 셀 도입 시스템 DVS 과학 커플의 새로운 CyTOF 질량 cytometer는 매우 강화 금속 동위 원소를 포함하는 킬레이트 화 고분자는 항체 또는 기타 특정 프로브에 연결된다. 2-5가 때문에 금속 순도와 질량 cytometer의 대량 해상도, 인근 동위 원소로부터 &quot;스펙트럼 중복&quot;은 없습니다, 따라서 보상 매트릭스 필요. 또한, 란탄 족 금속의 사용으로 인해, autofluorescence 대한 동등한 따라서 거기에는 생물학적 배경이 없습니다합니다. 원자 질량 103-203, 이론적으로 최대 100 레이블이 동시에 구별 할 수에 걸쳐 대량 창을 갖추고 있습니다. 현재, 35 개 이상의 채널 샘플 면역 프로파일의 전례 절개를 허용 DVS 과학에서 사용할 수있는 킬레이트 시약을 사용하여 사용할 수 있습니다. 6-7 대량 세포 계측법에 단점은 프로브 당 별도의 금속 동위 원소 (앞으로 또는 측면 분산 가능성이 이에 상응하는 금액),하고 파괴적인 기술 (복구를 정렬의 어떠한 가능성)이라는 사실에 대한 엄격한 요구 사항이 포함되어 있습니다. 대량 cytometer의 현재 구성도 만의 셀 전송 속도 ~ 25 %, 따라서 세포의 높은 입력 번호를 필요가 있습니다. 대량 cytometer의 최적의 일일 실적은 몇 가지 단계가 필요합니다. 최적화의 기본 목표는 M 신호 강도를 줄이고 M 16에서 원하는 신호를 방해한다는 산화물 (M 16)의 형성을 최소화하면서 원하는 금속 동위 원소 (M)의 측정 신호 강도를 극대화하는 것입니다. 첫 번째 단계는 시스템 때문에 고온, 안정적 I을 따뜻하게하는 것입니다CP 플라즈마가 설립되었습니다. 둘째, 현재와 메이크업 가스 유량에 대한 설정은 매일 최적화해야합니다. 샘플 수집하는 동안, 최대 셀 이벤트 요금은 검출기 효율과 처리 속도 1,000 세포 / 초에 의해 제한됩니다. 그러나, 느린 셀 이벤트 속도 (300-500 셀 / 초)은 샘플의 품질에 따라 보통 셀 이벤트 사이하므로 더 나은 해상도가 doublets와 파편을 통해 그대로 singlets을 극대화 할 수 있도록하는 것이 바람직하다. 마지막으로 하루의 끝에 기계의 적절한 청소는 무료 금속에 의한 배경 신호를 최소화하는 데 도움이됩니다.

위의 프로토콜을 따르면 네 가지를 달성해야합니다. 첫째, 대량 cytometer를위한 충분한 워밍업 시간을 허용하는 것은 최적의 신호와 최소한의 산화물 형성에 필요한 뜨거운, 안정적 플라즈마를 생성합니다. MilliQ 물과 DVS 워시 솔루션 (그림 9)와 대량 cytometer의 두 번째, 적절한 세척은 (그림 8) 샘플 수집하는 동안 배경을 감소하는 데 도움이, 금속 흡착의 수준 튜브와 기계의 다른 부분으로 줄일 도움이 될 것입니다. 또한 기계에 갇혀함으로써 샘플에서 샘플로 carryover를 최소화하기 수있는 세포를 제거하는 데 도움이됩니다. 산화 질량 M 16에서 배경을 최소화하면서 대량 cytometer (그림 5-7)의 셋째, 산화물 형성이 완전히 예방할 수 할 수는 없지만, 적절한 튜닝은 원하는 질량 M에 최적화 총 신호를 도움이 될 것입니다. 로 그림 10에서와 같이 부적절한 튜닝 (마젠타)는...

CyTOF 질량 cytometer의 성능의 일상 튜닝 및 최적화에 필요한 단계에 설명되어 있습니다. 최적의 샘플 준비와 유량의 댓글이 논의

대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

최근 몇 년 동안 단일 세포의 신속한 분석은 일반적으로 유세포 분석법과 형광 표지 항체를 사용하여 수행되어 왔습니다. 하지만...

이 절차의 전반적인 목표는 CyTOF 장비의 적절한 일일 튜닝 및 시료 분석 방법을 시연하는 것입니다. 먼저, 장비를 조립하고 전원을 켭니다. 그다음, 최대 신호를 얻기 위해 튜닝을 위한 장비 설정을 최적화합니다.이제 기기는 샘플을 분석할 준비가 되었습니다. 마지막 단계에서는 기기를 세척하고 전원을 끕니다. 결과적으로, 특정 시간 요구 사항에 따라 최적의 세포 데이터를 얻을 수 있습니다.이 기술에 대한 시각적 시연은 매우 중요합니다. 매일 수행하는 설정, 튜닝 및 세척 절차는 매뉴얼만으로는 습득하기 어렵습니다. 이는 동시에 여러 소프트웨어 단계가 수반되기 때문입니다.적절한 배경 수준과 신호 강도에 대한 감을 익히기 위해 경험을 쌓아야 합니다. 실험을 시작하기 최소 15분 전에 CyTOF 소프트웨어 프로그램을 열고 기기 설정(instrument setup)을 선택하십시오. 그런 다음 카드 케이지(card cage) 탭에서 히터 켜기(heater on) 버튼을 클릭하여 스프레이 챔버 맨틀의 온도가 200 °C에 도달하도록 하십시오.시린지 펌프의 시린지를 milli cube water가 채워진 새 시린지로 교체하십시오. 그 다음, 각 포트를 통해 5% Citron으로 두 번 역세척하여 네뷸라이저를 세척하십시오. 잔류 Citron을 제거하기 위해 Milli Q water로 역세척을 반복하십시오.다음으로, 아르곤 가스 탱크 밸브를 열면 기기 전면의 아르곤 표시등이 켜집니다. 그런 다음 네뷸라이저를 메이크업 가스 주입구에 연결하고, 네뷸라이저를 액체 도입 튜브에 연결하십시오. 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭에 있는 가열 맨틀의 흰색 개구부에 네뷸라이저 끝부분을 삽입하십시오.'plasma 시작'을 클릭한 다음 '확인'을 클릭하십시오. 시작 과정이 완료되면 팝업 창에서 다시 '확인'을 클릭하십시오. 이제 시린지 펌프의 전원을 켜십시오.시린지를 다시 채울 때는 일시 정지 버튼 대신 정지 버튼을 눌러 부피 카운터를 리셋하십시오. 질량 세포 분석기(mass cytometer)를 교정하기 전에, 반드시 20분 동안 예열되었는지 확인하십시오. 기기가 안정화되면, 데이터 획득 설정 버튼을 클릭하여 데이터 획득 설정 창을 엽니다. 분석물 탭에서.주기율표를 클릭하여 동위원소 선택 패널을 엽니다. 그런 다음 매뉴얼에 나열된 DVS sciences 튜닝 솔루션의 동위원소를 선택하고 저장(save)을 클릭합니다. 다음으로, 읽기당 동위원소(isotopes per reading) 버튼을 클릭하여 읽기당 질량 창을 엽니다.펄스 수를 선택하고 새 숫자를 입력한 후 enter 키를 눌러 y축의 배율을 조정하십시오. 이제 1 mL 정량 주입 시린지에 튜닝 용액을 채웁니다. 샘플 포트 선택기를 load로 돌리십시오.튜닝 용액 450 µL를 주입한 다음, 셀렉터를 inject 방향으로 돌립니다. 튜닝 용액의 동위원소들이 디스플레이에 스트리크 형태로 나타나기 시작할 때까지 기다리십시오. 비행 시간(time of flight) 9,400에서 9,800 영역의 신호는 아르곤 가스 내의 xenon 동위원소로 인해 발생하는 것입니다.이제 판독 창당 질량 화면으로 돌아가 녹색 재생 버튼을 클릭하십시오. 각 색상 선은 분석물 탭에서 선택한 동위원소를 나타냅니다. 동위원소 수준이 안정되면, 데이터 획득 설정 창의 파라미터 탭에 있는 드롭다운 메뉴에서 현재 전류를 조정하십시오.시작 창에서 종료(finish) 값에 10을 입력하고, 시작 값에 0을 입력하십시오. 단계(step) 값에는 0.5를, 침강 시간(settling time)에는 200을 입력하십시오. 그런 다음 저장(save)을 클릭하십시오.그런 다음 읽기당 질량(masses per reading) 창을 다시 클릭하고 재생을 누릅니다. 동위원소 신호가 정점에 도달하는 지점을 확인한 후, 기기 설정 창의 DAC 채널 설정 탭으로 이동합니다. 아래로 스크롤하여 전류(current) 항목을 찾아 동위원소 피크 값을 입력하십시오.실제 전류 값 설정(set actual current value)을 클릭한 다음 저장하십시오. 다음으로, 드롭다운 메뉴를 메이크업 가스(make up gas)로 변경하십시오. 시작 창에 0.55, 종료 창에 0.95, 단계 값 창에 0.05, 안정화 시간 창에 200을 입력하십시오.저장을 클릭하십시오. 질량당 판독 창으로 돌아가 재생을 다시 클릭하면 x축에 보정 가스 유량이 표시됩니다. 동위원소 신호가 정점에 도달하는 값을 기록하고, 마지막 부분에서 GD 1 55 신호가 급격히 증가하는 것을 관찰하십시오.그 다음 DAC 채널 설정 탭으로 돌아갑니다. makeup gas 항목으로 스크롤을 내려 새로운 동위원소 피크 값을 입력합니다. set actual current value를 클릭합니다.그 다음, 다시 저장(save)을 클릭하여 원하는 동위원소 대비 산화물의 비율을 기록합니다. 먼저, 튜닝 용액을 450 µL 두 번째로 주입합니다. 그 후 파라미터 탭에서 드롭다운 메뉴의 시간(time)을 선택하고, 시작(start) 창에 0, 종료(end) 창에 10, 단계 값(step value) 창에 1, 그리고 안정화(settling) 창에 200을 입력합니다.masses per reading 창에서 재생 버튼을 클릭한 후, 커서를 사용하여 TM 1 69 또는 TB 1 59의 더 높은 값과 GD 1 55 값을 읽으십시오. 이제 샘플 루프를 통해 3 mL의 Milli Q water를 주입한 다음, 500 µL의 DVS 세척액을 주입하십시오. mass calibration 탭에서 run을 클릭하여 스트리크의 강도가 감소하기 시작할 때까지 세척 과정의 진행 상태를 모니터링하십시오.그다음 3 mL의 milli-Q water를 넣고 스트리크(streak)가 배경 수준으로 낮아질 때까지 모니터링합니다. 앞서 시연한 샘플 동위원소를 튜닝 용액 동위원소 란에 입력한 후 저장 버튼을 클릭합니다. 다음으로 분석 창을 열고 샘플 부피에 맞게 분석 설정을 변경합니다.예를 들어, 450 µL의 샘플은 샘플 루프를 채우게 되며, 세포 데이터 획득 시 발생하는 지연 시간을 고려하여 600초 동안 작동하게 됩니다. 작동 전 획득 지연 시간(acquisition delay)을 최소 30초로, 검출기 안정화 지연 시간(detector stability delay)을 최소 20초로 설정하십시오. 세포 샘플을 milli cube water로 최소 2회 세척한 다음, 샘플을 최대 10⁶ cells/mL 농도로 재현탁하고, 이렇게 만들어진 세포 용액을 35 µm 세포 스트레이너로 여과하십시오.응집물을 제거하기 위함입니다. 이제 현재 샘플에 대한 새 파일 이름을 입력하십시오. 모든 파일은 반드시 E 드라이브에 저장해야 함에 유의하십시오.그런 다음 샘플 루프 밸브를 로드(load) 위치로 전환하여 샘플을 주입하고, 샘플 루프 밸브를 다시 주입(inject) 위치로 전환한 다음 실행(run)을 클릭합니다. 획득 창에서 세포는 스냅샷 창의 각 수직 동위원소 채널에 수평 방향의 표시 집합으로 나타나며, 여기에서 보여주는 바와 같이 초당 약 300에서 500개의 세포일 때 최적의 해상도를 나타냅니다.시료의 데이터 수집이 완료되면 팝업 창이 나타납니다. 확인(okay)을 클릭하여 시료 분석 완료를 확정하고, 기기를 세척하여 시료 간의 오염(carryover)을 최소화하기 위해 각 시료 사이에 최소 500 µL의 MQ water를 주입하십시오. 사용 후에는 450 µL의 세척 용액을 시료 루프에 주입하십시오. 유리 금속의 방출을 모니터링한 다음, 배경 스트릭 레벨(background streak levels)에 도달할 때까지 세척 상태를 확인하며 3 mL의 milli Q water로 시료 루프를 플러싱하십시오.그런 다음 기기를 종료하려면 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭을 선택하고 plasma 정지 버튼을 클릭하십시오. 절차가 완료되면 팝업 창에서 확인을 클릭하며, 카드 케이지 탭에서 네뷸라이저 제거를 권장합니다. 가열기를 끄고 아르곤 공급 밸브를 잠근 후, 네뷸라이저를 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 분리하십시오.다음으로, 시료 도입 튜빙을 풀어서 옆으로 치워 둡니다. 메이크업 가스 도입 연결부를 약간 느슨해질 때까지 푼 다음, 네뷸라이저를 당겨서 분리합니다. 마지막으로, 앞서 시연한 것과 동일한 주사기와 튜빙을 사용하여 5% Citron으로 네뷸라이저의 양쪽 포트를 세척하고, 다음 사용 때까지 네뷸라이저를 5% Citron으로 덮어 보관합니다.UE water와 DVS 세척 용액으로 mass cytometer를 적절히 세척하면 튜빙 및 기기의 다른 부품으로의 금속 흡착 수준을 낮추어, 이 그래프들에서 보이는 것과 같은 배경 신호를 줄이는 데 도움이 됩니다. 자홍색 선으로 표시된 부적절한 튜닝의 경우, 진한 파란색 선으로 표시된 적절하게 튜닝된 샘플과 비교했을 때 m+16에서의 산화물 형성이 현저히 증가했습니다. 이는 m에서의 원하는 신호를 약간 감소시키고, m+16에서의 원치 않는 배경 간섭을 크게 증가시키는 결과를 초래합니다.Milli Q water를 이용해 시료를 적절히 세척하고 희석하면 속도를 유지하면서도 배경 신호를 최소화하고 세포 해상도를 최대로 높일 수 있습니다. 본 실험에서 보여주는 대표적인 실험 데이터와 마찬가지로, 천연 존재비의 lanthanum 139, barium 140, terbium 159, erbium 169 및 lutetium 175를 포함하는 폴리스티렌 비드를 세포 획득 모드에서 분석하였습니다. 데이터는 FlowJo를 사용하여 분석하였으며, 파손된 비드에서 발생한 파편은 게이팅을 통해 제거하였습니다.적절하게 튜닝된 시료는 진한 파란색 선으로 표시된 0.74 liters per minute 유량일 때인 것으로 확인되었습니다. 낮은 유량일 때보다 이 유량에서 더 높은 신호 강도가 관찰되었으며, 적절하게 튜닝된 시료는 부적절하게 튜닝된 신호보다 M 금속 질량에서 더 높은 신호를 보이고 m plus 16 산화물 질량에서는 더 낮은 신호를 보이는 것으로 관찰되었습니다. LANTHANUM 1 39 및 THULIUM 1 69의 M 질량 신호를 확대한 모습이 여기에 표시되어 있습니다.메이크업 가스 유량이 LANTHANUM 1 39 신호 강도에 thulium 1 69 신호 강도보다 더 큰 영향을 미친다는 점에 유의하십시오. 이 그래프들은 각각 LANTHANUM 1 39 plus oh 16 및 thulium 1 69 plus oh 16 산화물에 해당하는 m plus 16 산화물 질량 1 55 및 180 5에서의 신호를 보여줍니다. lanthanum 1 39가 thulium 1 69보다 더 쉽게 산화되기 때문에, 메이크업 가스 유량이 질량 180 5 신호보다 질량 1 55 신호를 훨씬 더 증가시킨다는 점에 유의하십시오.메이크업 가스 유량에 따른 m 및 m plus 16 신호 강도가 여기에 표시되어 있습니다. 채워진 아이콘은 질량 M을 나타내며, 빈 아이콘은 질량 M plus 16을 나타내고, 선의 색상은 각각의 질량 M에 대응합니다. LANTHANUM 1 39 및 price ODIUM 1 41의 신호 강도가 메이크업 가스 유량에 의해 크게 영향을 받는다는 점에 유의하십시오. 심지어 질량 M보다 질량 m plus 16 산화물이 더 많이 존재하는 지점에 도달하기도 합니다. 이 영상을 시청하신 후에는 CyTOF를 적절하게 가동하고 튜닝하며, 샘플을 분석하고, 마지막으로 일일 분석 종료 후 장비를 적절하게 세척하고 종료하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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