대량 세포 계측법 : CyTOF 질량 Cytometer에 매일 조정하고 실행 세포 샘플에 대한 프로토콜

이 절차의 정밀 검사 목표는 CyTOF 기기에 대한 적절한 일일 튜닝 및 시료 분석을 입증하는 것입니다. 먼저 기계를 조립하고 켭니다. 다음으로, 계측기 설정은 최대 신호로 튜닝하기 위해 최적화됩니다.

그러면 기계가 샘플을 실행할 준비가 된 것입니다. 마지막 단계에서 기계를 청소하고 종료합니다. 궁극적으로 특정 시간 요구 사항에 따라 최적의 셀 데이터를 얻을 수 있습니다.

이 기술을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 일일 설정, 튜닝 및 청소 절차는 설명서에서 배우기 어렵습니다. 여러 동시 소프트웨어 단계가 관련되어 있기 때문입니다.

실험을 시작하기 최소 15분 전에 적절한 배경 수준과 신호 강도에 대한 느낌을 습득하기 위해 경험을 쌓아야 합니다. CyTOF 소프트웨어 프로그램을 열고 기기 설정을 선택합니다. 그런 다음 카드 케이지 탭에서 히터 켜기 버튼을 클릭하여 스프레이 챔버 맨틀이 섭씨 200도에 도달하도록 합니다.

주사기 펌프의 주사기를 밀리 큐브 물로 채워진 새 주사기로 교체합니다. 그런 다음 리치 포트를 통해 5% Citron으로 두 번 역세척하여 분무기를 청소합니다. 잔여물을 제거하려면 Milli Q 물로 등을 플러시하는 작업을 반복하십시오.

그런 다음 아르곤 가스 탱크 밸브를 열어 기계 전면의 아르곤 표시등이 켜집니다. 그런 다음 분무기를 보충 가스 주입구에 부착하고 분무기를 액체 주입 튜브에 부착합니다. 분무기의 끝을 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭에 있는 가열 맨틀의 흰색 구멍에 삽입합니다.

start plasma(플라즈마 시작)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 시작이 완료되면 팝업 창에서 확인을 다시 클릭합니다. 이제 주사기 펌프를 켭니다.

주사기를 다시 채울 때 일시 중지 버튼보다 중지 버튼을 눌러 볼륨 카운터를 재설정하십시오.질량 세포분석기를 보정하기 전에 20분 동안 예열되었는지 확인하십시오. 기기가 안정화되면 수집 설정 버튼을 클릭하여 데이터 수집 설정 창을 엽니다. 분석물 탭에서.

주기율표를 클릭하여 동위원소 선택 패널을 엽니다. 그런 다음 설명서에 나열된 DVS sciences 튜닝 솔루션에서 동위원소를 선택하고 저장을 클릭합니다. 다음으로, isotopes per reading 버튼을 클릭하여 masses per reading 창을 엽니다.

pulses count를 선택하고 새 숫자를 입력한 다음 enter를 눌러 y축을 다시 조정합니다. 이제 녹색 1 밀리리터 노름을 채우고 주사기에 튜닝 용액을 주입합니다. 샘플 포트 선택기를 돌려 로드합니다.

450마이크로리터의 튜닝 용액을 주입한 다음 선택기를 돌려 주입합니다. 튜닝 용액 동위원소가 이 디스플레이에 줄무늬로 나타나기 시작할 때까지 기다립니다. 비행 시간, 9, 400에서 9, 800 영역의 신호는 아르곤 가스의 크세논 동위원소 때문입니다.

이제 읽기당 질량 창으로 돌아가서 녹색 재생 버튼을 클릭합니다. 각 컬러 라인은 analytes 탭에서 선택한 동위원소를 나타냅니다. 동위원소 수준이 일정하면 데이터 수집 설정 창의 매개변수 탭에 있는 드롭다운 메뉴에서 전류 선택 전류를 조정합니다.

시작 창에서 완료를 위해 0을 입력하고 10을 입력합니다. 단계 값으로 0.5를 입력하고 정착 시간으로 200을 입력합니다. 그런 다음 저장을 클릭합니다.

그런 다음 읽기당 질량 창을 다시 클릭하고 재생을 클릭합니다. 동위원소의 신호가 피크 위치를 확인한 후 기기 설정 창의 DAC 채널 설정 탭으로 이동합니다. 현재까지 아래로 스크롤하고 동위원소 피크 값을 입력합니다.

set actual current value(실제 현재 값 설정)를 클릭한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 그런 다음 드롭다운 메뉴를 변경하여 가스를 구성합니다. 시작 창에 0.55, 끝 창에 0.95, 단계 값 창에 0.05, 정착 시간 창에 200을 입력합니다.

저장을 클릭합니다. Masses per reading 창으로 돌아가서 재생을 다시 클릭하면 x축에 보충 가스 유량이 표시됩니다. 동위원소의 신호가 최고조에 달하는 값을 기록하고 끝 부분에서 GD 1 55 신호가 급격히 증가하는 것을 관찰합니다.

그런 다음 DAC 채널 설정 탭으로 돌아갑니다. makeup, gas까지 아래로 스크롤하고 새 동위원소 피크 값을 입력합니다. 실제 현재 값 설정을 클릭합니다.

그런 다음 저장을 다시 클릭하여 원하는 동위원소 대 산화물의 비율을 기록합니다. 먼저 튜닝 용액을 두 번째 450마이크로리터 주입합니다. 그런 다음 매개 변수 탭의 드롭다운 메뉴에서 시간을 선택하고 시작 창에 0, 종료 창에 10, 단계 값 창에 1, 정착 창에 200을 입력합니다.

읽기당 질량 창에서 재생을 클릭한 후 커서를 사용하여 TM 1 69 또는 TB 1 59의 더 높은 값과 GD 1 55 값도 읽습니다. 이제 시료 루프를 통해 3ml의 Milli Q 물을 주입한 다음 500마이크로리터의 DVS 세척 용액을 주입합니다. Mass Calibration(질량 보정) 탭에서 run(실행)을 클릭하여 줄무늬의 강도가 감소하기 시작할 때까지 세척 세척 진행 상황을 모니터링합니다.

그런 다음 3ml의 밀리 큐브 물을 붓고 줄무늬가 배경 수준까지 내려갈 때까지 모니터링합니다. 먼저 튜닝 용액 동위원소에 대해 방금 설명한 샘플 동위원소를 입력한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 다음으로, 수집 창을 열고 샘플 부피에 대한 필요에 따라 수집 설정을 변경합니다.

예를 들어, 450마이크로리터 샘플은 샘플 루프를 채우고 실행하는 데 600초가 걸리므로 셀 데이터 수집이 지연될 수 있습니다. 실행 전에 획득 지연을 최소 30초로 설정하고 감지기 안정성 지연을 최소 20초로 설정합니다. 세포 샘플을 밀리 큐브 물로 최소 2회 세척한 다음 샘플을 최대 10에서 밀리리터당 6개 세포로 재현탁하고 생성된 세포 용액을 35마이크로미터 세포 여과기를 통해 여과합니다.

모든 애그리게이트를 제거합니다. 이제 현재 샘플의 새 파일 이름을 입력합니다. 모든 파일은 E 드라이브에 저장해야 합니다.

그런 다음 샘플 루프 밸브를 로드로 전환하고, 샘플을 주입하고, 샘플 루프 밸브를 다시 주입으로 전환한 다음 실행을 클릭합니다. 획득 창에서. 셀은 스냅샷 창에서 각 수직 동위원소 채널에서 표시의 수평 모음으로 표시되며 여기에서 설명한 것처럼 초당 약 300-500셀에서 최상의 해상도를 나타냅니다.

샘플의 데이터 수집이 완료되면 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭하여 샘플 실행 완료를 확인한 다음 각 샘플 사이에 최소 500마이크로리터의 MQ 물을 주입하여 기계 세척을 위한 샘플 캐리오버를 최소화합니다.사용 후에는 450마이크로리터의 세척 용액을 샘플 루프에 주입합니다. 유리 금속의 방출을 모니터링한 다음 3ml의 milli Q 물로 샘플 루프를 플러시하고 백그라운드 줄무늬 수준에 도달할 때까지 세척을 모니터링합니다.

그런 다음 기계를 종료하려면 기기 설정 창의 RFG 컨트롤러 탭을 선택하고 플라즈마 중지를 클릭합니다. 절차가 완료되면 팝업 창에서 확인을 클릭하여 카드 케이지 탭 아래에서 분무기를 제거할 것을 권장합니다. 히터를 끄고 아르곤 공급 장치의 밸브를 닫은 다음 분무기를 조심스럽게 뒤로 당겨 스프레이 챔버에서 제거합니다.

다음으로, 샘플 주입 튜브의 나사를 풀고 한쪽에 둡니다. 메이크업 가스 주입 연결부가 약간 느슨해질 때까지 나사를 풀고 분무기를 당겨 빼냅니다. 마지막으로, 앞에서 설명한 것과 동일한 주사기와 튜브를 사용하여 5% Citron으로 분무기의 두 포트를 청소하고 5% Citron으로 덮인 분무기를 다음 사용까지 보관합니다.

UE 물과 DVS 세척 용액으로 질량 세포분석기를 적절하게 세척하면 튜브 및 기계의 다른 부분에 대한 금속 흡수 수준이 감소하여 이 그래프에서 볼 수 있는 배경을 줄이는 데 도움이 됩니다. 마젠타 선으로 표시되는 부적절한 튜닝은 짙은 파란색 선에서 입증된 바와 같이 적절하게 조정된 샘플에 비해 m 플러스 16에서 산화물 형성을 크게 증가시켰습니다. 이는 m에서 원하는 신호를 약간 감소시키고 m에 16을 더한 값에서 원치 않는 배경 간섭을 크게 증가시키는 효과가 있습니다.

Milli Q 물에서 시료를 적절하게 세척하고 적절하게 희석하면 최소한의 배경과 세포의 최대 해상도를 보장하는 동시에 속도에 대한 요구의 균형을 맞출 수 있습니다. 본 실험에서 보여진 대표적인 실험의 데이터와 유사하게, 자연적 존재량 란타늄 1 39 ODIUM 1 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 및 LUTETIUM 1 75를 함유하는 폴리스티렌 비드를 세포 획득 모드에서 실행하였다. 데이터는 FlowJo를 사용하여 분석되었으며 깨진 구슬의 파편은 게이트를 제거했습니다.

적절하게 조정된 샘플은 짙은 파란색 선으로 표시된 대로 분당 0.74리터의 유속으로 결정되었습니다. 낮은 유속에서보다 이 유속에서 더 높은 신호 강도가 관찰되었으며, 적절하게 조정된 이 샘플은 부적절하게 조정된 신호보다 M 금속 질량에서 더 높은 신호와 m에 16개의 산화물 질량을 더한 더 적은 신호를 갖는 것으로 관찰되었습니다. M Mass LANTHANUM 1 39 및 THULIUM 1 69에서의 신호 클로즈업이 여기에 나와 있습니다.

보충 가스 유량은 툴륨 1 69 신호 강도보다 LANTHANUM 1 39 신호 강도에 더 큰 영향을 미칩니다. 이 그래프는 각각 LANTHANUM 1 39 더하기 oh 16 및 툴륨 1 69 플러스 oh 16 산화물에 해당하는 m 플러스 16 산화물 질량 1 , 55 및 180 5 에서의 신호를 보여줍니다. 보충 가스 유속은 란탄 1 39가 툴륨 1 69보다 더 쉽게 산화되기 때문에 질량 1 55 신호보다 질량 1 55 신호를 훨씬 더 증가시킵니다.

보충 가스 유량의 함수로 표시되는 m 및 m 플러스 16 신호 강도가 여기에 설명되어 있습니다. 채워진 아이콘은 질량 M을 나타내고, 열린 아이콘은 질량 M에 16을 더한 값을 나타내지만, 선의 색상은 각각의 질량 M에 해당합니다.LANTHANUM 1 39 및 가격 ODIUM 1 41 신호 강도는 보충 가스 유량의 영향을 많이 받습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 CyTOF를 시작하는 방법을 잘 이해해야 합니다., 적절하게 조정한 다음 샘플을 실행하고, 마지막으로 매일 실행이 끝날 때 기계를 적절하게 청소하고 종료합니다.