Name: 가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 학습하세요 측두엽 충격 손상 모델을 이용하여 생쥐 해마 회로의 기능 변화를 조사하는 방법을. 전기생리학 기법과 행동 평가를 통해 손상 후 시냅스 균형 변화를 분석하고 치료 전략 개발에 필요한 기전을 규명합니다.

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저자는 자신의 기술 지원을 부르주아 더러 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 R01HD059288과 R01NS069629 국립 연구소에 의해 자금을 지원했다.

1. 측면 유체 타악기 상해 <ol><li> 케타민과 xylazine 주어진 intraperitoneally의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취시키다. 그런 다음 요오드 스크럽을 사용하여 절개에 대한 마우스의 머리를 준비합니다. </li><li> 3mm (직경 외) trephine을 사용하여 오른쪽 정수리 영역에 craniectomy을 수행합니다. </li><li> cyanoarylate 및 치과 아크릴을 사용하여 craniectomy 통해 보안 Luer-LOC 바늘 허브 (직경 3mm 내부). </li><li> 24 시간 후, 흡입을 통해 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취시키다. </li><li> 일단 정상적인 호흡 이력서,하지만 마우스가 자극에 민감되기 전에, 유체 타악 부상 장치를 통해 두개골에 염분의 20 밀리 초 펄스를 제공합니다. </li><li> 즉시 부상 후 허브를 제거 isoflurane을 사용하여 마우스를 reanaesthetize하고, 두피가 폐쇄 봉합 해. 샴 운영하는 제어 단계 1.5 생략과 동일한 절차를 받게 될 것입니다. </li></ol> 2. 행동 분석 - 에어컨, 두려움 Response <ol><li> 에어컨, 공포 반응 (CFR) 교육하기 전에 연속 2 일에 쥐를 처리합니다. </li><li> 2 초에 1.5 mA 바닥 충격을 관리하기 전에 3 분을위한 컨디셔닝 실에서 개최 마우스. 추가 30 초에 챔버에 마우스를 둡니다. </li><li> 지연 기간 (보통 24 시간) 후, 5 분을위한 시설 챔버에 마우스를 반환합니다. 5 초 간격으로 얼어 평가합니다. 분석의 경우 뇌 부상당한 마우스와 사기로 작동하는 컨트롤에서 두 집단에서 시간 냉동의 상대적 양을 비교로 구성되어 있습니다. 낮은 냉동 요금은 (제어에 비해) 컨텍스트 및 바닥 충격, 메모리 장애 및인지 장애의 표시 사이의 연결을 유지하는 무능력을 나타냅니다. </li></ol> 3. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비 * 참고 : 벨 항아리를 사용하여 Anesthetization 만 터미널 절차 (예 : 여기에 설명 된 뇌 해부 등)에 구현 될 수있다. <ol><li> 7 일 후부상, 인공 대뇌 척수 (aCSF) 250 ML의 자당 절단 솔루션 1 L를합니다. </li><li> 뇌 슬라이스 준비하는 동안 사용되는 모든 장비와 솔루션은 얼음처럼 차가워 있는지 확인하기 위해 후한 얼음을 사용합니다. </li><li> isoflurane 사용 마우스를 마취시키다. 신속하고 부드럽게 자당의 마우스와 곳에서 뇌를 제거합니다. </li><li> 한천 블록 앞의 superglue의 드롭 표면을 절삭에 트림 뇌 및 장소. </li><li> 350 μm 두께 코로나 조각을 잘라, 당신은 손상 hippocampal 회로와 4 ~ 5 조각을 얻을 수 있습니다. </li><li> 37 적어도 1 시간에 조각을 품어 ° C. </li></ol> 4. 세포 필드 잠재적 기록 <ol><li> 수직 풀러를 사용하여 2-5 MΩs에 붕규산 유리 전극을 당겨. </li><li> 전극 홀더로 챔버 및 삽입 전극의 장소 슬라이스. </li><li> 예를 perforant 경로 나 Schaffer 민간인 피해 등의 axonal 기관의 슬라이스에 자극 전극을 낮 춥니 다. 낮은 기록 전극모니터링 출력 성분이 전극이 동일한 Z-레벨 (깊이)에 있는지 확인하기 위해 동안 들었어요. 최대 응답이 자극을 현재의 수준을 일정하게 유지, 달성 될 때, 전극은 동일한 Z-레벨에 있습니다. </li><li> presynaptic 섬유 발리, 현장 세포 postsynaptic 잠재력 (fEPSP) 및 postsynaptic 인구 증가 : 결과 추적은 세 가지 구성 요소로 구성되어 있습니다. 구성 요소 분석을 더 어렵게 만드는 몇 가지 준비에 시간적 겹칠 수도 있습니다. 응답이 presynaptic 또는 postsynaptic 여부를 사이에 모호가있는 경우, APV 및 CNQX는 흥분성의 전송을 차단하는 목욕에 추가 될 수 있으며, 남아있는 모든 신호는 presynaptic 기원이 될 것입니다. </li><li> 입력 / 출력 곡선, 짝 펄스 녹음, 및 장기 소성 실험 : 자극 프로토콜은 세 가지 실험 유형을 생산 다릅니다. 분석은 일반적으로 뇌 부상당한 마우스 및 사기 모두에서 fEPSP의 기울기를 비교 측정으로 구성되어 있습니다섬유 일제 사격을 측정하여 입력 강도에 대한 통제, 제어를 운영. </li></ol> 5. 시각화 패치 - 클램프 녹음 <ol><li> 이전에 4.2 단계로 위의 설명 된대로 기록하는 슬라이스, 전극 및 장비를 준비합니다. </li><li> 겉으로 만 가까이 세포와 조직에 세포에게 깊은 80 μm을 고려하는 것은 죽은 및 / 될 것입니다 또는 연결을 감소했습니다. 이 조직을 통해 아래로 이동로가 막힌되지 않도록 할 수있는 전극에 긍정적 인 압력 셀을 접근한다. 전극이 부드럽게 셀 전극과 플라즈마 막 사이에 &#39;gigaseal&#39;을 만들기 위해 부정적인 압력을 적용 감동합니다. </li><li> 전극 아래 plama 막 파열하기 위해에 부정적인 압력의 짧은 폭발을 적용하고 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다. </li><li> 증폭기를 사용하여 정전 용량 과도를 제거하고 일련의 저항을 보상. 세포의 일련의 저항에 대한 보상은 유지를 위해 필수적입니다측정을 ccurate. </li><li> 단세포 녹음의 두 모드는 수행 할 수 있습니다 : 현재 클램프 (측정 막 전압) 및 전압 클램프를 (막에서 이온 채널을 통해 현재의 전달을 측정). 분석의 가능한 유형은 여러이지만 우리의 경우 대부분 뇌 부상당한 마우스와 사기로 작동하는 컨트롤 모두에서 자연 신경 전류의 속도와 크기를 정량화 biophysical 분석으로 구성되어 있습니다. </li></ol> 6. 전압 민감한 염료 이미징 (VSD) <ol><li> 이전에 4.2 단계로 위의 설명 된대로 기록하는 조각과 장비를 준비합니다. </li><li> 50 μl 에탄올로 한 MG 디-3-ANEPPDHQ을 혼합하여 염료 재고를 준비, 호일 포장 튜브, -20 ° C.에 상점에 2 μl aliquots을 투여 aCSF에 1:200을 diluting하여 매일 염료 솔루션을 작동합니다. </li><li> 필터 종이를 moistened aCSF에 조각을 배양하고 16 분을위한 염료의 90 μl로 얼룩, 인터페이스 기록 챔버에서 aCSF 및 장소와 린스. </li><li> 빛 stimulatio을 조정응답까지 N 강도는 카메라 범위의 중간에 중점을두고 있습니다. 이미지는 일반적으로 초당 500-1,000 프레임의 속도로 획득합니다. </li><li> 초기 빠른 photobleaching이 안정 할 수 있도록 전기 자극을하기 전에 가벼운 자극을 200 밀리 초에 대한 트리거 셔터. 전기 사이의 대체 수집 재판은 비 자극 배경 나중에 빼기를 허용하도록, 자극, 비 전기 자극. 전에 셔터를 열어에 기록 휴식 광도 (셔터 폐쇄와 형광 읽기). 각 VSD 재판은 형광 판독 시간 &quot;영화&quot;로 Y 픽셀 x 픽셀됩니다. 기록 10 - 각 시험 조건 12 VSD 재판. </li><li> 모든 측정은 내부 픽셀 사전 전기적 자극 표준화 된 형광 변화에 수행됩니다,으로 계산됩니다 DF / F는 다음과 같습니다 VSD 원시 취득 시험에서 휴식 빛 강도를 뺍니다. 각 시험의 각 픽셀은 해당에 대한 사전 전기적 자극 평균 값에 따라 정상화평가하고, 통일을 차감. 전기적 자극 및 비 전기 자극 시험 모두에 대해이 작업을 수행합니다. 비 전기적 자극 시험에서 평균 &#39;의 배경 형광 &quot;평가판을 만들고, 전기 자극 실험에서이 배경 재판을 뺍니다. 12 등 시련도 보통 공간과 잡음 비율로 신호를 개선하기 위해 시간에 제외됩니다 - 자세한 분석은 일반적으로 10 평균 수행됩니다. </li></ol> 7. 생물 화학 분석에 대한 지역 Dissections <ol><li> 이전에 설명 된대로 마우스의 뇌를 제거합니다. </li><li> 조직 헬리콥터를 사용하여 슬라이스를 준비합니다. </li><li> 섹션 평면 배열, 면적 CA1과 DG를 microdissect. </li><li> 용해 버퍼 포함하는 프로테아제 억제제에 즉시 잠그다. -80에서 액체 질소와 저장소에 고정 ° C. </li></ol> 8. 대표 결과 우리 실험은 일반적으로 예상을 확인하는 행동 데이터로 시작뇌 부상당한 쥐에 존재 에드인지 적자. 이 신뢰할 수 있으며, 하나의 교육 세션을 한 테스트 세션을 필요로하는 hippocampal 부양 행동이기 때문에 우리는 문맥이 설치된 두려움 응답 테스트를 사용합니다. 그림 2에 묘사 된 데이터는 anterograde 메모리를 측정 할 수 행동 테스트를 의미하며 훈련 세션이 부상하기 전에 수행하는 경우 그러나, 테스트도 역행 메모리를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 필드 흥분성의 postsynaptic 잠재력은 (fEPSPs) 세포의 큰 인구 (그림 3A)의 순 신경 효능을 결정하기 위해 측정합니다. 우리는 일반적으로 자극 패턴의 세 가지 다른 종류의 자신의 결과와 결론을 affording 각을 채용하고 있습니다. 첫째, 일련의 단계를 통해 자극의 강도를 높임으로써, 우리는 입 / 출력 곡선을 (그림 3B / C) 만들 수 있습니다. 다음, 별도의 같은 강도의 두 stimulations를 제공함으로써. 또한, 우리는 자주 장기 potentiation (LTP) 실험을 수행, 우리가 신경 소포 릴리스 확률 잠재적 인 변경을 조사 약간의 지연 (보통 50 밀리 초)로 D. 같은 강도의 기준 응답, 간단한 고주파 자극을 (보통 100Hz) 설립 후 정상적인 자극이 재개 될 때 potentiated 신경 반응에 이르게 세포 층계를 발생 전달됩니다. 전체 셀에서 전기 활동 세포는 두 가지 모드로 기록 할 수 패치 - 고정. 전압 클램프 모드에서 실험은 앰프와 관련된 컴퓨터 소프트웨어를 통해, 욕실에 대한 언급 패치 - 고정 세포의 막 전압을 제어합니다. 이 경우 postsynaptic 이벤트를 중재 전류가 활성화 postsynaptic 수용체와 기공을 갖는 신경 전달 물질 농도 (그림 4A)의 presynaptic 출시 주파수에 대한 정보, 번호를 제공하는 기록됩니다. 현재 클램프 모드 실험에서조작 전류 주입하고 전압 응답을 측정합니다. 여기에는 액션 잠재적 임계 값과 반 폭으로 행동 잠재력의 특성을 결정하는 데 유용 할 수 있습니다. 이러한 특성은 흥분성의 또는 행동 잠재력 발사 패턴 (그림 4B)을 기반으로 억제 등의 뉴런의 기능 분류에 대한 수 있습니다. 세포의 신원을 확인하기 위해 우리는 녹화 후 루시퍼 노란색과 수지상 쪽의 유무에 의해 시각적으로 확인 된 ID로 셀을 작성하는 것이 좋습니다. (그림 4C, D). 막 전압의 변화를 측정하기 위해 전압에 민감한 염료를 사용하여 실험의 결과의 예는 그림 5에 그려져 있습니다. 이 경우, 자극 전극은 Schaffer의 담보 경로에 배치되어 지역 CA1의 결과 neuronal 활동을 분석하고 있습니다. 전압에 민감한 염료는 막 전압의 절대 값을보고, 오히려 t되지 않습니다그는 자극없이 기본 상태에서 전압으로 변경합니다. 그러나, 두 조건 (예를 들면 사기로 작동하는 대 뇌 부상) 비교 분석은 fEPSPs 또는 전체 셀 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 측정 할 수없는 생리적 변경의 spatiotemporal 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig1.jpg" /> 1 그림. Hippocampal 회로 다이어그램. 해마를 통해 수평 절을 참조하십시오. 해마를 통해 주요 경로는 노란색으로 표시됩니다. 이가있는 이랑의 과립 세포의 수석과 시냅스를 형성하는 이가있는 이랑에 perforant 경로를 통해 entorhinal 피질 프로젝트에서 뉴런의 axons. 그들은 CA3 뉴런의 수석과 시냅스를 형성 CA3에 이끼 ​​섬유 경로를 통해 과립 세포 axons 프로젝트. dendrit로 Schaffer의 담보 경로를 통해 CA3 뉴런 프로젝트의 axonsCA1 피라미드 세포의 에스. CA1 피라미드 세포의 axons은 subiculum를 통해 해마에서 프로젝트. 참고 : 또한 fimbria를 통해 contralateral 해마에 투영 CA3 피라미드 세포 축삭의 민간인 피해는 아닙니다. (CA1 : Cornu Ammonis 1, CA2 : Cornu Ammonis 2, CA3 : Cornu Ammonis 3, DG : 이가있는 이랑, 점선은 실선은 구조 경계를 나타냅니다, 전지 본체 레이어를 나타냅니다.) <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig2.jpg" /> 그림 2. 대표 행동 데이터 A :. 뇌 부상당한 마우스 (FPI)와 에어컨, 두려움 응답 패러다임의 (가짜) 컨트롤 사기로 작동 사이의 동결 속도의 차이를 묘사 행동 데이터입니다. 교육 후 24 시간을 발생 시험 기간으로, 6 일 일 다음과 같은 부상에 발생했습니다. (** 존재라는 증거 P &lt;0.01). <img alt="그림 3" fo:content-width = &quot;5in&quot;강한 : SRC = SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4411/4411fig3.jpg&quot;/ &quot;를 / files/ftp_upload/4411/4411fig3highres.jpg&quot;&gt; 그림 3. 대표 세포 녹화 데이터 A :. 현장 흥분성의 시냅스 후 전위 (fEPSP) 영역 CA1에서 녹음의 예라고 할 수 있습니다. 제 1 하향 편향은 presynaptic 섬유 발리, 마지막으로 fEPSP 다음에 자극의 유물입니다. B : 입력 / 출력 곡선은 CA1 다음과 같은 유체 타악 상해 (FPI)의 순 신경 효능 감소 묘사. C : 입력 / 출력 곡선 FPI 다음과 같은 이가있는 이랑의 순 신경 효능의 증가 (DG)을 묘사. (* 존재라는 증거 P는 &lt;0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig3large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig4.jpg" /> 4 그림. 대표 전체 세포 패치 - 클램프 데이터 A :. 자연의 예CA1 피라미드 세포에서 postsynaptic 전류 (sEPSC)를 흥분성의. B : CA1 피라미드 세포 (상단 추적)과 빠른 솟고 CA1 interneuron (하단 추적)에서 작업을 잠재 기차의 예. C : 루시퍼 노란색의 예 CA1 억제 interneuron을 가득 채웠다. 수지상 쪽 (위쪽 패널)의 부재를 확인합니다. D : 루시퍼 노란색의 예 CA1 피라미드 뉴런을 가득 채웠다. 수지상 쪽 (위쪽 패널)의 존재를 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig5.jpg" /> 그림 5. 대표 전압 민감한 염료 영상 자료를 A :. 해부학을 표시 할 표시 마우스 코로나 hippocampal 슬라이스. (DG : 이가있는 이랑, CA1 : Cornu Ammonis 1) B : 수입 성의 Schaffer의 부수적 인 자극 후 지역 CA1 14 밀리 초를에 흥분성의 활동을 나타내는 빨간색 픽셀 노란색. 에서 레드노란색은 낮은,하지만 여전히 상당한 탈분극을 나타내며 더 탈분극을 dicates. C : 지역 CA1의 억제 활동의 사이트를 대표하는 블루 픽셀 56 밀리 초는 B.의 어두운 파란색에 표시된 동일한 수입 성의 Schaffer의 부수적 인 자극 후 더 hyperpolarization을 나타냅니다.

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</ol>

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위에서 설명한 각 기술은 관찰 된 행동 적자의 원인이 기본 메커니즘의 더 큰 이해에 기여하고있다. 각 방법에서 얻은 고유 한 정보를 결합하여 우리가 더 정밀도와 생물학적 메커니즘을 검토 할 수 있습니다. 측정 fEPSPs는 뉴런의 대형 spatially 정의 영역의 순 신경 효능을 정량화하는 데 유용합니다. 또한 시냅스 소성를 받아야하는 세포의 그룹의 가능성에 대한 정보를 제공 할 수 신경은 학습과 기억의 상관 관계. 이 기술적으로 간단하고 회로 기능의 폭 넓은 측정에 대한 정보를 제공하는이 electrophysiological 분석의 유용한 첫번째 지점입니다. fEPSPs는 대조적으로, 전체 세포 패치 - 클램프 녹음은 단일 셀의 electrophysiological 매개 변수에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 그것은 수많은 다른 매개 변수와 일반 등 매우 다양한 기술입니다시냅스 입력의 에스는 녹화 조건 (전압을 유지하는 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 200B 앰프를 Axopatch </td><td> 분자 장치 </td><td> AXOPATCH 200B </td><td> 패치 - 클램프 장비 </td></tr><tr><td> Digidata 1322A 디지타이저 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> 패치 - 클램프 장비 </td></tr><tr><td> MP-225 micromanipulator </td><td> 셔터 </td><td> MP-225 </td><td> 패치 - 클램프 장비 </td></tr><tr><td> DMLFSA 현미경 </td><td> Leica </td><td></td><td> 패치 - 클램프 장비 </td></tr><tr><td> 700B 앰프를 Multiclamp </td><td> 분자 장치 </td><td> 700B를 MULTICLAMP </td><td> 다목적 (필드)도구 </td></tr><tr><td> Digidata 1440 디지타이저 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> Multipurpos (필드) 장비 </td></tr><tr><td> MPC-200 micromanipulator </td><td> 셔터 </td><td> MPC-200 </td><td> 다목적 (필드) 장비 </td></tr><tr><td> BX51WI 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX51WI </td><td> 다목적 (필드) 장비 </td></tr><tr><td> 900A 앰프를 Axoclamp </td><td> 분자 장치 </td><td> 900A를 AXOCLAMP </td><td> VSD 장비 </td></tr><tr><td> Digidata 1322 디지타이저 </td><td> 분자 장치 </td><td></td><td> VSD 장비 </td></tr><tr><td> Redshirt CCD-SMQ 카메라 </td><td> Redshirt </td><td> NCS01 </td><td> VSD 장비 </td></tr><tr><td> VT 1200 년대 Vibratome </td><td> Leica </td> &lt;TD&gt; 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> P-30 전극 풀러 </td><td> 셔터 </td><td> P-30 / P </td><td></td></tr><tr><td> 완료 프로테아제 억제제 </td><td> 로슈 </td><td> 11697498001 </td><td></td></tr></tbody></table>

가벼운 외상성 뇌 손상 후 hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

외상성 뇌 손상은 (외상성 뇌 손상) 매년 미국에서 이상 1백70만명을 괴롭히는, 심지어 가벼운 외상성 뇌 손상은 영구적 신경 장애 1 될 수 있습니다. 외상성 뇌 손상 생존자, 메모리 결손 및 발작 임계 값의 감소에 의해 경험 두 보급 및 비활성화 증상은 외상성 뇌 손상 유발 hippocampal 장애 2,3에 의해 중재 할 생각입니다. hippocampal 회로 기능이 나쁜 쥐 외상성 뇌 손상 후 행동에 미치는 영향에 대해 변경된 보여하기 위해, 우리는 측면 유체 타악 상해, neuronal 세포 손실, gliosis, 그리고 이온 섭동 4를 포함한 인간의 외상성 뇌 손상의 여러 기능을 재현 외상성 뇌 손상의 일반적으로 사용되는 동물 모델을 채용 - 6. 여기 외상성 뇌 손상 유발 hippocampal 장애를 조사하는 조합 방법을 보여줍니다. 우리 접근 방식은 분석하기 위해 동물의 행동과 생화학 분석과 함께 여러 예를 생체 생리 기술을 통합해마의 포스트 외상성 뇌 손상 변경됩니다. 우리는 외상성 뇌 손상 후인지 장애를 평가하기 위해 행동 분석과 함께 실험 부상 패러다임으로 시작합니다. 전체 세포 패치 - 클램핑을 시각화 세포 분야 잠재력 녹음 및 전압에 민감한 염료 기록 : 다음, 우리는 세 가지 예를 생체 녹음 기술을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 지역 neurochemical과 신진 대사 변경 후 외상성 뇌 손상에 대한 자세한 분석을 위해 유용 할 수 있습니다 해마의 하위 지역을 해부하는 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 외상성 뇌 손상 다음과 hippocampal 회로의 변경을 검토하고 이가있는 이랑과 해마의 CA1 하위 지역 (그림 1 참조)에서 발생하는 네트워크 회로 함수에서 반대 변경 사항을 조사하는 데 사용되었습니다. 각 하위 지역의 포스트 외상성 뇌 손상 변경 사항을 분석 할 수있는 능력은 외상성 뇌 손상 유발 행동 및인지 D에 참여하고있는 기본 메커니즘을 이해하는 데에 매우 중요합니다eficits. 여기에 설명 된 다원적 인 측면의 시스템은 조사가 질병 상태 (외상성 뇌 손상이 경우)에 의해 유도 현상론의 과거 특성을 밀어과 외상성 뇌 손상과 관련된 관찰 된 병리에 대한 책임 메커니즘을 확인할 수 있습니다.

hippocampal 회로에 대한 기능 변경 사항을 조사에 대한 다원적 인 측면의 접근이 설명되어 있습니다. Electrophysiological 기술은 부상 프로토콜, 행동 테스트 및 지역 해부 방법과 함께 설명되어 있습니다. 이러한 기술의 결합은 다른 뇌 영역과 과학 질문에 대해서도 이와 유사한 방식으로 적용 할 수 있습니다.

가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

외상성 뇌손상(TBI)은 미국에서 매년 170만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치며, 경미한 외상성 뇌손상조차 지속적인 신경학적...

본 실험의 전반적인 목적은 경증 외상성 뇌손상 실험 모델에 의해 영향을 받은 뇌 영역의 네트워크 기능 변화를 조사하는 것입니다. 실험은 인간의 경증 외상성 뇌손상의 병리와 증상을 모두 모방하는 측면 유체 충격 손상을 마우스에 가하는 것으로 시작합니다. 두 번째 단계로, 뇌손상으로 유도된 인지 장애를 평가하기 위해 해마 의존적 행동인 맥락적 조건 공포 반응을 이용합니다. 다음으로, 세포 외 및 세포 내 기록과 전압 민감성 염료를 사용하여 흥분성 및 억제성 시냅스 전달 사이의 시냅스 균형에서 나타나는 지역 특이적 변화를 결정합니다. 관심 영역인 해마에서, 설명된 세 가지 기록 기술을 통해 대조군 마우스와 뇌손상 마우스 간의 차이를 기반으로 해마 내 하위 영역 특이적인 순 시냅스 효능 변화가 나타납니다.이 접근 방식의 주요 장점은 병리학적 상태와 잠재적 치료제 모두가 여러 생리학적 규모에 미치는 영향을 식별할 수 있어, 이러한 회로 결손에 대해 더 일관된 그림을 그릴 수 있다는 점입니다. 이 방법은 특히 어떤 뉴런이 손상에 가장 취약하며, 결과적으로 손상 후 해마 기능 장애에 가장 크게 기여하는지와 같이 외상성 뇌 손상에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 먼저 기저 기전을 규명하고, 이후 뇌 손상으로 인해 손상된 영역의 생리학적 상태를 복원하기 위한 잠재적 치료법을 개발할 수 있게 함으로써 외상성 뇌 손상 치료로까지 그 영향력을 확장합니다.이 절차에서는 케타민과 자일라진 혼합물을 복강 내 투여하여 마우스를 마취합니다. 그다음, 외경 3mm의 트레판을 사용하여 오른쪽 두정엽 부위에 C자형 두개골 절제술(C craniectomy)을 수행합니다. 이어서 시아노아크릴레이트와 치과용 아크릴을 사용하여 C자형 두개골 절제 부위에 루어 락 바늘 허브를 고정합니다.24시간 후, 이소플루란(isoflurane) 흡입 마취를 통해 마우스를 마취합니다. 정상적인 호흡이 회복되었으나 마우스가 자극에 민감해지기 전, 유체 충격 손상 장치(fluid percussion injury device)를 사용하여 두개골에 20밀리초(millisecond)의 생리식염수 펄스를 가합니다. 손상 직후 허브를 제거합니다. 이어서 이소플루란으로 마우스를 다시 마취하고 두피를 봉합합니다.조건성 공포 반응 훈련 전 이틀 연속으로 마우스를 핸들링합니다. 훈련 당일, 마우스를 조건화 챔버에 3분 동안 둔 후 1.5 amp 바닥 전기 자극을 2초 동안 가합니다. 그 후 마우스를 챔버에 30초 동안 더 둔 다음 꺼냅니다.24시간의 지연 시간 후, 마우스를 조건화 챔버로 다시 옮겨 5분간 두고, 손상 7일 후에 5초 간격으로 프리징(freezing) 정도를 평가합니다. 인공 뇌척수액 1L와 자당 절단 용액 250mL를 준비합니다. 뇌 절편 제작 과정에서 사용되는 모든 기구와 용액은 얼음을 사용하여 차갑게 유지해야 합니다.이소플루레인을 사용하여 마우스를 빠르고 부드럽게 마취합니다. 마우스에서 뇌를 적출하여 수크로스 용액에 넣습니다. 그다음, 뇌를 트리밍합니다.갓 절단된 뇌의 보존 표면을 아가 블록 앞의 Vibram 스테이지 위에 슈퍼글루 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 놓습니다. 350 micron 두께의 관상면 절편을 자릅니다. 손상되지 않은 해마 회로가 포함된 절편을 4~5개 얻을 수 있을 것입니다.그 후 슬라이스를 37 °C에서 최소 1시간 동안 배양하십시오. 이제 2~5 MΩ의 붕규산 유리 전극을 준비합니다. 수직 풀러(vertical puller)를 사용하여 슬라이스를 챔버로 옮긴 다음, 세포 외 전위 기록을 위해 전극 홀더에 전극을 배치하십시오.자극 전극을 슬라이스 상의 Perent 경로 또는 Shafer 측지(collaterals)와 같은 축삭로 위에 배치합니다. 그런 다음 기록 전극을 슬라이스 내부로 계속 내립니다. 다음으로, 단일 전기 펄스를 가하여 장외 포스트시냅스 전위(field extracellular postsynaptic potential)를 유도합니다.최대 반응이 나타날 때까지 자극 사이에 기록 전극의 깊이를 조절하며 자극을 계속하십시오. 이는 전극들이 동일한 Z-레벨에 위치해 있음을 나타냅니다. 분석은 일반적으로 뇌 손상 마우스와 가짜 수술 마우스의 fiber volley 진폭을 비교하여 시냅스 전 활성화를 평가하고, F-E-P-S-P의 기울기를 비교하여 시냅스 후 활성화를 평가하는 측정으로 구성됩니다. 패치 클램프 기록을 위해 다시 슬라이스를 챔버로 옮기고 기록 전극을 내리십시오.전극을 조직 속으로 내릴 때 기록 전극이 막히지 않도록 전극에 양압을 가하며 세포에 접근합니다. 전극이 세포에 부드럽게 닿으면, 전극과 세포막 사이에 기가실(giga seal)을 형성하기 위해 음압을 가합니다. 그다음, 짧은 간격으로 음압을 가하여 세포막을 파열시킴으로써 whole cell 구성을 완성합니다.증폭기를 사용하여 정전 용량 과도 현상을 제거하고 직렬 저항을 보정하여 정확한 측정을 보장하십시오. 그런 다음 뇌 손상 마우스와 가짜 수술 대조군 모두에서 자발적 시냅스 전류의 빈도와 크기를 정량화하고 비교하십시오. 이 단계에서는 1mg의 dye three onap DHQ를 50µL의 에탄올에 혼합하여 염료 스톡을 준비하십시오.호일로 감싼 튜브에 2 µL씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 매일 A CSF를 사용하여 염료 작업 용액을 1:200 비율로 희석하여 조제하십시오. 그런 다음 A CSF로 적신 여과지에 절편을 올려 배양하고, 90 µL의 염료로 16분 동안 염색하십시오.그 후, 이를 세척하여 인터페이스 기록 챔버에 넣습니다. 세포외 전위 기록법(extracellular field potential recording)에서 설명한 대로 자극 및 기록 전극을 배치합니다.응답이 카메라 중앙에 위치할 때까지 광자극 강도를 조정합니다. 범위 이미지는 일반적으로 초당 500에서 1000 프레임의 속도로 획득합니다. 초기 급격한 광퇴색(photo bleaching)이 안정화될 수 있도록 전기 자극 200 milliseconds 전에 광자극 셔터를 작동시킵니다.시도 사이에 10초 동안 휴지기를 둡니다. 나중에 비전기 자극 배경값을 뺄 수 있도록 전기 자극 시도와 비전기 자극 시도를 교대로 수행하십시오. 그런 다음 셔터를 열기 전의 휴지기 광강도를 기록하십시오.각 VSD 실험은 형광 측정값의 동영상으로 분석할 수 있습니다. 즉, 각 실험은 시간의 흐름에 따른 X 및 Y 공간 차원의 값을 가진 3차원 데이터 행렬입니다. 각 테스트 조건에서 10~12회의 VSD 실험을 기록하고, 함께 제공된 원고에 따라 픽셀 내 조명 전 정규화된 형광 변화를 계산하십시오.이 그림은 CA1 영역에서의 f-EPSP 기록 예시를 보여줍니다. 첫 번째 하향 굴곡은 자극 아티팩트이며, 이어서 시냅스 전 섬유 발리(presynaptic fiber volley)와 f-EPSP가 나타납니다. 여기는 유체 충격 손상 이후 CA1의 순 시냅스 효능 감소를 나타내는 입력-출력 곡선입니다.여기 FPI 이후 치상회에서 순 시냅스 효율의 증가를 나타내는 입력-출력 곡선이 있습니다. 여기 CA1 피라미드 세포의 자발적 흥분성 포스트시냅스 전류의 예가 제시되어 있습니다. 여기 CA1 피라미드 세포와 빠른 스파이킹 CA1 인터뉴런의 활동 전위 열의 예가 있습니다.이것은 수지상 돌기 가시(dendritic spines)가 없는 Lucifer yellow로 충전된 CA1 억제성 인터뉴런이며, 여기는 수지상 돌기 가시가 있는 Lucifer yellow로 충전된 CA1 피라미드 뉴런입니다. 이 도식들은 마우스의 관상면 해마 절편을 보여줍니다. 노란색에서 빨간색으로 표시된 픽셀은 구심성 Schaeffer collateral 자극 후 14ms 시점의 CA1 영역 내 흥분성 활성도를 나타냅니다.빨간색은 더 강한 탈분극을 나타내며, 노란색은 그보다 약하지만 여전히 유의미한 탈분극을 나타냅니다. 파란색 픽셀은 동일한 구심성 샤퍼 측지(Afferent Shafer collateral) 자극 후 56밀리초 시점의 area ca 1 내 억제성 활성 부위를 나타내며, 진한 파란색일수록 더 강한 과분극을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 회로 기능 장애와 관련된 임상적으로 유의미한 병리적 상태를 해결하기 위해 여러 ex vivo 기록 기법을 어떻게 결합하는지 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Macheda, T., et. al. 마우스의 경미한 외상성 뇌 손상의 전자기 제어 폐쇄 머리 모델. J. Vis. Exp. (2022) 이 영상은 입체 프레임을 사용하여 마우스 모델에서 폐쇄 머리 부상을 유도하는 절차를 보여줍니다. 통제된 충격은 경미한 외상성 뇌 손상을 복제하여 연구원들은 부상 후 반사 신경과 행동을 측정하여 신경학적 영향과 회복을 연구할 수 있습니다.

마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상 유도

출처: Braeckman, K., et. al. 경미한 외상성 뇌 손상을 입은 쥐의 해마에서 고급 확산 영상. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 확산 가중 이미징을 사용하여 평가하는 방법을 보여줍니다. 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI) 후 쥐 해마의 미세 구조 변화, 정확한 MRI 스캔 및 확산 분석을 통한 축삭 손상 강조.

경미한 외상성 뇌 손상을 입은 쥐 해마의 확산 가중 이미징

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

우리는 유전자와 예측에 관한 분석에 대 한 서로 다른 뇌 영역에서 뚜렷한 세포 인구의 샘플을 얻기 위해 레이저 캡처 서의 사용을 설명 합니다. 이 기술은 쥐 두뇌의 특정 지역에서 외상 성 뇌 손상의 차동 효과의 연구를 수 있습니다.

외상 성 부상에 의해 영향을 하는 뇌 영역의 정위 적 아틀라스 유도 레이저 캡처 기정

여기에 제시된 프로토콜은 직감 미생물군유전체 분석을 위한 케이쿰 함량의 수집에 이어 측면 유체 타악기 장치를 사용하여 확산 외상성 뇌 손상을 유도하는 프로토콜이다.

쥐에서 외상성 뇌 손상 후 Caecum Microbiota에서 변경 을 조사

이 절차의 전반적인 목표는 가벼운 외상성 뇌 손상을 가진 쥐에 해마의 양적 미세 구조 정보를 얻는 것입니다. 이것은 파라메트릭 확산지도의 고급 확산 가중 자기 공명 영상 프로토콜 및 관심 영역 기반 분석을 사용하여 수행됩니다.

가벼운 외상성 뇌 손상을 가진 쥐의 해마에 있는 향상된 확산 화상 진찰

우리는 여기에 설치류를위한 폭발파 모델의 프로토콜을 제시하여 경증에서 중등도의 외상성 뇌 손상의 신경 생물학적 및 병리 생리학적 효과를 조사합니다. 우리는 압력 센서가 장착 된 가스 구동식 벤치 탑 설정을 구축하여 폭발로 인한 경증에서 중등도의 외상성 뇌 손상을 안정적이고 재현 가능한 생성이 가능하도록했습니다.

설치류의 폐쇄 머리 경미한 외상성 뇌 손상의 전임상 평가를위한 저강도 폭발파 모델

이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

여기에서는 해마의 시냅스 가소성에 대한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(r-mTBI)의 영향을 조사하기 위해 깨어 있는 폐쇄두부 손상 모델을 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 모델은 환자에서 r-mTBI의 중요한 특징을 복제하고 시험관 내 전기생리학과 함께 사용됩니다.

경미한 외상성 뇌 손상의 깨어 있는 폐쇄 두부 손상 모델을 사용하여 시냅스 가소성의 변화 평가

이 프로토콜은 폐쇄성 두부 손상(CHI) 방법을 통해 유도된 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상(rmTBI)의 수정된 마우스 모델을 제시합니다. 이 접근법은 두개골 창과 유체 타악기를 사용하여 수막 노출로 인해 일반적으로 발생하는 염증을 줄이고 설치류의 rmTBI 모델링에서 재현성 및 정확도를 향상시킵니다.

얇아진 두개골 창과 유체 타악기를 통합한 반복적인 경미한 외상성 뇌 손상의 수정된 마우스 모델

본 연구에서는 단순하고 가벼운 외상성 뇌 손상의 신경영상 결과를 급성기 및 장기 뇌 위축에서 보존된 뇌 구조와 함께 복제하는 폐쇄두부 손상 동물 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시한다. 종방향 자기 공명 영상(Longitudinal magnetic resonance imaging)은 증거에 사용되는 기본 방법입니다.

Weight-Drop Method로 수정되고 자기 공명 영상(Magnetic Resonance Imaging)으로 입증된 복잡하지 않은 경미한 외상성 뇌 손상 모델의 개발

학습하세요 측두엽 충격 손상 모델을 이용하여 생쥐 해마 회로의 기능 변화를 조사하는 방법을. 전기생리학 기법과 행동 평가를 통해 손상 후 시냅스 균형 변화를 분석하고 치료 전략 개발에 필요한 기전을 규명합니다.

가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

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