가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

본 실험의 전반적인 목적은 경증 외상성 뇌손상 실험 모델에 의해 영향을 받은 뇌 영역의 네트워크 기능 변화를 조사하는 것입니다. 실험은 인간의 경증 외상성 뇌손상의 병리와 증상을 모두 모방하는 측면 유체 충격 손상을 마우스에 가하는 것으로 시작합니다. 두 번째 단계로, 뇌손상으로 유도된 인지 장애를 평가하기 위해 해마 의존적 행동인 맥락적 조건 공포 반응을 이용합니다. 다음으로, 세포 외 및 세포 내 기록과 전압 민감성 염료를 사용하여 흥분성 및 억제성 시냅스 전달 사이의 시냅스 균형에서 나타나는 지역 특이적 변화를 결정합니다. 관심 영역인 해마에서, 설명된 세 가지 기록 기술을 통해 대조군 마우스와 뇌손상 마우스 간의 차이를 기반으로 해마 내 하위 영역 특이적인 순 시냅스 효능 변화가 나타납니다.

이 접근 방식의 주요 장점은 병리학적 상태와 잠재적 치료제 모두가 여러 생리학적 규모에 미치는 영향을 식별할 수 있어, 이러한 회로 결손에 대해 더 일관된 그림을 그릴 수 있다는 점입니다. 이 방법은 특히 어떤 뉴런이 손상에 가장 취약하며, 결과적으로 손상 후 해마 기능 장애에 가장 크게 기여하는지와 같이 외상성 뇌 손상에 관한 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리의 접근 방식은 먼저 기저 기전을 규명하고, 이후 뇌 손상으로 인해 손상된 영역의 생리학적 상태를 복원하기 위한 잠재적 치료법을 개발할 수 있게 함으로써 외상성 뇌 손상 치료로까지 그 영향력을 확장합니다.

이 절차에서는 케타민과 자일라진 혼합물을 복강 내 투여하여 마우스를 마취합니다. 그다음, 외경 3mm의 트레판을 사용하여 오른쪽 두정엽 부위에 C자형 두개골 절제술(C craniectomy)을 수행합니다. 이어서 시아노아크릴레이트와 치과용 아크릴을 사용하여 C자형 두개골 절제 부위에 루어 락 바늘 허브를 고정합니다.

24시간 후, 이소플루란(isoflurane) 흡입 마취를 통해 마우스를 마취합니다. 정상적인 호흡이 회복되었으나 마우스가 자극에 민감해지기 전, 유체 충격 손상 장치(fluid percussion injury device)를 사용하여 두개골에 20밀리초(millisecond)의 생리식염수 펄스를 가합니다. 손상 직후 허브를 제거합니다. 이어서 이소플루란으로 마우스를 다시 마취하고 두피를 봉합합니다.

조건성 공포 반응 훈련 전 이틀 연속으로 마우스를 핸들링합니다. 훈련 당일, 마우스를 조건화 챔버에 3분 동안 둔 후 1.5 amp 바닥 전기 자극을 2초 동안 가합니다. 그 후 마우스를 챔버에 30초 동안 더 둔 다음 꺼냅니다.

24시간의 지연 시간 후, 마우스를 조건화 챔버로 다시 옮겨 5분간 두고, 손상 7일 후에 5초 간격으로 프리징(freezing) 정도를 평가합니다. 인공 뇌척수액 1L와 자당 절단 용액 250mL를 준비합니다. 뇌 절편 제작 과정에서 사용되는 모든 기구와 용액은 얼음을 사용하여 차갑게 유지해야 합니다.

이소플루레인을 사용하여 마우스를 빠르고 부드럽게 마취합니다. 마우스에서 뇌를 적출하여 수크로스 용액에 넣습니다. 그다음, 뇌를 트리밍합니다.

갓 절단된 뇌의 보존 표면을 아가 블록 앞의 Vibram 스테이지 위에 슈퍼글루 한 방울을 떨어뜨리고 그 위에 놓습니다. 350 micron 두께의 관상면 절편을 자릅니다. 손상되지 않은 해마 회로가 포함된 절편을 4~5개 얻을 수 있을 것입니다.

그 후 슬라이스를 37 °C에서 최소 1시간 동안 배양하십시오. 이제 2~5 MΩ의 붕규산 유리 전극을 준비합니다. 수직 풀러(vertical puller)를 사용하여 슬라이스를 챔버로 옮긴 다음, 세포 외 전위 기록을 위해 전극 홀더에 전극을 배치하십시오.

자극 전극을 슬라이스 상의 Perent 경로 또는 Shafer 측지(collaterals)와 같은 축삭로 위에 배치합니다. 그런 다음 기록 전극을 슬라이스 내부로 계속 내립니다. 다음으로, 단일 전기 펄스를 가하여 장외 포스트시냅스 전위(field extracellular postsynaptic potential)를 유도합니다.

최대 반응이 나타날 때까지 자극 사이에 기록 전극의 깊이를 조절하며 자극을 계속하십시오. 이는 전극들이 동일한 Z-레벨에 위치해 있음을 나타냅니다. 분석은 일반적으로 뇌 손상 마우스와 가짜 수술 마우스의 fiber volley 진폭을 비교하여 시냅스 전 활성화를 평가하고, F-E-P-S-P의 기울기를 비교하여 시냅스 후 활성화를 평가하는 측정으로 구성됩니다. 패치 클램프 기록을 위해 다시 슬라이스를 챔버로 옮기고 기록 전극을 내리십시오.

전극을 조직 속으로 내릴 때 기록 전극이 막히지 않도록 전극에 양압을 가하며 세포에 접근합니다. 전극이 세포에 부드럽게 닿으면, 전극과 세포막 사이에 기가실(giga seal)을 형성하기 위해 음압을 가합니다. 그다음, 짧은 간격으로 음압을 가하여 세포막을 파열시킴으로써 whole cell 구성을 완성합니다.

증폭기를 사용하여 정전 용량 과도 현상을 제거하고 직렬 저항을 보정하여 정확한 측정을 보장하십시오. 그런 다음 뇌 손상 마우스와 가짜 수술 대조군 모두에서 자발적 시냅스 전류의 빈도와 크기를 정량화하고 비교하십시오. 이 단계에서는 1mg의 dye three onap DHQ를 50µL의 에탄올에 혼합하여 염료 스톡을 준비하십시오.

호일로 감싼 튜브에 2 µL씩 분주하여 -20 °C에서 보관하십시오. 매일 A CSF를 사용하여 염료 작업 용액을 1:200 비율로 희석하여 조제하십시오. 그런 다음 A CSF로 적신 여과지에 절편을 올려 배양하고, 90 µL의 염료로 16분 동안 염색하십시오.

그 후, 이를 세척하여 인터페이스 기록 챔버에 넣습니다. 세포외 전위 기록법(extracellular field potential recording)에서 설명한 대로 자극 및 기록 전극을 배치합니다.

응답이 카메라 중앙에 위치할 때까지 광자극 강도를 조정합니다. 범위 이미지는 일반적으로 초당 500에서 1000 프레임의 속도로 획득합니다. 초기 급격한 광퇴색(photo bleaching)이 안정화될 수 있도록 전기 자극 200 milliseconds 전에 광자극 셔터를 작동시킵니다.

시도 사이에 10초 동안 휴지기를 둡니다. 나중에 비전기 자극 배경값을 뺄 수 있도록 전기 자극 시도와 비전기 자극 시도를 교대로 수행하십시오. 그런 다음 셔터를 열기 전의 휴지기 광강도를 기록하십시오.

각 VSD 실험은 형광 측정값의 동영상으로 분석할 수 있습니다. 즉, 각 실험은 시간의 흐름에 따른 X 및 Y 공간 차원의 값을 가진 3차원 데이터 행렬입니다. 각 테스트 조건에서 10~12회의 VSD 실험을 기록하고, 함께 제공된 원고에 따라 픽셀 내 조명 전 정규화된 형광 변화를 계산하십시오.

이 그림은 CA1 영역에서의 f-EPSP 기록 예시를 보여줍니다. 첫 번째 하향 굴곡은 자극 아티팩트이며, 이어서 시냅스 전 섬유 발리(presynaptic fiber volley)와 f-EPSP가 나타납니다. 여기는 유체 충격 손상 이후 CA1의 순 시냅스 효능 감소를 나타내는 입력-출력 곡선입니다.

여기 FPI 이후 치상회에서 순 시냅스 효율의 증가를 나타내는 입력-출력 곡선이 있습니다. 여기 CA1 피라미드 세포의 자발적 흥분성 포스트시냅스 전류의 예가 제시되어 있습니다. 여기 CA1 피라미드 세포와 빠른 스파이킹 CA1 인터뉴런의 활동 전위 열의 예가 있습니다.

이것은 수지상 돌기 가시(dendritic spines)가 없는 Lucifer yellow로 충전된 CA1 억제성 인터뉴런이며, 여기는 수지상 돌기 가시가 있는 Lucifer yellow로 충전된 CA1 피라미드 뉴런입니다. 이 도식들은 마우스의 관상면 해마 절편을 보여줍니다. 노란색에서 빨간색으로 표시된 픽셀은 구심성 Schaeffer collateral 자극 후 14ms 시점의 CA1 영역 내 흥분성 활성도를 나타냅니다.

빨간색은 더 강한 탈분극을 나타내며, 노란색은 그보다 약하지만 여전히 유의미한 탈분극을 나타냅니다. 파란색 픽셀은 동일한 구심성 샤퍼 측지(Afferent Shafer collateral) 자극 후 56밀리초 시점의 area ca 1 내 억제성 활성 부위를 나타내며, 진한 파란색일수록 더 강한 과분극을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 회로 기능 장애와 관련된 임상적으로 유의미한 병리적 상태를 해결하기 위해 여러 ex vivo 기록 기법을 어떻게 결합하는지 충분히 이해하게 될 것입니다.