2012년 10월 25일
자유 수영 선충류와 같은 미세한 미생물 C. elegans 생활하고 복잡한 입체 환경에서 동작합니다. 우리는 분석을 제공하는 새로운 접근 방식을보고 C. elegans 회절 패턴을 사용합니다. 이 방법은 큐벳을 통해 레이저 빛을 감독에 의해 생성 된 회절 패턴의 시간 주기성을 추적으로 구성되어 있습니다.
이 절차의 전반적인 목표는 자유롭게 헤엄치는 미세한 유기체의 몸부림치는 빈도를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 미세한 벌레 샘플을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로 광학 설정이 준비됩니다.
그런 다음 살아있는 유기체에 의해 도입된 회절 패턴이 기록됩니다. 마지막으로, 기록된 데이터를 분석하여 수영 빈도를 결정합니다. 궁극적으로 회절 분석은 제약되지 않은 웜의 운동 패턴의 변화를 보여주는 데 사용됩니다.
기존 현미경 검사와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 종이 3차원 공간에서 자유롭게 이동할 때 수영 패턴을 관찰할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 자유롭게 수영하는 바다의 우아함에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다양한 조건에 노출된 다른 투명하고 작고 미세한 유기체에도 적용할 수 있습니다. 비디오 분석을 위해 C elegance를 설정하려면 먼저 평평한 백금 와이어 픽을 사용하여 10-20개의 GR 성체 선충을 새로운 NGM으로 이동합니다.
한천은 대장균의 작은 원형 반점을 포함하는 페트리 플레이트를 채웠습니다. 선충이 3-5시간 동안 알을 낳도록 한 다음 성충을 제거합니다. 따라서 50-150 개의 선충으로 구성된 소규모 발달 동기화 배양을 확립하여 선충을 초기 성체로 성장시키고 페트리 접시를 섭씨 20도에서 4-5 일 동안 배양합니다.
비디오 분석 당일에는 1ml의 탈이온수 증류수를 사용하여 어린 성체 선충 한 접시를 씻어내면 동기화된 배양에서 50-150마리의 벌레를 수집할 수 있습니다. 마이크로 원심 분리기를 사용하여 벌레를 튜브 바닥으로 회전시키거나 약 15분 동안 중력에 의해 가라앉도록 합니다. 튜브에서 대부분의 물을 제거하고 1ml의 탈이온수 증류수로 대체하여 선충에서 부착된 박테리아를 씻어냅니다.
마이크로 피펫을 사용하여 물 속의 5-10개의 선충을 석영 베트로 옮깁니다. 543 나노미터 헬륨 네온 레이저를 사용하여 레이저 빔을 vete, vete 홀더, 프로젝션 스크린 및 초당 약 240프레임으로 촬영할 수 있는 고속 카메라를 통해 레이저 빔을 조종하는 데 사용되는 두 개의 전면 알루미늄 미러를 오버샘플링하기 위해 다음과 같이 광학 설정을 조립합니다. 다음으로, 파라폼 조각을 사용하여 베트의 상단을 덮고 뒤집어 선충을 물기둥에 혼합합니다.
벌레가 처음에 수트 상단 근처에 오도록 수맥 홀더에 수맥을 놓습니다. 미러를 사용하여 수트 중앙을 통해 레이저 빔을 조종합니다. 선충은 물보다 밀도가 높기 때문에 프로젝션 스크린의 물기둥 내에서 수영하는 동안 천천히 베트 바닥으로 떨어지고 투과 빔이 프로젝션 스크린과 만날 때 산란을 줄이기 위해 투과 된 레이저 빔에 해당하는 지점을 검은색으로 칠합니다.
투과 빔에서 산란을 제거하거나 줄이면 투과 빔으로 인해 카메라의 CCD 어레이가 포화되는 것을 방지할 수 있습니다. 회절 패턴의 크기 측정값을 캡처하려면 회절된 광 이미지를 방해하지 않고 투과된 레이저 빔 스폿 옆에 프로젝션 스크린에 약 5cm의 선을 그립니다. 실내 조명을 끄고 벌레가 레이저 빔을 통과할 때 화면에 회절 이미지를 기록합니다.
비디오 데이터를 준비하려면 다음 비디오 분석 프로그램을 설치하고 비디오를 프로그램으로 가져옵니다. 소프트웨어를 사용하여 투과된 레이저 스폿과 일치하도록 원점을 설정합니다. 각 선충에 의해 형성된 회절 이미지의 각도 변위를 추적합니다.
데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 모든 음의 각도에 대해 180도 또는 PI를 추가합니다. 연속적인 그래프를 생성합니다. 비디오 분석 설정을 사용하여 회절 패턴의 중심에서 작은 영역이 있는 포토 다이오드를 USB 포트를 통해 프로젝션 스크린 바로 앞에 배치합니다.
포토 다이오드를 컴퓨터에 연결된 디지털 오실로스코프에 연결합니다. 컴퓨터 화면에서 몸부림치는 패턴을 관찰하십시오. 데이터 세트를 ASCI 또는 텍스트 형식으로 저장하여 데이터를 분석합니다.
비디오 또는 사진을 사용하여 파형을 피팅할 수 있는 데이터 분석 프로그램으로 데이터를 가져올 수 있습니다. chiqua 최소화를 사용하여 스래싱 빈도를 결정하기 위해 사인파 곡선을 맞춥니다. 다양한 표본의 수영 빈도를 평균화하고 분산을 확인합니다.
이 연구를 위해 데이터는 단일 요인 Inova를 사용하여 통계적으로 분석한 다음 Bon Ferran을 사용하여 분석했습니다. 다중 비교 테스트 A P 값이 0.05 미만이면 회절 패턴을 모델링하는 데 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다. 먼저 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하여 이미지를 화합니다.
Mathematica로 드래그합니다. 이진 눈 명령을 사용하여 흑백으로 변환합니다. 또는 edge detect 명령을 사용하여 두 개의 후행 번호가 결과 가장자리의 거칠기를 제어하는 흑백 이미지를 만듭니다.
다음으로, image data 명령을 사용하여 이미지를 0과 1로 구성된 행렬로 변환합니다. forer 명령을 사용하여 행렬을 forer하고, 변환한 다음, 행렬의 절댓값을 제곱하고, 원본 이미지에 해당하는 회절 패턴인 결과 이미지를 봅니다. 또한, log 함수를 사용하여 영상의 대비를 스케일링할 수 있습니다.
마지막으로, 모델 회절 패턴을 자유롭게 수영하는 벌레에서 얻은 회절 패턴과 비교합니다. 이 예에서는 너비 1cm, 두께 5mm, 높이 4cm의 쿼츠 Q 수의사에서 바다의 우아함을 연구했습니다. 비디오 분석을 사용하여 단일 웜을 샘플링합니다.
5mm 두께의 수의사의 비디오 분석으로 얻은 평균 수영 빈도는 약 2.5헤르츠였습니다. 마찬가지로, 실시간 데이터 수집 방법과 디지털 오실로스코프를 사용하여 단일 웜을 샘플링하면 약 2.7Hz의 수영 빈도가 나타났습니다. 이 절차는 많은 웜에 대해 반복될 수 있습니다.
자유롭게 헤엄치는 지렁이에 대한 자세한 연구는 5mm 수의사에서 평균 수영 빈도가 2.37헤르츠인 것으로 밝혀졌습니다. 예상대로 수영 빈도는 기어 다니는 벌레보다 높습니다. 이 회절 방법을 사용하여 현미경 슬라이드에 국한된 바다 우아함의 평균 수영 빈도가 이전에 발표된 2헤르츠 값과 일치하는 것으로 밝혀졌습니다.
비디오를 따릅니다. 이 비디오에서 보여준 데이터 준비 및 회절 패턴의 모델링을 통해 수영 회절 패턴을 모델링할 수 있습니다. 기존 현미경으로 얻은 웜 이미지의 도움으로 모델링된 회절 패턴을 사용하여 우아한 바다의 수영 주기를 시뮬레이션합니다.
성공적인 모델은 수영 빈도와 일치하는 수영 패턴의 물리적으로 실현 가능한 성공으로 구성됩니다. 웜은 수영 주기가 시작될 때와 마찬가지로 수영 주기가 끝날 때와 동일한 모양이어야 합니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 컴퓨터 화면에서 수영 주기를 관찰하면서 빠른 사진 다이어트를 사용하여 각 벌레에 대해 1분 이내에 완료할 수 있습니다.
이 비디오를 시청한 후에는 자유롭게 수영하는 선충을 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 연구는 회절 패턴을 사용하여 선충 C. elegans의 수영 행동을 분석하는 새로운 접근법을 제시합니다. 이러한 패턴의 시간적 주기성을 추적함으로써 연구자들은 3차원 환경에서 이 미세한 유기체의 이동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
Quantitative analysis of freely swimming micro-organisms using laser diffraction enables high-throughput, real-time measurement of locomotion in three dimensions, overcoming the constraints of traditional microscopy. This approach provides robust, quantitative outputs for behavioral phenotyping and functional validation in early discovery. The method supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for neurobiology and movement disorder research pipelines.
This laser diffraction method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling quantitative behavioral analysis from early target validation through lead identification and preclinical research.