Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

다음 실험의 전반적인 목표는 부착 세포에서 부위 특이적 형질전환을 달성하는 것입니다. 이는 미세 전극 어레이(micro electrode array) 위에 세포 단층을 배양함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 선택한 전극에 전기 펄스를 가하면 해당 전극 위에 부착된 표적 세포의 전기천공법(electroporation)이 유도됩니다.

이는 세포막에 기공을 형성하여 외인성 분자가 세포 내로 진입할 수 있게 합니다. 이후 적절한 분석법을 사용하여 결과 표현형을 검출함으로써 표적 세포를 스크리닝할 수 있습니다. 본 연구에서 설명한 마이크로 스케일 형질전환 기술은 벌크 전기천공법이나 화학적 형질전환과 같은 기존의 형질전환 기술에 비해 몇 가지 핵심적인 장점을 가지고 있습니다.

A, 이를 통해 형질전환 과정 자체에 대해 정밀한 공간적 제어가 가능하며, 형질전환이 어려운 세포주에서도 단일 세포 또는 세포 군집을 높은 효율로 형질전환할 수 있습니다. B, 이는 쉽게 확장 가능한 접근 방식으로, 고처리량 분자 분석을 구현하는 데 도움이 됩니다. 부위 특이적 형질전환을 위해 마이크로 전극 어레이를 사용하는 주요 장점 중 하나는 정량적 전기생리학 및 형태학적 변화와 같이 표적 세포의 기능적 평가를 동시에 수행할 수 있다는 점입니다.

절차를 시작하려면, 오토클레이브로 MEA를 멸균한 다음, 오토클레이브로 멸균된 MEA를 층류 후드로 옮겨 표준 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 놓습니다. MEA에 세포를 파종하기 전, UV 램프를 20분 동안 켜서 층류 후드를 멸균합니다. 만약 MEA가 UV 광선에 민감하다면, 후드에 UV 조명이 켜져 있는 동안 MEA가 담긴 페트리 접시를 멸균 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 다음으로, helo 세포의 경우 MEA 표면을 10 µg/mL의 fibronectin으로 1~2시간 동안 처리합니다.

DI water로 세척한 후 층류 후드 내에서 MEA를 자연 건조합니다. 그 후, trypsin ETTA를 사용하여 부착성 포유류 세포의 유지 배양 라인에서 세포를 회수하고, 플레이팅을 위해 세포 배양액 1 mL 내의 농도가 µL당 100~200 cells가 되도록 조절합니다. 그런 다음 세포가 포함된 배양액 20~30 µL 한 방울을 MEA 위에 떨어뜨립니다.

MEA의 모든 전극을 덮기에 충분한 크기인지 확인하십시오. 그 후 MEA가 담긴 페트리 접시를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 습윤 인큐베이터로 옮겨 2~4시간 동안 배양합니다.

세포를 파종한 후, MEA가 담긴 페트리 접시를 배양기에서 층류 후드로 옮깁니다. 그 다음, 37 °C로 예열된 배지 400에서 500 µL를 MEA 웰에 조심스럽게 첨가하고, 현미경으로 관찰하여 세포가 MEA 표면에 여전히 부착되어 있으며 고르게 퍼져 있는지 확인합니다. 그런 다음 MEA를 다시 배양기로 옮깁니다. 세포 파종 8~12시간 후에 PBS로 1~2회 세척하여 사멸된 세포를 제거합니다.

일반적인 실험에서 세포는 보통 분주 후 24~48시간이 지나면 transfection 준비가 완료됩니다. electroporation 효율의 일관성을 유지하려면, electroporation을 수행하기 전 배양이 confluence에 도달할 때까지 기다리는 것이 권장됩니다. 매우 효율적인 sarna transfection을 달성하기 위해서는, 먼저 특정 MEA에 최적화된 electroporation 전압 펄스 파라미터를 결정해야 합니다.

본 과정에서는 전기천공법을 시행하기 전, 최적의 전기천공 파라미터를 결정하기 위해 propidium iodide를 사용하는 일련의 실험 단계를 설명합니다. 얼음처럼 차가운 전기천공 버퍼에 30 $\mu\text{g/mL}$ 농도의 PI 용액 300~500 $\mu\text{L}$와 PBS에 희석한 4 $\mu\text{M}$ calcium AM 용액 400 $\mu\text{L}$를 준비하십시오. 그 후, 인큐베이터에서 MEA를 층류 후드로 옮깁니다.

MEA에서 세포 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 그다음 pi가 포함된 얼음처럼 차가운 전기천공 버퍼 300 to 500 µL를 첨가합니다. 이어서 MEA에 1 mm 높이의 스페이서를 배치합니다.

MEA 중앙에 있는 세포에 닿지 않도록 주의하는 것이 매우 중요합니다. 그 후 MEA를 전기 상호연결 장치에 연결하고 전기천공에 사용할 전극을 선택합니다. 이어서, 전기천공 단계를 위해 대상 전극에 원하는 펄스 진폭과 지속 시간의 전기 펄스를 가합니다.

알루미늄 호일로 감싼 강철 음극을 1 mm 스페이서에 닿을 때까지 MEA 웰 안으로 내립니다. 그 직후, 대상 전극에 전기 펄스를 가합니다. 다음으로, 실험 설계에 따라 다른 전극 세트로 이 단계를 반복합니다.

HEK293 세포를 이용한 실험에서, 3V에서 9V 사이의 진폭과 1ms에서 10ms 사이의 지속 시간을 갖는 단일 전압 펄스를 관찰하였습니다. 100 µm 크기의 전극을 사용했을 때 세포 사멸을 최소화하면서 성공적인 전기천공술을 유도할 수 있었습니다. 전압 펄스를 가한 직후, MEA를 인큐베이터로 옮겨 5분 동안 배양하십시오.

5~10분 동안 배양한 후, MEA에서 스페이서를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 MEA 웰에서 전기천공 버퍼의 75%를 제거하고 따뜻한 세포 배지로 교체합니다. 이후 MEA를 다시 배양기로 옮깁니다.

2~4시간의 배양 기간 후, MEA 웰의 세포 배지를 PBS에 녹인 4 µM calcium AM 용액 300~500 µL로 교체합니다. calcium AM으로 세포를 배양한 후, MEA를 다시 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 더 배양합니다. 세척 단계 후에 웰 내의 calcium AM을 PBS로 교체한 다음, pi 필터가 장착된 광학 현미경을 사용하여 세포의 형광 이미지를 얻습니다.

전기천공법으로 인한 PI의 유입은 세포를 적색으로 형광 발광하게 하며, calcium am은 살아있는 세포를 녹색으로 형광 발광하게 합니다. 각 전극에 대한 세포 생존율은 이 방정식으로 추정할 수 있으며, 각 전극에 대한 전기천공 효율은 이 방정식으로 추정할 수 있습니다. 최적의 전기천공 파라미터가 결정되면, 이를 a 분자의 부위 특이적 전달에 사용할 수 있으며, siRNA 분자의 전기천공 절차는 pi의 전기천공 절차와 동일합니다.

여기에는 200 µm 전극 상의 HeLa 세포에 propidium iodide를 부위 특이적으로 전달한 모습이 나타나 있습니다. 칼슘 기반 생존 분석은 전기천공법 수행 2시간 후에 실시되었습니다. 여기에서 초록색 형광은 생존 세포를 나타내며, 여기의 빨간색 형광은 전극 상의 세포에 의한 PI 흡수를 보여줍니다.

여기에 중첩된 이미지가 있습니다. 이 세포들은 전기천공법이 적용되어 살아있는 상태이며, 이 세포들은 죽은 상태입니다. 이 그림은 직경 200 µm 전극에서 rumine 태그가 붙은 irna의 형질전환을 보여주며, 이 그림은 직경 100 µm 전극에서 Alexa 488 태그가 붙은 irna를 이용한 hela 세포의 형질전환을 보여줍니다.

흰색 화살표는 irna가 형질전환된 세포를 나타내며, 검은색 화살표는 사멸한 세포를 나타냅니다. 본 연구에서 시연한 기술은 형질전환이 어려운 일차 세포주를 포함한 다양한 세포주로 확장 적용할 수 있으며, 플라스미드나 단백질과 같이 더 큰 분자를 형질전환시키는 데에도 사용할 수 있습니다.