Name: Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 마이크로전극 배열을 이용한 부착 세포의 특정 사이트 전이 방법을 통해 siRNA 효율적 전달과 세포 표형 변화 분석 기술을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. MEA 준비 <ol><li> 이전 18 설명 또는 멀티 채널 시스템과 같은 MEA 제조 업체의 공급 업체에서 직접 구입으로 electroporation 실험에 사용 MEAs는 두 표준 석판 술 기술을 사용하여 제조 될 수있다 <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> 및 알파 MED 과학 주식회사 <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)가</a> . 우리 실험에 사용 된 MEAs는 고체 전자 연구 (CSSER)의 센터에서 관리 애리조나 주립 대학의 클린 룸 시설에서 - 집에서 제조되었습니다. 우리 실험에 사용 된 MEAs가 잘 1cm 내경 유리 내의 50-200 μm의 전극 직경 크기 4 배열하여 8 32 인듐 틴 산화물 전극했다. 유리는 잘 MEA를 사용 polydimethylsiloxane (PDMS)에 접합되었다. </li><li> 셀의 이전 압력솥에 MEA를 검사eeding. 그들은 MEA의 무결성을 손상하지 않는 한, 이러한 70 %의 에탄올에 몸을 담글 수로 살균의 다른 방법, 다른 곳에서 설명 된 바와 같이 UV 치료 및 온수 치료도 사용할 수 있습니다. </li><li> 층류 흐름 후드에 autoclaved MEA를 전송하고 표준 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 배치합니다. 이전 MEA에 셀을 퍼 뜨리고하기 20 분에 UV 빛을 설정하여 판상 흐름 후드를 소독. MEA는 UV 빛 흐름 후드가 UV 조명되는 동안 멸균 알루미늄 호일로 MEA를 포함하는 페트리 접시를 커버에 민감합니다. </li></ol> 2. MEA에 심는 세포 <ol><li> 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 도금 1 ML 셀 미디어에서 100-200 셀 / μl의 농도로 높이를 사용하여 점착성의 포유류 세포에서 실행중인 셀 줄에서 수확 세포. 우리 실험에서는 배양 NIH 3T3 섬유 아세포 세포 라인, HELA 세포 라인과 MEA에 대한 기본 대뇌 피질과 hippocampal 뉴런에 성공했습니다. </li><li&gt; MEA의 세포와 미디어 20-30 μl 방울을 넣으십시오. 보육에 MEA와 페트리 접시를 전송합니다. 이 세포 드롭 크기가 MEA의 모든 전극을 커버 할 수있을만큼 큰 수 있도록하는 것이 중요합니다. </li><li> 세포가 층류 후드에 보육에서 MEA와 페트리 접시를 전송하고 부드럽게 잘 MEA에 사전 예열 미디어 400-500 μl (37 ° C)을 추가 퍼 뜨리고 후 2 시간. 그 세포가 여전히 부착 고르게 MEA 표면에 확산되도록하기 위해 현미경으로 확인합니다. 보육에 MEA을 다시 전송합니다. 미디어를 추가하기 전에 2 시간의 대기 기간은 세포가 MEA 표면을 준수 할 충분한 시간을 보장합니다. 너무 일찍 셀을 퍼 뜨리고 후 세포 미디어의 추가는 세포를 씻어 수 있습니다. 세포가 MEA에 잘 준수하지 않을 경우, 그 표면은 세포 접착을 향상시키기 위해 세포 부착 요인 등 aspolylysine, fibronectin과 laminin으로 처리 할 수​​ 있습니다. 우리 HELA 세포 실험에서 우리는 일반적으로 fibronecti과 MEA 표면 처리1-2 시간을위한 N (10 μg / ML). </li><li> 셀을 퍼 뜨리고 후 8-12 시간은 모든 죽은 세포를 제거하는 PBS로 1-2 세차를 수행합니다. 필요에 따라 셀 매체는 모든 24-48 시간을 대체 할 수 있습니다. 전형적인 실험에서 세포는 시딩 후 보통 transfection 24-48 시간에 대한 준비가되어 있습니다. electroporation 효율의 일관성을 유지하려면 그것은 문화가 electroporation 전에 합류 최소한 80 % 될 때까지 기다리는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. siRNA의 특정 사이트 Transfection <ol><li> 핵산 솔루션을 준비합니다. siRNA의 transfection를 들어, 200-400 μl의 최종 볼륨을 달성하기 위해 얼음 차가운 electroporation 버퍼에 1-2 μM의 siRNA의 electroporation 솔루션을 준비합니다. 이 동영상 글에서 우리는 siRNA의 알렉사 488 복합 불가능한 시퀀스를 HELA 세포의 transfection을 보여줍니다. </li><li> 보육의 무균 층류 후드에 셀로 MEA를 전송합니다. MEA에서 세포 미디어를 제거하고 PBS로 세척을 수행합니다. 이후 나는의 200-400 μl를 추가합니다잘에 CE 추운 1 μM의 siRNA의 electroporation 솔루션입니다. </li><li> 대상 전극 (전기 펄스의 최적의 매개 변수를 결정하기위한 4 단계로 참조)에 양극 평방 전기 펄스를 적용 할 수 있습니다. 우리 실험에서는 전기 펄스와 MEA 본드 패드와 접촉을 할 듀얼 인라인 패키지 (DIP) 16 핀 클립을 생성하는 실용적인 악기주세요 2414A 파형 발생기를 사용했습니다. 파형 발생기는 각 전극의 선택성을 제공 할 수 demultiplexor 인쇄 회로 기판을 통해 DIP 클립에 연결 할 수 있습니다. 참조 전극은 세포 미디어에서 스틸 음극을 배치합니다. 미디어의 강 참조 전극을 낮추는 동안은 MEA 표면과 접촉하지 않도록 매우 중요합니다. 접촉되면, 그것은 세포와 MEA에 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것은 세포 위의 1 mm의 위치에 대한 참조 전극을 낮출 것을 권장합니다. 1mm의 높이 스페이서는 심판의 위치에서 도움을 잘에 배치 할 수 있습니다erence 전극. 외부 참조 전극을 사용하는 다른 접근 방식은 음극 - 양극 쌍으로 주변 전극을 사용하는 것입니다. </li><li> 바로 MEA의 대상 전극에 전기 펄스를 적용한 후에, 보육에 MEA을 다시 전송합니다. 5 분의 잠복기 후, 부드럽게 사전 예열 (37 ° C) 셀 미디어와 electroporation 버퍼의 75 %를 교체하십시오. 그 후, 형광 이미징은 세포에 휘황 태그 siRNA의 전달을 확인 할 수 있습니다. </li></ol> 4. Electroporation 매개 변수 최적화 <ol><li> 펄스 진폭, 펄스 기간, 그리고 펄스의 수의 값의 범위에 대한 electroporation, 디자인 electroporation 실험을위한 최적의 전기 펄스 매개 변수를 결정합니다. 헬러 세포와 우리의 경험에서 우리는 관찰 그 미를 성공적으로 electroporation으로 이어 100 μm의 전극 크기에 대한 단일 전압 3 V 9 V에서 진폭의 펄스 및 밀리 초 (1 ~ 10) 밀리 초까지 기간nimal 세포의 죽음. 그것은 하나의 매개 변수가 한 번에 다양 할 수 있으며 다른 사람들이 지속적으로 유지하고있는 것으로 추천합니다. 펄스 매개 변수 각각에 대해 electroporation 효율을 quantitate하기 위해, 우리는 단계 4.2-4.5에서 설명 propidium 요오드화물 (PI), 셀 impermeant을 염색이 얼룩 핵산 물질, 라이브 분석 기반의 방법론을 사용합니다. </li><li> 1 단계와 2 단계에 설명 된 지침에 따라 MEA에 세포 배양을 설정합니다. </li><li> 이전 electroporation은 얼음 차가운 electroporation 버퍼에서 30 μg / ML PI 솔루션의 300-500 μl와 calcien는 PBS의 솔루션을 오전 4 μm의 400 μl를 준비합니다. </li><li> 보육의 층류 후드에 MEA를 전송합니다. MEA에서 세포 미디어를 제거하고 PBS로 세척을 수행합니다. 이후 PI과 함께 얼음 차가운 electroporation 버퍼의 300-500 μl를 추가합니다. </li><li> 대상 전극 (elec을 생성하고 적용하는 우리의 실험에 사용 된 장비에 원하는 펄스 진폭 및 기간과 전기 펄스를 적용MEA에 tric 펄스 단계 3.3)에 설명되어 있습니다. 참조 전극의 경우도 잘 MEA의 electroporation 버퍼에 강 전극을 낮추거나 참조로 인근에 전극을 사용합니다. 선택적으로 다른 전극으로 다양한 진폭 또는 기간의 펄스를 적용하여 여러 실험 같은 장치에서 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 32 전극 MEA에, 8 실험은 8 그룹, 4 전극으로 구성된 각 분할에 의해 32 전극을 수행 할 수 있습니다. 8 그룹의 각 다음 컨트롤로 사용할 수 있습니다 0.5 V 단위와 한 그룹에서 3 V-6 V 범위에서 다양한 진폭과 지속 시간 5 밀리 초의 단일 직사각형 전압 펄스에 의해 자극 될 수 있습니다. </li><li> 즉시 신청 후 전압 펄스가 5 분의 보육에 MEA를 전송합니다. 그 후, 부드럽게 잘 MEA의 electroporation 버퍼의 75 %를 제거하고 따뜻한 휴대 미디어로 교체. 보육에 MEA을 다시 전송합니다. </li><li> 2-4 시간의 잠복기 후4 μm의 300-500 μl 잘 MEA의 셀 미디어를 대체이 Calcein PBS의 솔루션입니다. 또 다른 30 ​​분을 위해 보육에 MEA을 다시 전송합니다. </li><li> Calcein AM과 세포 배양 후, PBS있는 두 개의 세차 후 PBS로 잘 MEA에 솔루션을 Calcein 오전 바꿉니다. 그리고 Calcein AM (여기 / 방출 - 490 nm/520 NM) - PI (535 nm/617 nm의 여기 / 방출)에 대한 필터를 광학 현미경으로 사용하는 세포의 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. electroporation에 의한 PI의 이해는,에 세포가 빨간색 형광 및 Calcein AM 녹색 형광을 살아있는 세포의 원인이됩니다. 관찰 할 수 있습니다 세 가지 시나리오)) 살아 세포 electroporated하고 살아 (적색과 녹색을 모두 형광 것), 2) 세포 1아르하지만 electroporated (단지 녹색 형광합니다), 3하지 electroporation에 의한 죽은 세포는 (단지 빨간색 형광됩니다) . 세포 생존 능력은 전극에 살아 세포의 총 수의 퍼센트 electroporation의 EFF로 계산iciency는 PI / siRNA와로드 셀의 총 수의 비율로 계산되었다. </li></ol> 5. 대표 결과 그림 1은 PI와 헬러 세포의 특정 사이트 로딩을 보여줍니다. 이 전극에서만 세포가 PI (그림 1B)의 이해를 보여 관찰 할 수 있습니다. 라이브 검정이 게시물 electroporation은 세포 (그림 1A)의 생존 능력을 평가하는 데 사용 된 수행했습니다. 그림 1에 표시된 예를 들어, electroporation의 효율성과 세포 생존은 각각 81.8 %와 96.1 %입니다. 높은 세포 생존 능력과 electroporation 효율은 electroporation 펄스 매개 변수를 최적화하여 달성 될 수있다. 최적화 된 electroporation 펄스에 대한 휘황 태그 siRNA (8 V, 1 밀리 초)와 헬러 세포의 특정 사이트 transfection은 그림 2에 표시됩니다. 8 V, 1 밀리 초에서 siRNA의 electroporation 효율 ± 74.4이 발견 16.0 %와 한세포 생존 능력은 87.9 ± 8.4 % (평균으로 표시 모든 데이터가 ± 표준 편차, N = 5)으로 발견되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> 그림 200 μm 전극 (6 V, 5 밀리 초)에 HELA 세포의 PI 1. 사이트 별 제공. A) Calcien 기반으로 실시간 분석은 2 시간 게시물 electroporation을 수행. 살아 셀은 녹색 형광으로 표시됩니다. B) 레드 형광이 전극에서 세포 PI의 이해를 보여줍니다. C) A와 B 흰색 화살표 중 겹쳐 이미지는 electroporated과 살아있는 세포를 나타냅니다. 검은 색 화살표는 죽은 세포를 나타냅니다. A, B 및 C의 흰색 원은 전극의 개요를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> 그림 2. 휘황 태그 scrambl와 헬러 세포의 TransfectionsiRNA의 전자 배열. A) 100 μm 전극에 HELA 세포의 이미지 알렉사 488 태그 siRNA (8 V, 1 밀리 초)와 transfected. B) 세포 핵의 이미지는 DAPI 물들. 흰색 원은 전극의 가장자리를 표시합니다.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

이 동영상 글에서 우리는 siRNA의 스크램블 순서와 헬러 세포의 특정 사이트 transfection을위한 MEA의 사용을 보여줍니다. 이 기술의 장점 중 하나는 기본 세포 라인을 포함한 여러 세포 라인에의 적용이다. 우리 연구실은 이전에 E18 일 늙은 쥐와 스크램블 siRNA 시퀀스와 플라스미드 GFP 18, 19와 NIH-3T3 세포에서 기본 hippocampal neuronal 문화의 특정 사이트 transfection이 기술의 사용을 보여주었습니다. 우리는 또한 헬러 세포의 내생 대상 (게시되지 않은 데이터)에 대한 기능 siRNA를 제공 성공을 거두었습니다. 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 MEA는 형광 immunostaining 기술을 사용하여, 유전자 입을의 기능 영향을 정량적 평가를 지원, 광학 이미징 (직립 현미경)과 호환됩니다. 또한, MEA의 microelectrodes는 유전자 섭동에 대한 응답으로, 이러한 기본 뉴런과 같은 세포의 전기적 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다....

<table border="1"><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 세포 미디어 : 고급 가상 L-글루타민 200 MM 페니실린 / 스트렙토 마이신 태아 소 혈청 </td><td> Gibco / Invitrogen Himedia 연구소 / VWR Lonza 그룹 (주) Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> 세포 미디어 구성 : 사전 가상의 2% FBS, 2% L-글루타민과 2% Pennstrep </td></tr><tr><td> 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Mediatech 주식회사 </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech 주식회사 </td><td> 21-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 태그 알렉사 488과 rhodamine는 sequ 스크램블줬어 용 siRNA </td><td> Qiagen 주식회사 </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Electroporation 버퍼 </td><td> Biorad 연구소 </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> 파형 발생기 </td><td> 사실적인 </td><td> 2414A </td><td> 원하는 펄스를 제공 할 수있는 파형 / 펄스 발생기 사용할 수 있습니다. </td></tr></table>

microelectrode 배열을 사용하여 sirna와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 transfection (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

eukaryotes 및 siRNA와 shRNA 등의 RNAi 요원의 후속 개발에 RNAi 경로의 발견, 기능 유전체학 및 치료학에 대한 특정 유전자에게 1-8 입을위한 강력한 방법을 달성했습니다. RNAi 기반 연구에 참여하고있는 주요 과제는 대상 셀에 대한 RNAi 요원의 전달입니다. 이러한 대량 electroporation 및 화학 transfection 방법 등의 전통 비 바이러스 성 전달 기술은 종종 배달을 통해 필요한 공간 컨트롤을 결여하고 9-12 가난한 transfection 효율 여유. 이러한 양이온 지질, 양이온 폴리머와 나노 입자 등의 화학 transfection 방법의 최근 발전은 매우 향상된 transfection 효율 13 결과했습니다. 그러나 이러한 기술은 아직 상당히 높은 처리량 기술, 단일 세포 연구 및 세포 세포의 상호 작용 조사를 소형화 혜택을 누릴 수 있습니다 전달 이상 정확한 공간 제어를 제공하기 위해 실패합니다. NT는 &quot;유전자 전달에&gt; 최근 기술 진보. 자기편 세포의 높은 처리량 transfection 14-23, microscale electroporation을 사용하는 대부분을 사용하도록 설정 한 Microscale electroporation은 (최대 단일 셀에) 전달 이상 정확한 spatio - 시간적 제어를 제공하며, 표시되었습니다 또한 높은 효율성 19 24-26을. 달성하기 위해, electroporation 기반의 접근 방식은 화학 기반의 transfection 방법에 필요한 siRNA와 DNA 단지와 부화의 연장 기간을 (일반적으로 4 시간)이 필요하고 벌거 벗은 siRNA와 DNA의 직접 항목으로 이어지지 않는 세포 세포질에 분자. 결과 유전자 발현으로는 transfection 27 후 육시간 초부터 달성 될 수있다. 우리 연구소는 이전에 다음 ID로 자기편 포유류의 세포 배양 17-19에서 특정 사이트 transfection에 대한 microelectrode 배열의 사용 (MEA)를 보여주었습니다. MEA 기반의 접근 방식에서, 유전자 페이로드의 전송이 지역화 된 마이크로 스케일 electroporati를 통해 이루어집니다세포의 있습니다. 선택한 전극에 전기 펄스의 응용 프로그램은 자극 전극의 지역에 존재하는 세포의 electroporation로 연결 지역 전기장을 생성합니다. 마이크로 전극의 독립적 인 제어 transfection 이상의 공간과 측두엽 제어 기능을 제공하고 또한 실험 처리량을 증가와 문화 - 투 - 문화 다양성을 감소 같은 문화에 수행 할 여러 transfection 기반의 실험을 할 수 있습니다. 여기 우리는 실험 설정 및 electroporation을 사용하여 휘황 태그 불가능한 시퀀스 siRNA와 자기편 헬러 전지의 대상 transfection에 대한 프로토콜을 설명합니다. 동일한 프로토콜은 또한 플라스미드 벡터의 transfection에 사용하실 수 있습니다. 또한 여기에 기술 된 프로토콜은 쉽게 약간의 수정을 포유류의 세포 라인의 다양한 확장 할 수 있습니다. 사전 정의 및 사용자 정의 모두 전극 패턴과 MEAs의 상용 여부는이 기술 접근​​ 할 수 t를기본 세포 배양 장비와 O 대부분의 연구 실험실.

microelectrode 배열 (MEA)를 사용하여 자기편 포유류의 세포 배양에 siRNA의 스크램블 시퀀스의 특정 사이트 transfection에 대한 기사 내용은 프로토콜.

Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

진핵생물에서 RNAi 경로의 발견과 그에 따른 siRNA 및 shRNA와 같은 RNAi 제제의 개발은 ...을 위한 강력한 방법을 성취하였습니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 부착 세포에서 부위 특이적 형질전환을 달성하는 것입니다. 이는 미세 전극 어레이(micro electrode array) 위에 세포 단층을 배양함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 선택한 전극에 전기 펄스를 가하면 해당 전극 위에 부착된 표적 세포의 전기천공법(electroporation)이 유도됩니다.이는 세포막에 기공을 형성하여 외인성 분자가 세포 내로 진입할 수 있게 합니다. 이후 적절한 분석법을 사용하여 결과 표현형을 검출함으로써 표적 세포를 스크리닝할 수 있습니다. 본 연구에서 설명한 마이크로 스케일 형질전환 기술은 벌크 전기천공법이나 화학적 형질전환과 같은 기존의 형질전환 기술에 비해 몇 가지 핵심적인 장점을 가지고 있습니다.A, 이를 통해 형질전환 과정 자체에 대해 정밀한 공간적 제어가 가능하며, 형질전환이 어려운 세포주에서도 단일 세포 또는 세포 군집을 높은 효율로 형질전환할 수 있습니다. B, 이는 쉽게 확장 가능한 접근 방식으로, 고처리량 분자 분석을 구현하는 데 도움이 됩니다. 부위 특이적 형질전환을 위해 마이크로 전극 어레이를 사용하는 주요 장점 중 하나는 정량적 전기생리학 및 형태학적 변화와 같이 표적 세포의 기능적 평가를 동시에 수행할 수 있다는 점입니다.절차를 시작하려면, 오토클레이브로 MEA를 멸균한 다음, 오토클레이브로 멸균된 MEA를 층류 후드로 옮겨 표준 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 놓습니다. MEA에 세포를 파종하기 전, UV 램프를 20분 동안 켜서 층류 후드를 멸균합니다. 만약 MEA가 UV 광선에 민감하다면, 후드에 UV 조명이 켜져 있는 동안 MEA가 담긴 페트리 접시를 멸균 알루미늄 호일로 덮어줍니다. 다음으로, helo 세포의 경우 MEA 표면을 10 µg/mL의 fibronectin으로 1~2시간 동안 처리합니다.DI water로 세척한 후 층류 후드 내에서 MEA를 자연 건조합니다. 그 후, trypsin ETTA를 사용하여 부착성 포유류 세포의 유지 배양 라인에서 세포를 회수하고, 플레이팅을 위해 세포 배양액 1 mL 내의 농도가 µL당 100~200 cells가 되도록 조절합니다. 그런 다음 세포가 포함된 배양액 20~30 µL 한 방울을 MEA 위에 떨어뜨립니다.MEA의 모든 전극을 덮기에 충분한 크기인지 확인하십시오. 그 후 MEA가 담긴 페트리 접시를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 습윤 인큐베이터로 옮겨 2~4시간 동안 배양합니다.세포를 파종한 후, MEA가 담긴 페트리 접시를 배양기에서 층류 후드로 옮깁니다. 그 다음, 37 °C로 예열된 배지 400에서 500 µL를 MEA 웰에 조심스럽게 첨가하고, 현미경으로 관찰하여 세포가 MEA 표면에 여전히 부착되어 있으며 고르게 퍼져 있는지 확인합니다. 그런 다음 MEA를 다시 배양기로 옮깁니다. 세포 파종 8~12시간 후에 PBS로 1~2회 세척하여 사멸된 세포를 제거합니다.일반적인 실험에서 세포는 보통 분주 후 24~48시간이 지나면 transfection 준비가 완료됩니다. electroporation 효율의 일관성을 유지하려면, electroporation을 수행하기 전 배양이 confluence에 도달할 때까지 기다리는 것이 권장됩니다. 매우 효율적인 sarna transfection을 달성하기 위해서는, 먼저 특정 MEA에 최적화된 electroporation 전압 펄스 파라미터를 결정해야 합니다.본 과정에서는 전기천공법을 시행하기 전, 최적의 전기천공 파라미터를 결정하기 위해 propidium iodide를 사용하는 일련의 실험 단계를 설명합니다. 얼음처럼 차가운 전기천공 버퍼에 30 $\mu\text{g/mL}$ 농도의 PI 용액 300~500 $\mu\text{L}$와 PBS에 희석한 4 $\mu\text{M}$ calcium AM 용액 400 $\mu\text{L}$를 준비하십시오. 그 후, 인큐베이터에서 MEA를 층류 후드로 옮깁니다.MEA에서 세포 배지를 제거하고 PBS로 세척합니다. 그다음 pi가 포함된 얼음처럼 차가운 전기천공 버퍼 300 to 500 µL를 첨가합니다. 이어서 MEA에 1 mm 높이의 스페이서를 배치합니다.MEA 중앙에 있는 세포에 닿지 않도록 주의하는 것이 매우 중요합니다. 그 후 MEA를 전기 상호연결 장치에 연결하고 전기천공에 사용할 전극을 선택합니다. 이어서, 전기천공 단계를 위해 대상 전극에 원하는 펄스 진폭과 지속 시간의 전기 펄스를 가합니다.알루미늄 호일로 감싼 강철 음극을 1 mm 스페이서에 닿을 때까지 MEA 웰 안으로 내립니다. 그 직후, 대상 전극에 전기 펄스를 가합니다. 다음으로, 실험 설계에 따라 다른 전극 세트로 이 단계를 반복합니다.HEK293 세포를 이용한 실험에서, 3V에서 9V 사이의 진폭과 1ms에서 10ms 사이의 지속 시간을 갖는 단일 전압 펄스를 관찰하였습니다. 100 µm 크기의 전극을 사용했을 때 세포 사멸을 최소화하면서 성공적인 전기천공술을 유도할 수 있었습니다. 전압 펄스를 가한 직후, MEA를 인큐베이터로 옮겨 5분 동안 배양하십시오.5~10분 동안 배양한 후, MEA에서 스페이서를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 MEA 웰에서 전기천공 버퍼의 75%를 제거하고 따뜻한 세포 배지로 교체합니다. 이후 MEA를 다시 배양기로 옮깁니다.2~4시간의 배양 기간 후, MEA 웰의 세포 배지를 PBS에 녹인 4 µM calcium AM 용액 300~500 µL로 교체합니다. calcium AM으로 세포를 배양한 후, MEA를 다시 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 더 배양합니다. 세척 단계 후에 웰 내의 calcium AM을 PBS로 교체한 다음, pi 필터가 장착된 광학 현미경을 사용하여 세포의 형광 이미지를 얻습니다.전기천공법으로 인한 PI의 유입은 세포를 적색으로 형광 발광하게 하며, calcium am은 살아있는 세포를 녹색으로 형광 발광하게 합니다. 각 전극에 대한 세포 생존율은 이 방정식으로 추정할 수 있으며, 각 전극에 대한 전기천공 효율은 이 방정식으로 추정할 수 있습니다. 최적의 전기천공 파라미터가 결정되면, 이를 a 분자의 부위 특이적 전달에 사용할 수 있으며, siRNA 분자의 전기천공 절차는 pi의 전기천공 절차와 동일합니다.여기에는 200 µm 전극 상의 HeLa 세포에 propidium iodide를 부위 특이적으로 전달한 모습이 나타나 있습니다. 칼슘 기반 생존 분석은 전기천공법 수행 2시간 후에 실시되었습니다. 여기에서 초록색 형광은 생존 세포를 나타내며, 여기의 빨간색 형광은 전극 상의 세포에 의한 PI 흡수를 보여줍니다.여기에 중첩된 이미지가 있습니다. 이 세포들은 전기천공법이 적용되어 살아있는 상태이며, 이 세포들은 죽은 상태입니다. 이 그림은 직경 200 µm 전극에서 rumine 태그가 붙은 irna의 형질전환을 보여주며, 이 그림은 직경 100 µm 전극에서 Alexa 488 태그가 붙은 irna를 이용한 hela 세포의 형질전환을 보여줍니다.흰색 화살표는 irna가 형질전환된 세포를 나타내며, 검은색 화살표는 사멸한 세포를 나타냅니다. 본 연구에서 시연한 기술은 형질전환이 어려운 일차 세포주를 포함한 다양한 세포주로 확장 적용할 수 있으며, 플라스미드나 단백질과 같이 더 큰 분자를 형질전환시키는 데에도 사용할 수 있습니다.

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

여기 우리는 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 높은 처리량 화면에 인간의 esiRNA 라이브러리를 사용합니다. 우리는 설정하고 esiRNA 화면뿐만 아니라, 어떻게 결과를 분석하고 검증을 실시하는 방법을 보여줍니다.

포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA

이 프로토콜은 설정을 돌보는에서 녹음 및 전기 MEAs의 문화를 자극하기 위해 필요한 정보를 제공합니다.

어떻게 문화, 기록 및 미세 전극 배열에의 연결을 네트워크를 자극 (MEAs)에

고효율을위한 신뢰할 수있는...

표현과 HEK - 293T 세포의 재조합 전압 - 게이 티드 이온 채널 Electrophysiological 녹음에 최적화된 Transfection 전략

endoplasmic reticulum은 단백질 biogenesis과 칼슘 항상성에 중요한 역할을합니다. 우리는 우리 Ca2 + 누출 채널의 역할을 주소로하고 putative 규제 메커니즘을 특징 수있는 실험적인 체제를 구축했습니다. 이 시스템은 siRNA 중재 유전자 입을 라이브 세포 Ca2 + 이미징을 포함한다.

siRNA의 중재 진 입을와 결합 라이브 세포 칼슘 영상은 CA를 나타냅니다 2 + ER 막의 누출 채널과 규제 메커니즘

이 비디오는 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 뉴런의 전기생리학적 활성을 기록하는 방법을 보여줍니다. 뉴런-성상세포 공동 배양을 포함하는 멀티웰 MEA의 전기생리학적 활성을 기록하여 네트워크 내 여러 뉴런의 활동 전위를 감지하여 hiPSC가 뉴런으로 성공적으로 분화되는 것을 확인합니다.

마이크로 전극 어레이를 사용한 뉴런 네트워크의 전기생리학적 활성 측정

우리는 세포의 무결성과 단백질 항상성을 보존하는 고갈 구조 실험 방법을 설명합니다. Adenofection은 단일 세포 수준에서 유사분열 세포 분열 및 근육 발생과 같이 미세하게 조정된 액틴 기반 역학에 의존하는 생물학적 프로세스 내에서 단백질의 기능 분석을 가능하게 합니다.

Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

이 프로토콜 신경 문화에 활동 전위 전송 공부에 대 한 미세 장치 microelectrode 배열 시험관에서 결합 하는 방법을 설명 하는 것을 목표로. 데이터 분석, 즉 탐지 및 전파 하는 활동 전위의 특성은 수행을 사용 하 여 새로운 고급, 아직 사용자 친화적이 고 자유롭게 사용할 수, 계산 도구.

Microelectrode 배열 마이크로 신경 통신 및 Axonal 신호 전파 공부에 대 한 인터페이스

이 프로토콜은 음향 액적 배출 기술을 사용하여 384 웰 플레이트에서 포유류 세포의 고처리량 플라스미드 형질 감염을 설명합니다. 시간이 많이 소요되고 오류가 발생하기 쉬운 DNA 디스펜싱과 트랜스펙션 시약 디스펜싱은 나노 에스터디터 장치에 의해 소프트웨어 구동 및 수행됩니다. 세포는 다음 이 미리 채워진 우물에서 파종됩니다.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

이 프로토콜은 마우스의 페이스메이킹 결함을 식별하기 위해 전체 시노어심 노드 조직의 미세 전극 어레이 기록을 사용하여 본질적인 심장 발사 속도를 측정하는 새로운 방법론을 설명하는 것을 목표로합니다. 약리학 에이전트는 또한 본질적인 페이스 메이킹에 그들의 효력을 공부하기 위하여 이 방법에 소개될 수 있습니다.

중고심 노드 발사 속도의 마이크로 전극 어레이 기록으로 마우스의 본질적인 심장 페이스메이킹 결함을 식별합니다.

레이저 천공과 미세 전극 어레이(MEA)의 조합은 배양된 일차 및 줄기 세포 유래 심근 세포의 활동 전위와 유사한 기록을 가능하게 합니다. 파형 모양은 표준 기록보다 테스트 화합물의 작용 모드에 대한 우수한 통찰력을 제공합니다. 패치 클램프와 MEA 판독값을 연결하여 향후 심장 안전 연구를 더욱 최적화합니다.

안전성 약리학의 예측 가능성을 높이기 위해 미세 전극 어레이에서 심근 세포의 레이저 유도 활동 전위와 유사한 측정

배우세요 마이크로전극 배열을 이용한 부착 세포의 특정 사이트 전이 방법을 통해 siRNA 효율적 전달과 세포 표형 변화 분석 기술을 익히세요.

Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

더 많은 동영상 탐색