급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

전통적으로 시냅스 전 요소와 후 요소 간의 통신은 시냅스 전 말단에 활동 전위가 도달하여 칼슘 농도를 증가시킴으로써 글루타메이트 방출을 유도하고, 이것이 시냅스 후 수용체를 활성화하는 과정을 포함합니다. 하지만 성상교세포가 시냅스와 밀접하게 접촉하며 신경전달물질 수용체를 발현한다는 관찰 결과는 이를 삼자 시냅스(three partite synap)라는 개념으로 변화시켰습니다. 따라서 지속적인 글루타메이트성 전달은 성상교세포 또한 활성화하며 세포 내 칼슘 상승을 유도하게 됩니다.

글리오트랜스미터(gliotransmitters)의 방출은 시냅스 외 또는 시냅스 수용체와의 결합을 통해 전시냅스 및 후시냅스 활동을 조절할 수 있습니다. 또한, 성상교세포(astrocytes)는 시냅스에서 방출된 glutamate의 주요 흡수 시스템을 발현합니다. 아울러, 성상교세포는 칼륨 채널을 통해 활동 전위 발생 및 후속 후시냅스 활성 과정에서 방출되는 potassium을 전시냅스와 후시냅스 말단으로부터 제거합니다.

그 후 이 칼륨은 세포 내에서 세포 외 칼륨 농도가 낮은 부위로 운송되어 방출되거나, 간극 연접을 통해 인접한 성상세포로 확산됩니다. 따라서 성상세포는 신경활성 물질의 세포 외 농도를 조절하고 투명 전달물질을 방출함으로써 시냅스 활동의 강도를 결정하는 중요한 역할을 합니다. 본 연구실에서는 뇌의 생리병리학에서 신경교 상호작용의 역할을 연구하고 있습니다.

따라서 우리는 순간순간 일어나는 시냅스 전달 과정에서 성상교세포의 역할을 밝히기 위해 이 기술을 광범위하게 사용하고 완성해 왔습니다. 실제로 이 기술은 뉴런의 동적인 전기생리학적 반응을 온라인으로 동시에 모니터링할 수 있게 해준다는 점에서 매우 강력합니다. 오늘 Osteocytes Evap 클리닉에서는 연구실의 구성원인 Ash와 Jeremy Siebel이 이 기술의 수행 방법을 시연하고, 뉴런과 성상교세포 사이의 밀접한 상호작용을 이해하는 데 이 기술이 어떻게 도움이 되는지 설명해 드릴 것입니다.

본 연구에서는 신경세포 활동과 성상교세포의 potassium 및 glutamate 수송 발생에 대한 이중 기록을 수행하여, astroglide 네트워크가 신경세포, 시냅스 전달 및 가소성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과 astrocyte 네트워크가 신경 활동 중 extracellular potassium 및 glutamate 제거를 촉진한다는 것을 발견하였습니다. 또한, 신경생리학과 관련하여 astroglia 발생의 자연적 특성과 가소성을 조사하였습니다. astroglia 및 neuronal evok 활동 기록을 통해, 신경세포 활성화에 대한 astrocyte의 반응이 주로 potassium 전류에 의해 일어남을 확인하였습니다.

이 전류는 고유의 전기생리학적 가소성을 가지고 있으며, 신경 수용성과 가소성을 조절하지 않습니다. 다시 말해, 성상교세포의 감소는 매우 흥분된 상태의 뉴런을 유발합니다. 본 논문에서는 시냅스 전 섬유 자극으로 유도된 성상교세포 막 전류와 신경장 field potential의 이중 기록을 통해, 급성 해마 슬라이스 내의 신경 및 성상교세포 활성을 동시에 조사하는 중요한 방법을 제시하겠습니다.

또한, 신경 세포 활동 중 ASTO 글리코젠 반응을 조사하기 위해 단일 뉴런과 인접 성상교세포의 쌍 기록(paired recordings)을 수행할 것입니다. 해마는 해부학적 및 기능적 구획화가 뚜렷하며, 신경 회로뿐만 아니라 시냅스 활동 및 가소성 측면에서 특성이 잘 규명되어 있으므로 연구 부위로 선택하였습니다. 먼저, 냉각된 산소화 용액을 준비하여 해마 뇌 절편 제작 실험을 시작하십시오.

인공 뇌척수액(Artificial cerebral spinal fluid)을 준비하고, 마우스를 깊게 마취시킨 후 빠르게 머리를 절단하여 A CSF로 옮깁니다. 세 번의 절개를 통해 두개골을 열어 두 반구를 분리합니다. 마지막으로, 산소가 공급된 A CSF로 이들을 옮깁니다.

약 5분 동안 균등하게 꼬이게 둡니다. 이제 한쪽 반구를 시작합니다. 해마의 박절은 중뇌를 제거함으로써 시작합니다.

상세한 해마 박리 과정이 이제 이 그림에 설명되어 있습니다. 먼저, 분리된 뇌 반구를 대뇌 피질 부위가 아래로 오도록 배치하여 중뇌에 접근하십시오. 두 개의 스푼을 사용하여 중뇌를 제거합니다.

이제 점선으로 표시된 부분에서 해마가 보일 것입니다. 넓은 구조로 보이는 fia부터 시작하여 스푼을 이용해 해마를 절제하십시오. 해마 아래에 스푼을 삽입하고, 두 번째 스푼의 도움을 받아 해마에 인접한 피질을 잘라내십시오.

해마를 산소화된 A CSF가 담긴 작은 배양 접시로 옮기고, 두 번째 반구에 대해서도 동일하게 진행합니다. 두 해마를 alveo 측이 위를 향하도록 작은 AGA 블록 위에 배치하십시오. 이제 DS A CSF를 흡입하여 제거합니다. 해마를 슬라이싱 챔버 장치에 접착하여 고정하십시오.

해마를 절편 제작 챔버로 옮겨 300 또는 400 µm 두께의 절편을 만듭니다. 산소가 공급되는 보관 챔버에 절편을 수집하고, 단일 성상교세포의 전체 기록(wholesale recordings)을 수행하기 위해 상온에서 최소 1시간 동안 안정시킵니다. 해마 절편을 Polylysine이 코팅된 커버슬립 위로 옮깁니다.

해마 슬라이스가 폴리 코팅된 커버슬립에 부착될 수 있도록 과잉의 A CSF를 건조시킨 후, 슬라이스 위에 A CSF를 다시 첨가합니다. 슬라이스를 분당 1~2 mL의 속도로 산소화된 A CSF가 지속적으로 관류되는 기록 챔버로 옮깁니다. 성상교세포를 식별하기 위해, astroglia 특이적 GFAP 프로모터 하에서 EGFP를 발현하는 생쥐를 패치 클램프 기록에 사용할 수 있습니다.

필터링된 차가운 세포 내액으로 4~6 MΩ의 저항을 가진 유리 피펫을 채웁니다. 로다크론(rodda dron)이 포함된 세포 내액을 사용하면, 패치된 성상세포를 빨간색으로, EGFP를 발현하는 주변 성상세포를 초록색으로 시각화할 수 있습니다. GFAP 프로모터 하에서 성상세포는 약 10 µm의 작은 세포체 크기와 보통 3~4개의 분지를 포함하는 주요 돌기 분지의 특성으로 식별할 수 있습니다.

튜빙을 통해 피펫과 연결된 시린지를 사용하면 커맨드 창에서 조직 내부로 내려가는 동안 양압을 가할 수 있으며, 10 millivolt의 테스트 펄스를 트리거하고 유지 전류(holding current)를 0으로 맞춥니다. 그런 다음 마이크로 조작기(Micro manipulator)를 이용하여 피펫을 조직 내로 이동시켜 세포에 접근합니다. 세포 표면에 도달하면, 세포 표면이 약간 변형됨을 나타내는 빛의 굴절(dimpling)이 보일 때까지 더 이동합니다.

양압을 가함으로써 성상세포의 세포막이 유리 피펫 팁 입구에 단단히 밀착되며, 기가실(giga seal)이 형성되면 저항이 증가하는 것을 통해 이를 확인할 수 있습니다. 커맨드 창의 테스트 부분을 관찰하면서 음압을 완만하게 가해 정전용량 보정(capacitance compensation)을 수행하십시오. 세포막을 통해 전류가 흐르면 세포 내로의 진입(break-in)이 확인됩니다.

일련의 과분극 및 탈분극 전압 단계(voltage steps)를 적용하면 세포막 특성을 분석할 수 있으며, 성상교세포는 일반적으로 수동적 전류 반응만을 나타냅니다. 전류 클램프(Current clamp) 모드에서 전류를 주입해도 활동 전위(action potential)가 발생하지 않으며, 이는 실제로 성상교세포를 패치(patch)했다는 추가적인 확인 근거가 됩니다. 패치 피펫에 설퍼(sulfur) 또는 도마인 B(domine B)와 같은 추적자(tracer)를 추가하면 패치된 성상교세포를 시각화할 수 있습니다.

또한, current clamp 모드에서 20분 동안 추적자의 수동 확산을 유도하면 갭 결합으로 연결된 인접 성상교세포를 시각화할 수 있으며, 이를 통해 신경세포 흥분성 전달과 이후에 유도된 성상교세포 전류의 이중 기록을 수행할 수 있습니다. 우선, GABA 작동성 전달의 부재 시 발생하는 과흥분성을 방지하기 위해 precor toin으로 억제성 전달을 차단합니다. 그 다음 소형 iris knife를 사용하여 CS 3와 C 1 사이의 shaer collaterals 매개 연결을 절단합니다.

그 다음, A CSF 전장 자극 전극, 전장 기록 전극 및 성상교세포 패치 클램프 전극을 배치합니다. 해마 절편에서 성상교세포 하나를 선택하고, 전장 전극을 해당 세포로부터 200 µm 떨어진 곳에 배치하여, 성상교세포가 실제로 Schaffer 측부의 전장 전극 자극으로 기록된 활성을 통합하는지 확인합니다. 이 자극은 흥분성 전장 전위를 유발하며, 이 전장 전위는 자극된 축삭의 수를 반영하는 섬유 성분과 그에 따른 시냅스 후 탈분극으로 구성됩니다. 이를 통해 신경세포 전장 전위와 성상교세포 전체 세포 전류 반응의 이중 기록을 수행합니다.

먼저, 선택한 성상교세포로부터 약 50 µm 떨어진 곳에 전위 기록 전극을 배치하십시오. 그런 다음 패치 전극을 성상교세포의 세포체로 이동시켜 패치 클램프를 수행하며, 수동 막 특성을 통해 선택한 세포가 실제로 성상교세포인지 확인합니다. 이제 Shaer Cs를 자극함으로써 신경 활동과 그에 따른 성상교세포 전류를 동시에 기록할 수 있는데, 이 전류는 네트워크 연결성과 하나의 성상교세포가 최대 100개 뉴런의 시냅스와 접촉하고 있다는 사실로 인해 50 pA까지 지속되는 반응으로 나타납니다.

이 세포들은 동시에 활성화된 수많은 시냅스의 활동을 통합합니다. 개별 뉴런과 인접한 성상교세포의 이중 전세포 기록(whole cell recording)을 수행하기 위해, 두 개의 패치 전극을 해마 절편의 stratum area로 내립니다. CA1 영역에서 표적 뉴런을 식별하고, 동일한 깊이에서 약 20~60 µm 떨어진 곳에 있는 성상교세포를 찾은 다음, 양압을 가하면서 두 피펫을 각 세포의 약 10 µm 위에 위치시킵니다. 추가적인 기계적 움직임을 방지하기 위해 성상교세포 기록 피펫은 표적 성상교세포에 최대한 가깝게 배치해야 합니다.

먼저, 뉴런에서 gga 씰(seal)을 형성하십시오. 이제 일반적으로 뉴런보다 씰 형성이 느린 성상교세포(astrocyte)의 패칭을 진행하십시오. 이중 전세포 기록(Dual whole-cell recordings)을 수행하기 위한 주요 단계를 요약하자면, 먼저 두 개의 기록 파이프를 슬라이스 내부로 내립니다.

아스트로사이트(astrocyte)의 세포체(soma)로 접근한 다음, 뉴런에 대해 gga 실(seal)을 수행하고 이어서 아스트로사이트에 gga 실을 수행하여 마무리합니다. 일반적으로 뉴런은 아스트로사이트보다 막 저항(membrane resistance)이 훨씬 높으며, 피라미달 뉴런(pyramidal neuron)의 경우 두 세포 모두 약 200에서 500 MΩ 정도입니다. 이제 전압 클램프(voltage clamp) 모드에서 과분극(hyperpolarizing)을 유도하면, 뉴런에서는 일시적인 나트륨 전류(transient sodium currents)가 활성화되고 아스트로사이트에서는 수동적 칼륨 반응(passive potassium responses)이 나타납니다. 본 영상에서는 shaa 측부(collaterals)를 자극하여 빠른 흥분성 시냅스 후 장 전위(fast excitatory postsynaptic field potentials)를 유도함으로써, 이후에 지속적인 전류 반응이 유발됨을 보여줍니다.

인접 성상교세포에서 remic acid를 이용한 이온성 글루타메이트 수용체 억제 결과, asto gly 전류의 대부분이 흥분성 시냅스 후 활성화에 의한 것임이 밝혀졌습니다. 나머지 B AIC 반응은 TBOA에 민감한 빠른 일시적 글루타메이트 운반 발생과, 활동 전위 발화 중 시냅스 전 칼륨 방출로 인해 발생하는 것으로 보이는 작고 지속적인 전류로 구성됩니다. ascitic 전류는 시냅스 전 활성이 증가함에 따라 함께 선형적으로 증가하므로 시냅스 후 활성을 매우 신뢰성 있게 모니터링합니다.

또한, 성상세포 전류는 신경세포 반응과 유사하게 쌍펄스 촉진(paired pulse facilitation)을 나타냅니다. 샤레 측부(shaer collaterals)에 대한 적절한 단일 자극은, 전류 클램프 모드에서 동일한 세포에 기록된 작은 유발 탈분극에 비해 상대적으로 큰 시냅스 유발 성상세포 글리아 전류를 유도합니다. 이는 성상세포의 낮은 막 저항 때문입니다.

시냅스 유발 TTO glia 막 전위 역학의 기록은 국소 세포외 칼륨 수준을 직접적으로 측정하는 것입니다. 뉴런과 인접한 성상교세포의 쌍 기록을 수행한 결과, 뉴런이 활동 전위를 생성하는 동안 성상교세포의 전류 반응이 관찰되지 않았으며, 이는 두 세포가 전기적으로 결합되어 있지 않음을 나타냅니다. CS3 영역에서 유발된 흥분성 포스트시냅스 전위는 성상교세포의 전류 반응 또한 유도합니다. 또한, 1 Hz 자극은 CS3 영역의 뉴런 반응을 강력하게 강화시켰으나, 성상교세포 전류는 완만하게 증가시켰습니다.

이 영상을 시청한 후, 뉴런과 성상교세포의 성공적인 이중 전기생리학적 기록을 설정하고 수행하는 방법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 사용하여 관심 있는 전기생리학적 반응에 대해 뉴런과 성상교세포 간의 온라인 동적 신호 전달을 연구할 수 있습니다. 특히, 이온 채널 기능 및 조절과 관련된 새로운 GL 상호작용이 생리학적 또는 병리학적 상황을 정의하는 데 기여하는지 조사할 수 있습니다.

시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.