급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

고전적으로 시냅스전과 시냅스후 요소 사이의 의사소통은 시냅스전 말단에 도달하는 활동 전위를 포함하며, 이는 칼슘을 증가시켜 글루타메이트가 방출되어 시냅스후 수용체를 활성화합니다. 그러나 성상세포가 신경전달물질 수용체와 밀접하게 접촉하고, 시놉시스를 생성하고, 발현한다는 관찰은 세 부분 시냅스의 개념에 대한 관점을 바꾸어 놓았습니다. 따라서 지속적인 글루타메이트 전달은 성상세포를 활성화하고 세포 내 칼슘 상승에 의해 유발됩니다.

glio 전달물질의 방출은 여분의 시냅스 또는 시냅스 수용체에 와이어 결합을 할 수 있으며, 시냅스 전후 활동을 조절합니다. 또한, 성상세포는 시냅스로 방출되는 글루타메이트의 주요 흡수 시스템을 표현했습니다. 또한, 그들은 칼륨 채널을 통해 시냅스 전후 종말단에서 작용, 잠재적 발화 및 후속 시냅스 후 활성화 중에 방출되는 칼륨을 제거합니다.

그런 다음 이 칼륨은 세포 내에서 세포외 칼륨 수치가 낮은 부위로 운반되어 간극연접을 통해 인접한 성상세포로 방출되거나 확산됩니다. 따라서 신경 활성 물질의 세포 외 농도를 조절하고 명확한 전달 물질을 방출함으로써 성상세포는 시냅스 활동의 강도를 정의하는 데 중요한 역할을 합니다. 제 연구실에서는 대뇌 생리병리학에서 신경교세포 상호작용(neuroglial interactions)의 역할을 조사하고 있습니다.

따라서 우리는 순간순간의 시냅스 전달에서 성상세포의 벽을 풀기 위해 이 기술을 광범위하게 사용하고 완성했습니다. 실제로 이 기술은 뉴런의 동적 전기생리학적 반응을 온라인으로 모니터링하면서 동시에 모니터링할 수 있기 때문에 강력합니다. 그리고 오늘 골세포(Osteocytes Evap) 클리닉에서 애쉬(Ash)와 제레미 시벨(Jeremy Siebel)이 이 기법을 수행하는 방법을 시연하고 뉴런과 성상세포 사이의 친밀한 대화인 cing에 어떻게 도움이 되는지 설명할 것입니다.

저는 뉴런 활동과 아스트로 글리 칼륨 및 글루트 수송 발생의 이중 기록을 수행하여 아스트로글라이드 네트워크가 뉴런, 시냅스 전달 및 가소성에 미치는 영향을 조사했으며, 아슬린 네트워킹이 신경 활동 중 칼륨과 글루타메이트의 세포 외 제거를 촉진한다는 것을 발견했습니다. 나는 신경생리학과 관련하여 성상교세포 발생의 자연적 특성과 가소성을 조사했습니다. astroglia 및 neuronal evok 활동을 기록하는 동안, 주로 칼륨 전류에 의한 뉴런 활성화에 대한 성상 세포의 반응을 확인할 수 있습니다.

이 전류는 신경 수용성과 가소성을 조절하지 않는 고유한 전기생리학적 가소성을 가지고 있습니다. 다른 말로 하면, 성상세포 카운트다운, 매우 흥분된 카운트다운입니다. 신경. 우리는 여기에서 시냅스전 섬유 자극에 의해 유발된 성상세포막 흐름과 소변기 공급 전위의 이중 기록을 수행하여 급성 해마 절편에서 소변기 및 성상아교세포 활동을 동시에 조사하는 중요한 방법을 제시할 것입니다.

또한, 우리는 뉴런 활동 중 ASTO gly 반응을 조사하기 위해 단일 뉴런과 인접한 성상세포의 쌍을 이루는 기록을 수행할 것입니다. 우리가 해마를 선택한 이유는 이 영역이 강한 해부학적, 기능적 구획화를 나타내고 신경 회로, 시냅스 활동 및 가소성 측면에서 잘 특성화되어 있기 때문입니다. 산소화(oxygenated)라고 하는 얼음을 먼저 준비하기 위해 해마(Hippocampal) 뇌 조각을 준비하여 실험을 시작합니다.

인공 대뇌 척수액, 쥐를 깊이 마취시키고 머리를 빠르게 잘라 A CSF로 옮깁니다. 세 개의 상처가 있는 두개골을 열고 이제 두 개의 반구를 분리합니다. 마지막으로 산소가 공급된 A CSF로 옮깁니다.

약 5분 동안 균등하게 땋습니다. 이제 하나의 반구부터 시작합니다. 해마의 해부는 중뇌를 제거하는 것으로 시작됩니다.

자세한 해마 해부는 이제 이 그림에 설명되어 있습니다. 먼저 분리된 반구를 피질 부위에 위치시켜 중뇌에 접근합니다. 두 개의 숟가락을 사용하여 중뇌를 제거하십시오.

이제 해마가 점선으로 표시된 대로 표시됩니다. 넓은 구조로 보이는 fia에서 시작하는 숟가락으로 해마를 해부합니다. 해마 아래에 숟가락을 삽입하고 두 번째 숟가락을 사용하여 해마에 인접한 피질을 잘라냅니다.

산소가 공급된 A CSF가 있는 작은 배양 접시에 해마를 옮기고 두 번째 반구로 진행하여 폐포 면이 위로 향하게 하여 작은 AGA 블록에 두 하마를 모두 위치시킵니다. 이제 DS A CSF를 빨아 들이십시오. 하마를 슬라이싱 챔버 장치에 붙입니다.

해마를 슬라이싱 챔버로 옮기고 300 또는 400 마이크로미터 슬라이스를 자릅니다. 산소가 공급되는 보관실에 슬라이스를 모으고 단일 성상세포의 도매 기록을 수행하기 위해 실온에서 최소 1시간 동안 사전 기록하도록 합니다. 폴리리신(Polylysine) 코팅된 커버 슬립에 해마 슬라이스를 옮깁니다.

여분의 A CSF를 건조시켜 해마 슬라이스를 폴리 코팅된 커버 슬립에 부착한 다음 슬라이스 위에 A CSF를 다시 추가합니다. 슬라이스를 분당 1-2밀리리터의 관류 속도로 산소화된 A CSF로 지속적으로 관류되는 녹음 챔버로 옮깁니다. astroglia 특이적 GFAP promoter에서 EGFP를 발현하는 astrocytes 마우스를 확인하기 위해 패치 클램프 기록에 사용할 수 있습니다.

rodda dron을 포함하는 세포 내 용액을 사용하여 여과된 저온 세포 내 용액으로 4-6메가옴의 저항을 가진 유리 파이프를 채우면 패치된 성상세포를 녹색으로 시각화할 수 있습니다. EGFP를 발현하는 이웃 성상세포가 보입니다. GFAP 프로모터(GFAP Promoter)에서 성상세포는 약 10마이크로미터의 작은 소마 크기와 일반적으로 3-4개의 가지를 포함하는 주요 프로세스 분기로 식별할 수 있습니다.

튜브를 통해 피펫에 연결된 주사기는 명령 창의 조직으로 내려가면서 양압을 적용하고 10m볼트의 테스트 펄스를 트리거하고 유지 전류를 다시 생성할 수 있습니다. 그런 다음 Micro manipulator의 도움으로 피펫을 조직으로 이동하여 세포에 접근합니다. 우리가 세포 표면에 도달했을 때, 우리는 우리가 세포 표면을 약간 변형시킨다는 것을 나타내는 빛의 편향으로 보이는 보조개가 보일 때까지 더 나아갑니다.

양압 적용으로 인해 astrocytic 세포막은 이제 유리 파이퍼 팁 개구부에 단단히 밀봉되며, 이는 기가 씰에 도달했을 때 저항이 증가하여 관찰될 수 있습니다. 커패시턴스 보상을 수행하여 명령 창에서 테스트 부품을 관찰하면서 음압을 부드럽게 적용하여 도매 구성으로 이동합니다. 세포로의 침입은 멤브레인을 통해 흐르는 전류에 의해 볼 수 있습니다.

일련의 과분극 및 탈분극 전압 단계를 적용하면 세포막 특성의 특성을 규명할 수 있으며, 성상세포는 일반적으로 수동 전류 반응만 나타냅니다. 전류 클램프 모드에서 전류 주입은 활동 전위를 생성하지 않습니다. 실제로 황 또는 도민 B와 같은 추적자를 패치에 추가했다는 추가 확인을 발사하는 피펫은 패치된 성상세포를 시각화할 수 있습니다.

또한, 전류 클램프 모드에서 20분 동안 추적자의 수동 확산을 통해 간극 접합 연결 이웃 성상세포를 시각화하여 뉴런 흥분성 전달과 이후에 유도된 성상세포 전류의 이중 기록을 수행할 수 있습니다. 먼저 GABAergic 전염이 없을 때 발생하는 과흥분성을 방지하기 위해 precor toin으로 억제 전염을 차단합니다. 우리는 작은 아이리스 나이프로 CS 3과 C 1 사이의 셰이어 담보 매개 연결을 절단했습니다.

그런 다음 A CSF 전계 자극 전극, 전계 기록 전극 및 성상세포 패치 클램프 전극을 배치합니다. 해마 절편에서 우리는 성상세포를 선택하고 성상세포가 Shafer 측부의 자기장 전극 자극과 함께 기록된 활동을 실제로 통합하도록 하기 위해 성상세포에서 200마이크로미터 떨어진 곳에 위치시켜 흥분장 전위를 불러일으킬 것입니다. 이 자기장 전위는 자극된 축삭돌기의 수를 반영하는 섬유 벽과 그에 따른 시냅스 후 탈분극으로 구성되어 뉴런 공급 전위와 성상아교세포 전류 반응의 이중 기록을 수행합니다.

먼저, 선택한 성상세포에서 약 50마이크로미터 떨어진 곳에 필드 기록 전극을 배치합니다. 그런 다음 패치 전극을 astrocytic soma로 옮기고 패치 클램프를 삽입하면 선택한 세포는 수동 막 특성으로 실제로 성상세포임을 확인합니다. 이제 Shaer Cs를 자극함으로써 우리는 신경 활동과 그에 따른 성상세포 전류를 동시에 기록할 수 있는데, 이는 네트워크 연결성과 하나의 성상세포가 최대 100개의 뉴런의 시냅스와 접촉한다는 사실로 인해 50pic oum 반응까지 오래 지속되는 것으로 구성됩니다.

이 세포는 동시에 활성화된 많은 수의 시냅스의 활동을 통합하여 이중 전체 세포를 수행합니다: 개별 뉴런과 인접한 성상세포의 기록은 두 개의 패치 전극과 함께 해마 절편의 지층 영역으로 내려갑니다. C 한 영역에서 관심 뉴런을 식별하고 약 20-60마이크로미터 떨어진 동일한 깊이에서 성상세포를 확인한 다음 양압을 가하면서 각 세포에서 약 10마이크로미터 위에 두 피펫을 배치합니다. astrocytic recording 피펫은 추가적인 기계적 움직임을 피하기 위해 표적 astrocyte에 가능한 한 가깝게 위치해야 합니다.

먼저 뉴런에 gga seal을 달성합니다. 이제 일반적으로 뉴런보다 느리게 밀봉되는 성상세포에 패치를 적용하십시오. 듀얼 도매 녹음을 수행하기 위한 중요한 단계를 요약하려면 먼저 두 개의 녹음 파이프를 슬라이스로 내립니다.

성상세포의 소마에 접근한 다음 뉴런에 gga 씰을 수행하고 성상세포에 gga 씰을 수행하여 마무리합니다.뉴런은 일반적으로 성상세포보다 훨씬 더 높은 막 저항을 가지고 있으며, 이는 두 세포를 모두 가진 약 200-500메가의 피라미드 뉴런에 대한 것입니다. 이제 전압 클램프 모드 T와 과분극에서 멤브레인은 뉴런에서 일시적인 나트륨 전류를 활성화하고 성상 세포에서 수동 칼륨 반응을 활성화합니다. 여기서 우리는 shaa 담보를 자극함으로써 빠른 흥분성 시냅스후 장 전위의 유도가 연속적으로 오래 지속되는 전류 반응을 유발한다는 것을 보여줍니다.

인접한 성상세포에서 레믹산을 사용한 이온성 글루타메이트 수용체의 억제는 대부분의 아스토 글리 전류가 흥분성 시냅스후 활성화에 기인함을 나타냅니다. 나머지 B AIC 반응은 TBOA에 민감한 빠른 일시적 글루타메이트 수송 발생과 오래 지속되는 작은 전류로 구성되며, 이는 작용 중 시냅스전 칼륨 방출로 인한 것일 수 있습니다. 아시스 전류(ascitic current)를 발화하는 전위는 시냅스후 활성을 매우 안정적으로 모니터링하는데, 이는 둘 다 선형적으로 증가하면서 시냅스전 활성을 증가시키기 때문입니다.

더욱이, 성상세포전류(astrocytic currents)는 뉴런 반응(neuronal responses), 쌍을 이루는 펄스 촉진(paired pulse facilitation)과 같은 것을 나타낸다. shaer 담보의 적당한 단일 자극은 전류 클램프 모드에서 동일한 셀에 기록된 작은 유발 탈분극에 비해 상대적으로 큰 시냅스 유발 asto gly 전류를 유도합니다. 이것은 성상세포의 막저항이 낮기 때문입니다.

시냅스로 유발된 TTO gly 막전위 역학의 기록은 뉴런과 인접한 성상세포의 쌍을 이루는 기록을 수행하여 국소 세포외 칼륨 농도를 직접 측정하며, 뉴런이 전기적으로 결합되어 있지 않음을 나타내는 활동 전위를 발사하는 동안 성상세포 전류 반응을 관찰하지 않았으며, CS 3 영역에서 유발된 흥분성 시냅스 후 전위도 성상세포 전류 반응을 이끌어냅니다. 또한, 첫째, 그녀의 자극은 CS 3 영역의 신경 반응을 강력하게 강화했습니다. 그것은 단지 성상세포의 해류를 적당히 증가시켰을 뿐이다.

이 비디오를 시청한 후에는 뉴런과 세포의 성공적인 이중 전기생리학적 기록을 설정하고 수행하는 방법을 더 잘 이해할 수 있을 것입니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 전기생리학적 반응에 대한 뉴런과 성상세포 간의 온라인 동적 신호를 연구할 수 있습니다. 특히, 철 채널 함수 및 변조와 관련된 새로운 GL 상호 작용이 생리학적 또는 병리학적 상황을 정의하는 데 기여하는지 여부를 조사할 수 있습니다.

시청해주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.