Name: 펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: 배우세요 펩타이드:MHC 테트라머와 자성 마이크로비드를 이용하여 생쥐의 희귀한 에피토프 특이 T 세포를 분리하고 유세포 분석으로 정량하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 내인성 T 세포 반응을 이해하는 데 유용합니다.

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저자는이 프로토콜의 개발에 도움을 젠킨스 연구소의 앙드레 한과 로렌스의 엔 기술 지원 및 회원 감사드립니다.

1. 림프 조직에서 세포 절연 <ol><li> 의 작은 사각형이 포함 된 60mm 문화 요리에, 얼음 차가운 cEHAA (EHAA + 10% FBS, 펜 / 패 혈성, gentamycin, 2 MM L-글루타민, 55 MM 2 메르 캅토 에탄올) 또는 기타 이에 상응하는 T 세포 매체 1 ML을 추가 얼음에 100 μm 나일론 메쉬 및 장소. </li><li> 마우스를 안락사시켜야. </li><li> 비장 가능한 많은 쉽게 접근 할 수 림프절을 제거합니다. 이러한 적어도 사타구니, 겨드랑이, 상완, 자궁 경부, 그리고 장간막 림프절을 포함해야합니다. 배양 접시에있는 나일론 메쉬의 상단에 올려 놓으십시오. </li><li> 부드럽게 덧는 림프구를 해방하기 위해 나일론 메쉬 동안 폐쇄 1.5 ML의 microfuge 튜브의 평면 상단을 림프 조직 사용합니다. 정지에 셀을 작업 할 cEHAA와 pipet 위아래로 다른 한 ML을 추가합니다. 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 맨 위에 위치 나일론 메쉬의 또 다른 작품을 통해 셀을 전송합니다. 얼음 차가운 cEHAA, PO의 또 다른 한 ML 함께 그릇과 메쉬를 씻어같은 관에 볼륨을 oling. 4 ML의 최종 세포 현탁액 볼륨을 달성하기 위해 반복합니다. </li><li> 15 ML의 최종 볼륨 (PBS + 2% FBS, 0.05 % Azide) 차가운 정렬 버퍼를 추가, 4, 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 ° C. </li><li> 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 약 두 번 펠렛 자체의와 동일한 최종 볼륨으로 FC 블록 (정렬 버퍼 + 2.4G2 항체)의 세포 펠렛을 Resuspend. 예를 들어, 순진한 마우스 비장과 림프 노드는 일반적으로 약 100 μl의 세포 펠렛을 생산하고 있습니다. 이 경우, 200 μl의 볼륨을 가져 FC 블록 100 μl를 추가합니다. 셀 거리며 걷게의 큰 학위가 발생했습니다 경우, 조심스럽게 pipet 팁을이 시점에서 세포 덩어리를 제거합니다. </li></ol> 2. Tetramer의 착색 <ol><li> 10 나노 미터 (또는 경험적으로 최적화 된 농도)의 최종 농도에 PE 또는 APC-라벨 pMHC tetramer를 추가합니다. </li><li> 믹스와 incuba실내 온도 (또는 경험적으로 최적화 시간 및 온도)에서 1 시간에 테. </li><li> 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 얼음 또는 ° C 지금부터 4에 샘플을 보관. </li><li> 조심스럽게 액체의 어떤 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 표면에 뜨는을 대기음. 200 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 더블 tetramer 농축를 들어, 150 μl의 최종 볼륨 resuspend. </li></ol> 3. 자기 강화 <ol><li> Miltenyi 방지 PE 또는 안티 APC microbeads의 50 μl를 추가합니다. 더블 tetramer 농축를 들어, 50 μl를 추가합니다. </li><li> 4에 섞어서 20 분에 품다 ° C. </li><li> 15 ML의 볼륨에 감기 정렬 버퍼를 추가하고 300 XG, 4 ° C.에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리기 </li><li> 기다리는 동안 MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석에 Miltenyi LS 자기 열을 설정합니다. 에 문이 열려있는 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브의 위치를열 아래에 직접 올릴 수. </li><li> 가 15 ML 튜브로 배수 할 수 있도록, 컬럼의 상단에 정렬 버퍼 3 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼의 상단에 100 μm 나일론 메쉬 광장을 배치합니다. </li><li> 세포가 회전이 완료되면, 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 정렬 버퍼 3 ML에서 펠렛을 resuspend. </li><li> 열 상단 위에 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 세포 현탁액이 완전히 열을 배출되면, 정렬 버퍼의 다른 3 ML로 원래 튜브를 씻어 열로 나일론 메쉬를 통해 버퍼를 전송 과정에서 메쉬를 린스. 나일론 메쉬를 폐기하십시오. </li><li> 버퍼가 완전히 열을 배출되면 열을 정렬 버퍼의 또 다른 3 ML를 추가합니다. </li><li> 3 × 3 ML 세차 총 10 단계를 반복합니다. </li><li> 새로운 15 ML의 폴리 프로필렌 원심 분리기 튜브를 통해 자석과 장소에서 열을 제거합니다. </li><li> t로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가그는 열. </li><li> 즉시 열 상단에 플런저를 삽입하고 하나의 연속 동작으로, 튜브에 열을 밖으로 버퍼를 강제, 플런저 모든 방법을 아래로 밀어. </li><li> 300 XG에서 5 분의 용출 바인딩 된 분수와 흐름을 통해 언 바운드 분수, 4 ° C.를 포함하는 튜브를 원심 분리기 </li><li> 액체의 더 작은 물방울이 튜브의 측면에 남아되지 않습니다 확실하게, 바인딩 분수에서 표면에 뜨는을 자세히 대기음. 정확히 95 μl의 최종 볼륨으로 정렬 버퍼에있는 셀 펠렛을 Resuspend. 기음과 2 ML의 최종 볼륨에 언 바운드 일부를 resuspend. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 각 분수를 들어, 5 μl를 제거하고 5 ML의 FACS 관 계수 구슬 200 μl (정렬 버퍼에 200,000 / ML의 농도로 조정)에 추가 할 수 있습니다. 4에 정해 ° C를 분석하기. 시간을 절약하기 위해 구슬은 실험 시작 전에 레이블 튜브에 미리 aliquoted 할 수 있습니다. </li><li> 오전 준비항체의 애 스터 믹스는 세포의 표면 마커 (표 1) 얼룩합니다. 시간을 절약하기 위해, 이것은 실험의 시작하기 전에 수행 할 수 있습니다. </li><li> 바인딩 된 분수를 들어, 관 세포 ~ 90 μl에 직접 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. 언 바운드 분수의 분석이 필요하다면, 5 ML의 FACS 튜브에 세포의 90 μl를 전송하고 항체 칵테일의 복용을 추가합니다. </li><li> 흐름 cytometer위한 단일 색상 보정 컨트롤 패널을 설정합니다. 사용 할 각각의 fluorochrome를 들어, 해당 fluorochrome에 복합 항 CD4 항체 1 μl로 5 ML의 FACS 관에 남은 언 바운드 분획 세포의 50 μl를 섞는다. 뿐만 아니라 흠없는 제어를 설정해야합니다. </li><li> 소용돌이와 4에서 30 분의 모든 샘플을 품다 ° C. </li><li> 300 XG에서 5 분, 4 ° C. 각 튜브와 원심 분리기로 정렬 버퍼의 5 ML을 추가 </li><li> 바인딩 된 분수를 들어, 신중하게 정렬 buf 200 μl의 세포 표면에 뜨는 기음 및 resuspend남았다. 1.2 ML의 FACS의 microtube에 세포를 전송합니다. 같은 microtube에 정렬 버퍼와 수영장의 또 다른 200 μl로 관을 씻어. 셀 clumps이 명백 경우, 50 μm 필터를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 언 바운드 분율 및 보상 제어, 가만히 따르다 또는의 표면에 뜨는 및 resuspend 두 ML의 정렬 버퍼를 대기음하십시오. </li><li> 단일 색 보정 컨트롤을 사용하여 흐름 cytometer를 설정합니다. 기록 할 추가 매개 변수로 측 분산 폭 (SSC-W)를 선택합니다. </li><li> 도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 + 나 CD8 + T 세포 CD4을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 사용하여 스테인드 샘플을 분석합니다. 바인딩 분수를 들어, 최대 2,000,000 총 이벤트의 최대 가능한 한 많은 세포를 수집합니다. 언 바운드 분수를 들어, 1,000,000 총 이벤트를 수집합니다. 수집 속도 초당 이벤트이나 3000 아래하세요. </li><li> 같은 시스템 설정을 사용하여 계산 비드 샘플을 분석 할 수 있습니다. 10,000 총 이벤트를 수집합니다. &lt;/ 리&gt; <li> FCS 파일로 모든 데이터를 저장합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> FlowJo 소프트웨어를 사용하여 계산 비드 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 플롯 앞으로 FITC의 분산 및 (그림 1과 2 참조) 계산 구슬을 aroung 게이트를 설정합니다. 각 샘플에서 발견 비즈를 계산의 총 수를 결정합니다. 수집 셀 이벤트의 수를 결정하기 위해 수집 이벤트의 총 수에서 뺍니다. </li><li> 박스 1에서 설명한 방정식을 사용하여 각 샘플에있는 모든 세포의 총 수를 계산합니다. </li><li> 스테인드 바운드 및 언 바운드 일부 샘플에 대한 FCS 데이터 파일을 분석합니다. 림프 +, 측면 산란 - 너비 이오, 덤프 -, 3 번 CD +, CD4 + 또는 CD8 +, tetramer도 1 및도 2에 도시 된 바와 같이 각 예제에서 + T 세포.을 식별 할 연속 포함 된 문의 순서를 설정 </li><li> CD4을 정의하는 데 사용 포함 된 문이 각각의 주파수 + tetramer하여 샘플에서 세포의 총 수를 모두 곱하면+ 또는 CD8 + tetramer + 세포 에피토프 특정 T 세포 (박스 1)의 총 수를 계산합니다. </li></ol>

<ol><li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li>
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</ol>

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이 프로토콜에서 제공 pMHC tetramer 기반의 세포 농축 방법은 내생 T 세포 repertoires에서 에피토프 특정 T 세포를 연구하기위한 강력한 도구입니다. pMHC의 tetramers의 사용은 직접적으로 기원 pMHC 리간드를 구속하기 위해 자신의 TCRs의 능력에 따라 에피토프 특정 T 세포의 확인을 할 수 있습니다. 강화는 항원에 특정한 T 세포의 매우 희귀 한 인구는 자신의 유전 메이크업이나 전구체 주파수의 조작없이 T 세포의 내생 repertoires에서 감지 할 수 있도록 감도 수준을 제공합니다. 결과적으로,이 기술은 탐정 직접 면역 반응의 모든 단계를 통해 순진한 수준에서 생체 실험 시스템에서의 내생 항원에 특정한 T 세포 인구를 추적 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 에피토프 특정 CD4 + 보조 림프 기관에서 T 세포를 풍부하게 pMHC 클래스 II (pMHCII) tetramers의 사용에 최적화되었습니다마우스 s입니...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; 시약</strong</td&gt;<td<strong&gt; 공급 업체</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE 또는 APC 복합 pMHC tetramer (또는 multimer)</td&gt;<td&gt; NIH tetramer 코어에서 얻은, 조사원에 의해 제작, 또는 상업적 소스에서 구입</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - PE 복합 자성 microbeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - APC 복합 자성 microbeads</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LS 자기 열</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS 또는 QuadroMACS 자석</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 또는 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 셀 계산 비즈</td&gt;<td&gt; 생명 기술</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

펩타이드 : 에피토프 특정 t 세포의 mhc tetramer 기반 강화

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

생체 실험 모델과 적응 면역을 공부 연구자에 대한 기본적인 필요는 T 세포 항원 수용체 (TCR) 특이성에 따라 T 세포를 식별 할 수 있다는 것입니다. 많은 간접 방법은 T 세포의 대량 인구가 특정 항원과 에피토프 특정 T 세포 등 확산, 시토 킨 생산, 또는 활성 마커 하나의 표현과 같은 기능 응답의 측정을 통해 확인할 수 있습니다와 체외에서 자극되는 이용하실 수 있습니다. 그러나, 이러한 방법은 여러 가지 기능 중 하나를 전시 에피토프 특정 T 세포를 식별, 그들은 순진한 전구체 주파수에서 에피토프 특정 T 세포를 감지 할 수있을만큼 문자를 구분하지 않습니다. 인기있는 대안은, TCR 유전자 변형 입양 이전 모델 인에서 TCR 유전자 변형 마우스의 단클론 T 세포는 easi 수 있습니다 에피토프 특정 T 세포의 큰 전구체 인구를 만들 histocompatible 호스트에 놓는 아르통증은 congenic 마커 항체 2,3의 사용을 추적. 강력한 있지만,이 방법은 4,5 하나의 에피토프에 대한 특이성과 T 세포의 unphysiological 주파수와 관련된 실험 유물을 앓고. 또한,이 시스템은 polyclonal 인구에서 에피토프 특정 T 세포 클론의 기능 이질성을 조사하는 데 사용할 수 없습니다. MHC (pMHC) 단지 : 적응 면역을 연구 할 수있는 이상적인 방법은 전적으로 해당 펩타이드 기원에 바인딩하여 TCR의 특이성을 구별하는 방법을 사용하여 내생 T 세포 레퍼토리의 에피토프 특정 T 세포의 직접 검출을 포함해야합니다. pMHC tetramers 및 유동 세포 계측법의 사용이 6 달성 있지만 다음과 같은 항원 유발 clonal 확장을 발견 에피토프 특정 T 세포의 높은 주파수 인구의 감지로 제한됩니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 pMHC의 tetramers의 사용을 조정 방법 및 magne을 설명틱 세포 농축 기술은 마우스 림프 조직 3,7에서 매우 낮은 주파수 에피토프 특정 T 세포의 탐색 기능을 사용하도록 설정합니다. 이 기술로, 하나는 종합적으로 면역 반응의 모든 단계에서 쥐 내생 T 세포의 전체 에피토프 별 인구를 추적 할 수 있습니다.

그림 2는 이전에 관련 펩타이드 + CFA와 함께 예방 접종을 쥐 대표 데이터를 묘사하면서 그림 1은 순진 쥐에서 pMHCII tetramer 강화 비장과 림프절 샘플을 대표하는 유동 세포 계측법의 음모를 도시한다. 시리얼 게이트는 CD4의 분석 + T 세포 인구에서 autofluorescent 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거합니다. CD8 + T 세포 인구는 CD4의 pMHCII tetramer의 착색 + T 세포에 유용한 내부 대조군 역할을합니다. 강화에서 바인딩 된 분수는 일반적으로 게이팅 더 도전하고, 언 바운드 분수보다 autofluorescent 세포의 상당히 높은 비율을 포함합니다. 샘플의 에피토프 특정 T 세포의 절대 수는 determi으로 tetramer의 + 아르 이러한 세포의 비율과 함께 구슬 개수 분석에서 결정, 농축 샘플의 바인딩 분율에있는 모든 세포의 총 수를 곱하여 계산세포 염색 분석 (...

에피토프 특정 T 세포의 낮은 주파수 인구를 분리하고 유동 세포 계측법을 기준으로 결과를 분석 MHC tetramers 및 자기 microbeads :이 프로토콜은 펩타이드의 사용을 설명합니다. 이 방법은에서 관심 내생 T 세포 인구의 직접적인 연구를 수<em&gt; 생체 내</em&gt; 실험 시스템.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

생체 내(in vivo) 실험 모델을 통해 적응 면역을 연구하는 연구자들에게 필수적인 기본 역량은 T 세포의 T 세포...에 기반하여 T 세포를 식별하는 능력입니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 마우스의 내인성 T 세포 레퍼토리에서 희귀한 에피토프 특이적 T 세포를 식별하는 것입니다. 이를 위해 먼저 수확한 림프구 세포를 펩타이드 MHC 테트라머 시약으로 염색하여, 해당 에피토프 특이적 T 세포에 형광 표지를 합니다. 그런 다음 테트라머의 형광 태그에 특이적인 항체가 접합된 자성 마이크로비드로 이 테트라머 표지 세포들을 염색합니다.다음으로, 자성 라벨링된 세포들을 자성 컬럼에 통과시켜 테트라머가 결합된 에피토프 특이적 T 세포를 농축합니다. 마지막으로, 원하는 실험적 세포 마커로 세포를 염색한 후 다중 파라미터 유세포 분석을 수행하여 희귀한 테트라머 농축 에피토프 특이적 T 세포 집단을 검출하고 정량화합니다. TCR 형질전환 T 세포 입양 전이 시스템과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 이 기술을 사용하는 주요 장점은 면역 체계 내에서 자연스럽게 발달하는 실제 다클론성 에피토프 특이적 T 세포 집단을 대상으로 연구를 수행할 수 있다는 점입니다.또한, 이 기술이 제공하는 높은 검출 민감도 덕분에 매우 낮은 빈도로 존재하는 이러한 세포 집단에 대한 연구가 가능합니다. 이 방법은 면역학 분야의 많은 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 병원성 미생물의 특정 항원을 인식할 수 있는 나이브 T 세포의 수나, 에피토프 특이적 T 세포 집단의 클론 조성 및 면역 반응 과정에 따른 변화 등이 이에 해당합니다. 박리를 시작하기 전, 100 micron 나일론 메쉬 조각이 들어있는 60 millimeter 배양 접시에 1 milliliter의 완전 EHAA 배지를 넣고 접시를 얼음에 둡니다.그 후 안락사시킨 마우스에서 비장과 최대한 많은 수의 접근 가능한 림프절을 적출합니다. 배양 접시 내의 나일론 메쉬 위에 해당 조직들을 올립니다. 닫힌 1.5 millimeter 마이크로 원심분리 튜브의 평평한 윗부분을 사용하여 나일론 메쉬 위의 림프 조직을 부드럽게 으깹니다.림프구를 분리하기 위해 배지를 1mL 더 디쉬에 추가한 후, 피펫으로 용액을 위아래로 섞어 세포를 부유 상태로 만듭니다. 이제 새로운 15mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브 위에 새 나일론 메쉬를 올리고, 새 메쉬를 통해 세포를 옮깁니다. 디쉬와 메쉬를 차가운 배지 1mL로 헹군 다음, 해당 부피의 액체를 새 메쉬를 통해 15mL 튜브로 통과시킵니다.세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 최종 부피가 15 milliliters가 되도록 차가운 sorter buffer를 추가한 후, 4 °C에서 300 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 snat resus를 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.세포 펠렛을 FC block에 현탁하여 최종 부피가 펠렛 자체 부피의 약 2배가 되도록 합니다. 세포 응집이 심하게 일어난 경우, 항원 특이적 T 세포 염색을 위해 피펫 팁으로 세포 덩어리를 조심스럽게 제거하십시오.최적화된 농도로 형광 표지된 펩타이드 MHC 테트라머를 재현탁된 세포 펠렛에 첨가합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 혼합하고 최적화된 시간과 온도에서 테트라머 결합을 위해 배양합니다. 다음으로, 차가운 소터 버퍼를 넣어 부피를 15 milliliters로 맞춘 후, 세포를 4 °C로 유지하며 원심분리합니다.이제 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 sorter buffer로 재현탁하여 최종 부피를 200 microliters로 맞춥니다. 이제 tetramer mix의 형광 태그에 특이적으로 결합하는 mil tenny 항체 접합 마이크로비즈 50 microliters를 첨가한 후, tetramer가 결합된 세포와 비즈를 4°C에서 배양합니다.20분 후, 세포가 원심분리기 안에 있는 상태에서 sorter buffer로 세포를 세척합니다. quadro max magnet 위에 milani LS magnetic column을 놓고 새로운 15 milliliter 폴리프로필렌 원심분리 튜브를 배치합니다. 컬럼 바로 아래에 튜브가 오도록 한 뒤, 컬럼 상단에 sorter buffer 3 milliliters를 가하여 15 milliliter 튜브로 흘러내리게 합니다.그다음 컬럼 상단에 100 micron 나일론 메쉬 사각형을 올립니다. 세포 원심분리가 끝나면 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 펠렛을 3 mL의 sorter buffer로 재현탁한 뒤, 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 컬럼 상단으로 옮깁니다. 세포 현탁액이 컬럼 내부로 완전히 빠져나가면, 원래의 튜브를 다시 3 mL의 sorter buffer로 헹구어 메쉬를 통해 컬럼으로 옮깁니다.세척액을 수집 튜브에 모으고 나일론 메쉬를 폐기합니다. 그다음 버퍼가 튜브로 완전히 빠져나가면, 컬럼을 3 mL의 sorter buffer로 두 번 더 세척합니다. 그런 다음 컬럼을 자석에서 분리하여 새로운 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브 위에 놓습니다.이제 컬럼에 sorter buffer 5 mL를 더 추가합니다. 즉시 컬럼 상단에 플런저를 삽입하고, 한 번의 연속적인 동작으로 플런저를 끝까지 밀어 내려 버퍼가 컬럼 밖으로 튜브에 들어가도록 합니다. 용출된 결합 분획(bound fraction)이 담긴 튜브와 유출된 비결합 분획(unbound fraction)이 담긴 튜브를 모두 원심 분리한 후, 결합 분획의 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 세포 펠렛을 sorter buffer로 재현탁하여 최종 부피를 정확히 95 µL로 맞춥니다. 비결합 분획을 흡입하여 최종 부피 2 mL로 재현탁한 후 세포 분획을 추가로 염색하고, 5 mL fax 튜브에 counting beads 200 µL를 넣은 뒤 이 튜브에 세포 5 µL를 옮깁니다.이 튜브들을 분석을 위해 4°C에서 보관하십시오. 이후 표에 따라 세포의 표면 마커를 염색하기 위한 항체 마스터 믹스를 조제합니다. 결합 분획의 경우, 항체 칵테일의 정해진 용량을 세포에 직접 첨가하고, 비결합 분획에 대해서도 동일하게 수행합니다.90 µL의 세포를 5 mL fax tube로 옮기고, 사용할 각 형광색소에 해당하는 항체 칵테일을 옮겨진 샘플에 첨가합니다. 남은 비결합 세포 분획 50 µL를 5 mL fax tube에 넣고 적절한 형광색소가 접합된 anti CD4 항체 1 µL와 혼합합니다. 또한 염색하지 않은 대조군을 따로 준비한 후, 모든 샘플을 vortexing하고 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.그 다음 각 튜브를 5 mL의 sorter buffer로 세척한 후, 결합 분획(bound fraction) 샘플에서 상층액을 조심스럽게 흡입 제거하고 세포를 200 µL의 sorter buffer에 재현탁합니다. 세포를 1.2 mL fax 마이크로 튜브로 옮긴 다음, 이전 튜브를 추가로 200 µL의 sorter buffer로 헹구어 해당 마이크로 튜브에 모읍니다. 응집체가 보일 경우, 비결합 분획(unbound fraction) 및 보정 대조군(compensation controls)의 세포를 50 µm 필터에 통과시킨 후, 상층액을 따라내고 펠렛을 1 mL의 sorter buffer에 재현탁합니다.결합 분획 샘플에 대해 여기서 설명된 바와 같이 CD4 양성 또는 CD8 양성 T 세포를 식별하기 위해 일련의 순차적 포함 게이트(inclusion gates)를 사용하여 염색된 샘플을 분석하십시오. 비결합 분획 샘플의 경우 총 이벤트 수가 최대 200만 개가 될 때까지 가능한 한 많은 세포를 수집하십시오. 총 100만 개의 이벤트를 수집하십시오.마지막으로, 동일한 장비 설정을 사용하여 카운팅 비드 샘플에서 10,000개의 이벤트를 수집합니다. 첫 번째 그림은 결합 및 비결합 세포 분획에 대해 naive 마우스의 펩타이드 MHC two 테트라머 농축 비장 및 림프절 샘플의 대표적인 유세포 분석 플롯을 보여줍니다. 림프구 산란 양성, 측방 산란, dump 음성 및 CD three 양성 이벤트를 선택하기 위해 일련의 게이트를 설정하였으며, 이들 중 CD four 양성 또는 CD eight 양성 이벤트를 게이트하여 에피토프 특이적 T 세포 또는 배경 염색을 분석하였습니다.결합 분획 및 비결합 분획에서 얻은 염색되지 않은 세포의 분주액을 형광 카운팅 비드와 혼합하여 각각 분석하였습니다. 이 밀도 도표는 관련 펩타이드와 완전 보조제를 통해 이전에 면역된 마우스의 대표 데이터를 나타냅니다. 이전 실험과 동일한 연속 게이팅 전략을 사용하여 자가 형광 및 기타 원치 않는 이벤트를 제거하였습니다.CD4 양성 T세포 집단 분석 결과, CD8 양성 T세포 집단은 CD4 양성 T세포의 펩타이드 MHC II 테트라머 염색을 위한 유용한 내부 음성 대조군으로 활용되었습니다. 샘플 내 에피토프 특이적 T세포의 절대 수는 비드 카운트 분석으로 결정된 농축 샘플의 결합 분획 내 총 세포 수와, 세포 염색 분석으로 결정된 테트라머 양성 세포의 비율을 곱하여 계산합니다. 첫 번째 밀도 도표 시리즈에 표시된 대표적인 naive 마우스 데이터의 경우, 총 세포 수는 4,411이었으며 비드 수는 5,589였습니다. 비드 스톡 농도는 2 × 10⁵/mL였습니다.비드 부피는 0.2 milliliters였으며 세포 부피는 0.005 milliliters였습니다. 따라서 이 데이터를 사용하여 6.31 × 10⁶/milliliter의 세포 농도를 산출하였습니다. 그 후 세포 농도에 총 샘플 부피를 곱하여 총 세포 수를 산출하였습니다.이 데이터에 세포 분석에서 얻은 tetramer 양성 이벤트의 백분율을 곱하여, 이 naive 마우스로부터 유래한 epitope 특이적 CD4 양성 T 세포의 수가 98임을 결정하였습니다. 두 번째 밀도 도표 시리즈의 대표적인 면역 마우스 데이터의 경우, epitope 특이적 CD4 양성 T 세포의 총 수는 1.53 × 10⁴였습니다. epitope 특이적 T 세포의 수가 증가함에 따라 농축 효율은 감소합니다.따라서 에피토프 특이적 T 세포의 빈도가 매우 높은 샘플의 경우, 결합되지 않은 분획에서 테트라머 양성 세포가 관찰될 수 있습니다. 이러한 경우, 결합되지 않은 분획에 존재하는 에피토프 특이적 T 세포의 수를 별도로 계산하여 결합된 분획에서 발견된 수에 합산할 수 있습니다. 예를 들어, 대표적인 면역 쥐의 결합되지 않은 세포 분획에서 에피토프 특이적 CD4 양성 T 세포의 총수는 8.97 × 10³개였습니다.따라서 결합 분획과 비결합 분획의 수치를 합산하면, 면역된 마우스 샘플 전체에 2.43 × 10⁴개의 총 에피토프 특이적 CD4 양성 T 세포가 있었습니다. 실제로 에피토프 특이적 세포 확장이 충분히 강력하다면 농축 과정은 생략할 수 있습니다. 농축 절차 이후에는 사이토카인 및 전사 인자와 같은 세포 내 단백질의 염색이 가능하도록 자가 고정 및 투과화 단계를 수행할 수 있습니다.이 방법은 원래 비장과 림프절의 T 세포 연구를 위해 설계되었으나, 흉선이나 장과 같은 다른 조직에도 적용할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 인간의 혈액 및 조직 샘플에서 에피타입(epitype) 특이적 T 세포를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

이 비디오는 항원 펩타이드가 로드된 MHC-Igs 및 항-CD28 항체로 기능화된 자기 나노입자 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 희귀 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. aAPC와 항원 펩타이드 표적 T 세포 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포의 상호 작용 후 in vitro 확장은 이 CD8+ T 세포 집단의 농축 및 확장을 초래합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 나노 입자 기반 농축 및 증식

이 비디오는 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(pMHC-I) 사량체를 사용하여 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 특이적인 CD8+ 메모리 T 세포를 특성화하는 방법을 보여줍니다. pMHC-I 사량체는 SIV 특이적 펩타이드에 결합하고 형광단에 접합된 4개의 MHC-I 분자의 복합체입니다. 이러한 사량체는 SIV 특이적 CD8+ T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 선택적으로 결합하여 이러한 세포의 특성화를 용이하게 합니다.

SIV 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 분석하기 위한 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색 기법

재조합 인간 MHC II 분자와 생화학 적 분석은 신속하고 정량적 인 면역 원성 항원 인식에 대한 통찰력, 삭제, 디자인을 제공 할 수 있습니다. 여기에, 384 - 웰 플레이트를 확장 펩타이드 MHC II 결합 분석을 설명한다. 이 비용 효과적인 포맷은 단백질 deimmunization 백신 디자인 및 개발의 분야에서 유용한다.

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

이 원고는 기능화된 평면 지지 지질 이중층과 접촉하는 T 세포의 면역학적 시냅스 내에서 발생하는 T 세포 항원 수용체(TCR)와 항원 펩타이드 적재 MHC 분자 사이의 결합 역학을 측정하기 위해 (단일 분자) Förster Resonance Energy Transfer(FRET) 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다.

TCR-pMHC 바인딩 측정<em&gt; 현장에서</em&gt; FRET 기반의 현미경 분석을 사용하여

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

여기서, 우리는 고품질 면역 펩티도믹스 데이터를 제공하는 마우스 및 인간 세포주로부터 MHC 급 I 및 클래스 II 펩티드 복합체의 정화를 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 시판되는 항체를 사용하여 샘플 준비에 중점을 둡니다.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

자사는 자기 비드 기반 T 세포 농축 및 펩타이드:주요 조직 적합성 복합체(MHC) 사량체를 통해 쥐 폐에서 희귀 항원 특이적 T 세포 집단을 분리하고 식별하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

펩타이드를 이용한 생쥐 폐의 희귀 항원 특이적 T 세포 식별: 주요 조직적합성 복합체 테트라머

배우세요 펩타이드:MHC 테트라머와 자성 마이크로비드를 이용하여 생쥐의 희귀한 에피토프 특이 T 세포를 분리하고 유세포 분석으로 정량하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 내인성 T 세포 반응을 이해하는 데 유용합니다.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

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