나노 입자의 광학 트래핑

이 절차의 전반적인 목표는 약 20 nanometers 크기의 입자를 포집하기 위한 개구부 광학 트래핑 장치를 구축하는 것입니다. 이를 위해, 측정이 가능하도록 기존의 광학 레이저 트래핑 장치에 검출기를 추가합니다. 그 다음, 측정 대상인 나노입자 용액을 이중 나노 홀 트랩이 있는 미세유체 챔버에 분주하고, 해당 챔버를 광학 트래핑 장치에 장착합니다.

입자가 조명된 개구부에 진입하면 유전체 부하(dielectric loading)로 인해 빛의 투과율이 급격히 증가합니다. 입자가 개구부를 벗어나려 하면 투과율이 감소하면서 구멍 바깥쪽으로의 운동량 변화가 발생하며, 뉴턴의 제3법칙에 따라 입자를 다시 구멍 안으로 끌어당기는 힘이 작용하여 입자가 포집됩니다. 이 입자는 투과 곡선의 적색 편이(red shifting)를 일으키며, 이를 통해 모니터링이 가능합니다.

따라서 이 트랩은 센서로 활용될 수 있습니다. 결과적으로, 이중 나노 홀을 통과하는 레이저 강도의 변화를 통해 포획된 단백질의 언폴딩(unfolding)을 포함하여 나노입자의 포획 이벤트를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 구배력 광학 트래핑(gradient force optical trapping)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 더 낮은 레이저 강도로 더 작은 나노입자를 포획할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 단일 단백질이 어떻게 접히고 상호작용하는지, 그리고 바이러스 입자가 어떻게 살아있는 세포를 감염시키는지와 같은 생화학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 사용하는 개인은 기존 레이저 트래핑 시스템에 더블 나노홀(double nana hole)을 통합하는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪게 됩니다. 광학 트래핑 설정은 힘 측정 모듈이 장착된 Thor Lab의 광학 집게 키트를 기반으로 합니다.

힘 측정 모듈의 쿼드런트 검출기를 대체하기 위해 아발란체 광다이오드가 사용됩니다. 광학 트래핑 시스템을 설정할 때, 레이저가 켜져 있는 동안에는 항상 보안경을 착용해야 합니다. 밀폐된 공간에서 작업하고 빔을 트래핑 장치 내에 최대한 가둠으로써 빔이 안전 구역 내에 유지되도록 해야 하며, 반사성 장신구 착용은 피해야 합니다.

라텍스 장갑을 착용합니다. 광학 장치의 청결을 유지하기 위해 광학 집게 키트와 힘 측정 모듈을 설치합니다. 제조사의 지침에 따르면, 조립된 광학 집게 키트는 도립 광학 현미경 구조이며 트랩 레이저, 100 x 오일 침수 대물렌즈, 3축 시료 위치 조절 스테이지 및 CCD 카메라로 구성됩니다.

레이저 다이오드를 취급할 때는 정전기 방전 보호 조치를 취하는 것이 권장됩니다. 힘 측정 모듈을 사용하면 콘덴서 후방 초점 평면의 위치 검출을 통해 광집게를 보정할 수 있습니다. 힘 측정 모듈 대신 실리콘 기반의 아발란체 광다이오드(APD) 또는 포토다이오드(PD)가 사용됩니다.

사분면 위치 검출기(Quadrant position detector)에 200 kΩ 저항과 100 pF 커패시터를 사용한 저항-커패시터(RC) 필터를 삽입합니다. 이는 고주파 노이즈를 줄여 오실로스코프에서 포획 이벤트를 더 쉽게 관찰하기 위해 사용됩니다. 동축 케이블을 사용하여 APD 이후에 RC 필터를 연결하십시오. 그런 다음 동축 케이블과 T-어댑터를 사용하여 오실로스코프와 데이터 수집 모듈을 RC 필터에 연결하십시오.

이제 시스템에 샘플을 로딩할 준비가 되었습니다. 이중 나노 홀 조리개는 집속 이온 빔을 이용하여 금 박막에 가공한 두 개의 나노 홀로 구성됩니다. 박막의 두께는 100 nanometers이며 유리 기판에 의해 지지됩니다.

나노 홀들이 서로 겹쳐져 두 개의 날카로운 첨점(cusp)을 형성합니다. 나노 입자들은 이중 나노 홀에 입사되는 레이저 빛에 의해 이 첨점들 사이의 간극에 포획됩니다.

광학 현미경으로 이중 나노 홀의 위치를 식별하는 것을 돕기 위해 금속 박막에 큰 정렬 표식(registration features)을 밀링해야 합니다. 이러한 표식들은 이중 나노 홀로부터 약 100 microns 떨어진 곳에 배치해야 합니다. 일회용 컵에 10 grams의 폴리디메틸실록산(poly dimethyl suboxane) 또는 PDMS 베이스와 1 gram의 경화제를 붓습니다. 수 분 동안 혼합합니다.

그 후, 기포가 모두 사라질 때까지 진공 챔버에서 혼합물을 탈기시킵니다. 다음으로, 직경 9cm 페트리 접시에 PDMS 1.5g을 붓습니다. 스핀 코팅 과정을 통해 페트리 접시 바닥에 PDMS를 950 RPM으로 65초 동안 스핀 코팅합니다.

두께가 80 microns 미만이라면 크게 중요하지 않습니다. 1.5번 커버 슬립 3~5개를 서로 겹치지 않게 PDMS 위에 조심스럽게 올린 후 30분 동안 진공 배기합니다.

배기 과정 중에 커버 슬립이 움직여 서로 겹쳐 쌓인 경우, 조심스럽게 분리하십시오. 커버 슬립 아래의 PDMS가 얇고 균일하게 유지되도록 주의하십시오. 그 다음, 페트리 접시를 다시 30분 동안 배기하십시오.

페트리 접시를 진공 챔버에서 꺼내 핫 플레이트 위에서 85 °C로 20분 동안 가열하여 PDMS를 경화시킵니다. PDMS가 응고되면 면도날을 사용하여 커버슬립 중 하나의 가장자리를 따라 자릅니다. 그런 다음 정밀 핀셋이나 칼날을 사용하여 슬라이드를 조심스럽게 들어 올리면, 얇은 PDMS 층이 커버슬립에 부착되어 있을 것입니다.

PDMS가 부착된 커버글라스를 새로운 페트리 접시에 놓습니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 PDMS에 3 mm × 3 mm 크기의 창을 냅니다. 이 창은 나노입자 용액이 담길 챔버가 됩니다.

레이저 커터를 사용하여 중앙에 3/4인치 직경의 구멍이 있는 아크릴 현미경 슬라이드 홀더를 제작합니다. 구멍의 둘레를 양면테이프로 붙입니다. 면도날을 사용하여 남은 테이프를 잘라냅니다.

제작된 현미경 슬라이드를 준비된 PDMS 코팅 커버 슬립 중 하나 위에 올려, PDMS가 유리와 아크릴 사이에 샌드위치 구조로 놓이게 합니다. 마이크로 파이펫을 사용하여 0.05% weight per volume 폴리스티렌 나노구체 용액을 PDMS 윈도우에 몇 방울 첨가합니다.

나노 홀이 있는 금 박막 위에 한 방울을 떨어뜨립니다. PDMS 창 내부에 나노 홀이 위치하도록 금 샘플을 커버 슬립 위에 놓습니다. 챔버 내에 기포가 없는지 확인하십시오.

그 다음 금 샘플을 커버에 밀착시킵니다. 오일 침강 렌즈를 사용할 예정이므로, 과도한 용액은 밀어내어 닦아냅니다. PDMS 윈도우 위의 커버 슬립 반대편에 오일을 한 방울 떨어뜨립니다.

나노 홀의 위치를 확인하십시오. 현미경을 삽입하십시오. 슬라이드를 오일 면이 아래로 향하도록 슬라이드 홀더에 밀어 넣은 다음, 이머전 오일이 현미경에 닿을 때까지 슬라이드 홀더를 내리십시오.

대물렌즈의 위치를 대략적으로 조정하여 금 박막에 식각된 정렬 마크가 대물렌즈 아래에 오도록 합니다. 트래핑 키트에 포함된 Thor site와 같은 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 금 박막의 정렬 마크를 찾고, 표시선을 따라 나노 홀(nano holes)의 위치를 찾습니다.

인디케이터 표시 및 기타 개방 영역이 화면 중심에서 벗어나도록 슬라이드를 배치하십시오. 과도한 빛 투과는 A PD에 손상을 줄 수 있으므로 레이저를 켜십시오. 다이크로익 미러가 완벽하지 않기 때문에, 레이저 빔에 의해 화면 중심 근처에 스폿이 나타나야 합니다.

피조 스테이지 제어 소프트웨어를 사용합니다. 세 축 모두에 대해 정렬을 더욱 미세하게 조정합니다. 정렬이 정확해지면 PD 전압이 최대가 되며, 이는 나노 구멍을 통한 투과율이 가장 높음을 나타냅니다.

시스템 설정과 시료 로딩이 완료되었으므로, 광학 포집 데이터를 획득할 수 있습니다. 표시 마커를 이용하여 스팟을 기지의 나노 홀 위치 근처에 배치하십시오. 이중 나노 홀은 크기가 너무 작아 명확하게 분해되지 않으며, 화면상에서는 작은 점으로 나타납니다.

샘플을 통과하는 광 투과율은 오실로스코프의 신호 레벨로 표시됩니다. 광 투과율이 최대가 되도록 샘플을 추가로 정렬하십시오. 표시 마크와 가시적 또는 비가시적 긁힘(scratch) 부위에서는 광 투과율이 높게 나타나므로 주의해야 하며, 나노 홀(nano hole)은 긁힘과 달리 광 투과율에서 갑작스러운 도약을 보입니다.

파장판(wave plate)을 사용하여 보다 점진적인 변화를 유도합니다. 이중 나노 홀 구조는 편광 특성을 가지므로, 빛의 투과율이 최대가 되도록 광 편광을 조절합니다. 데이터를 획득하려면 데이터 수집 모듈을 사용하여 원하는 시간 동안 APD 전압을 샘플링합니다.

획득 시간은 일반적으로 수백 초 정도입니다. 본 실험에서는 데이터 획득을 위해 맞춤형 소프트웨어가 사용되었으며, 전압은 초당 2000회 샘플링되었습니다. MATLAB을 사용하여 획득한 데이터를 KY Gole 필터로 필터링하고, 이를 시간 대비 그래프로 작성하여 20 nanometer 폴리스티렌 나노입자의 포획을 나타내었으며, 이중 나노 홀을 통한 투과율을 시간의 함수로 측정하였습니다.

이후 PD를 사용하여 광 투과도를 도식화하였습니다. 시간에 따른 포획 이벤트는 특징적으로 갑작스럽게 발생하며, 이 예시에서 보는 바와 같이 두 투과 전력 수준 사이의 명확한 전환을 나타내는 날카로운 경계가 나타납니다. 포획된 상태에서는 신호 노이즈가 증가하는 경우가 빈번하며, 이러한 노이즈 증가는 포획된 입자의 브라운 운동으로 인해 발생합니다.

포획된 입자가 없으면 이러한 노이즈 소스가 발생하지 않는다는 점에 유의하십시오. 포획 이벤트와 관련이 없는 일부 아티팩트가 결과에 나타날 수 있습니다. 여기에서 보여주는 것처럼 수 분 동안 투과율이 서서히 변하는 드리프트 현상이 나타나는 결과는 폐기해야 합니다. 이 절차 이후에, 라만 분광법 및 형광 분광법과 같은 다른 방법을 수행하여 포획된 나노입자의 성질에 관한 추가적인 의문점을 해결할 수 있습니다.

이 기술은 연구자들이 생물학적으로 유의미한 나노입자를 단일 분자 수준에서 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 예를 들어, 단일 분자 수준에서 단백질 결합을 감지하거나 바이러스 감염을 연구하는 것이 가능해졌습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단일 나노입자를 포획하기 위해 이중 nHo 광학 트랩을 도립 현미경 레이저 T 시스템에 통합하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.