형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

이 절차의 목적은 정상 및 암 관련 섬유아세포를 새로운 조직에서 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 유선을 절개함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 유선, 단세포 현탁액, 섬유아세포 특이적 항체로 유지되는 다음 세포 및 다른 세포 집단에 특이적인 항체를 준비하는 것입니다.

마지막 단계는 형광 활성화 세포 소싱 또는 사실을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 분류된 세포 집단에서 발현된 특정 마커의 Q-R-T-P-C-R 발현 프로파일링은 분류된 세포 집단의 순도를 평가하는 데 사용됩니다. 섬유아세포 분리를 위한 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 섬유아세포의 유전자 발현 프로파일을 변경할 수 있는 조직 배양 단계를 피하면서 면역 세포 또는 상피 세포에 의한 오염을 최소화하면서 대부분의 조직 섬유아세포를 분리할 수 있다는 것입니다.

분자 표적을 이해하고 식별하는 것이 유방암 진행을 막고 환자 생존을 연장하며 궁극적으로 개별화된 치료 옵션을 개선하고 맞춤화하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 이 기술의 의미는 모든 유방암 치료로 확장됩니다. 당신의 눈 외에도 Dr.Lena만이 이 절차를 시작하는 절차를 시연할 것입니다. 안락사된 암컷 쥐를 스티로폼 표면에 등을 대고 놓고 25게이지 바늘을 사용하여 네 팔다리를 모두 단단히 고정합니다.

집게를 사용하여 마우스에 70% 에탄올을 넉넉하게 뿌립니다. 복부 정중선을 끌어 올리고 절개 부위부터 날카로운 가위로 작게 절개합니다. 복부 흉강에 구멍을 뚫지 않도록 동물의 목까지 피부를 자릅니다.

절개 부위의 정중선에서 다리 쪽으로 뒷다리의 피부를 절개하여 Y자 모양으로 만듭니다. 그런 다음 마우스 본체에서 피부를 당겨 빼내고 피부 아래쪽에 부착된 유선을 노출시키도록 핀을 고정합니다. 이 절차에서 가장 문제가 되는 것 중 하나는 근육 조직을 복용하지 않는 것입니다.

이 문제를 피하기 위해, 나는 근육 조직에 매우 가까운 두 번째 유선이 아닌 네 번째와 다섯 번째 유선만 복용할 것입니다. Q-tip을 사용하여 피부에서 기억샘을 부드럽게 분리하고 작고 날카로운 가위로 결막 조직을 잘라 기억샘을 마우스의 척추 쪽으로 분리하고 발견된 괴사 부위를 제거합니다. 절개된 기억샘을 PBS에 얼음 위에 놓습니다.

제모를 처리하지 않고 피부 조직을 얻는 가장 쉬운 방법은 마우스 귀를 사용하는 것입니다. 날카로운 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 양쪽 귀를 자릅니다. 얼음 위에 소량의 PBS가 들어 있는 소화 용기에 귀를 즉시 넣으십시오.

유선(mammary gland) 단세포 현탁액을 준비하기 위해 구부러진 가위를 사용하여 얼음 위에 소량의 PBS가 들어 있는 소화 용기에서 유선을 완전히 다진 다음 다진 조직에 20ml의 콜라겐분해효소 용액을 추가합니다. 이 양의 콜라겐 분해 효소 용액은 최대 15 마리의 마우스에서 약 5g의 기억 또는 종양 조직과 귀를 효율적으로 해리합니다. 섭씨 37도의 수조에서 교반 플레이트에 즉시 놓고 중간 속도로 저으면서 15분 동안 배양하여 30ml의 차가운 DMEM과 10%FCS에서 반응을 멈춥니다.

다음으로, 50ml 원추형 튜브 위에 놓인 70미크론 세포 여과기를 통해 조직과 배지 혼합물을 걸러냅니다. 원뿔형 튜브를 섭씨 4도에서 450배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 희생 전에 쥐가 PBS로 심장 관류되지 않은 경우 샘플의 적혈구는 면역 염색 전에 거짓말이어야 합니다.

섬유아세포 및 기타 세포 집단을 라벨링하기 전에 내인성 FC에 대해 세포를 차단해야 합니다. Resus는 팩스 완충기 1의 1개에서 3 밀리리터에 있는 세포를 중단하고, 그 후에 1개에서 50의 희석 배양에 FC 구획을 10에서 20 분 동안 얼음에 배양하십시오. FC 블록을 씻어낼 필요가 없으며, 100마이크로리터 세포 분취액을 주입하여 염색되지 않은 대조군 및 단일 색상 대조군으로 사용할 고아관을 만듭니다.

이 시연에 사용된 형광 항체의 수에 따라 두 개의 형광 항체를 사용하여 항 PDGF 수용체 알파에서 섬유아세포를 라벨링합니다. 이는 분류 샘플에 대해 1에서 50까지 희석하여 Fluor에 직접 결합되며, 다른 세포 집단을 라벨링하기 위한 단일 색상 대조군도 있습니다. 적절한 형광 접합 항체를 표면 마커에 1 - 50 희석으로 추가합니다.

면역 세포 및 상피 세포에 대한 항체를 포함한 적절한 단색 조절 튜브에도 항체를 추가하는 것이 권장되며, 이를 통해 이중 양성 집단을 배제하여 분리된 섬유아세포의 순도를 향상시키는 것이 좋습니다. 다음으로, 암흑 속에서 얼음 위에서 1시간 동안 항체와 함께 세포를 배양한 후 1시간 동안 팩스버퍼1로 튜브를 채우고 섭씨 4도에서 450배 G로 5분간 회전시켜 세포를 세척한 후, US는 팩스 버퍼1의 세포를 사용할 팩스 분류기로 분류하기에 가장 적합한 농도로 흡인하고 구부린다. 라벨이 부착된 세포를 필터 상단이 있는 팩스 튜브로 옮기고 세포를 튜브로 여과하여 세포 덩어리, 덩어리가 죽은 세포를 배제하는 것을 방지합니다.

스테인되지 않은 컨트롤을 제외한 모든 샘플에 대한 DPI입니다. 팩스 분석 중에는 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 이 절차를 시작하려면 팩트 분류기 소프트웨어를 사용하여 형광 설정, 획득 설정 및 유체역학적 낙하 설정을 준비합니다.

세포 분류기에 로드하기 전에 세포를 다시 현탁시키기 위해 각 샘플을 잠시 소용돌이칩니다. 먼저 염색되지 않은 샘플을 분석하여 전체 세포 집단에 대한 게이팅을 설정하여 세포 파편을 차단하고 자가형광 또는 배경 염색을 결정합니다. 다음으로, 염색되지 않은 샘플과 DPI를 분석하여 전체 세포 집단에서 살아있는 세포의 집단을 결정하고 게이트합니다.

각 단일 색상 컨트롤을 분석하여 보정과 같은 매개 변수를 결정하고 보정합니다. 염색 샘플을 분석하여 분류를 위한 게이트의 위치를 정의합니다. 원하는 세포 집단에 대한 파라미터와 게이트가 설정되면 라벨링된 세포 집단을 배양 배지 또는 RNA 용해 완충액을 포함하는 eph 튜브 또는 15ml 원뿔형 튜브로 분류하기 시작합니다.

분류가 완료된 직후, 세포를 스핀다운하여 새로운 배지 또는 RNA 용해 완충액으로 이동합니다. 실험 목적에 따라 섬유아세포를 분류하는 경우 배양해야 하며, 항상 콜라겐으로 코팅된 플레이트에 플레이트를 부착해야 하며, 이는 섬유아세포의 활성화를 초래하여 유전자 발현에 변화를 일으키기 때문에 절대 플라스틱에 직접 플레이트를 생성하지 않습니다. PDGF 수용체 알파를 섬유아세포의 마커로 사용하면 조직 섬유아세포의 고립되고 고도로 풍부한 집단을 얻을 수 있습니다.

이 예에서, 마우스 유선의 단세포 현탁액은 PDGF 수용체 알파 및 F 4개의 80 항체로 염색되었습니다. 사실 정렬 플롯은 왼쪽 패널에 표시되어 있으며, 여기서 P 2는 섬유아세포 게이트이고 P 4는 대식세포 게이트입니다. 오른쪽 패널에 표시된 정렬된 섬유아세포와 중간 패널에 표시된 대식세포의 순도를 결정하기 위해 사후 소스 분석을 수행했습니다.

다음 그림은 섬유아세포, 면역세포 및 상피세포에 대한 세포 특이적 조절 유전자의 Q-R-T-P-C-R에 의한 소싱 순도 분석을 보여줍니다. 결과는 ga, DH 및 mgus의 두 가지 하우스키핑 유전자와 gap에 대한 상대적 발현으로 정규화되었습니다. DH는 일반적으로 0.1 - 0.6%의 오염을 보여줍니다.

이러한 수준의 순도로 인해 분리된 섬유아세포의 고품질 전사체 프로파일링이 가능합니다. 분류되지 않은 유방 섬유아세포 집단에서 PDGF 수용체 알파 발현을 정량화한 결과, 유선의 전체 조직 섬유아세포의 약 85%가 PDGF 수용체 알파 양성임을 알 수 있습니다. 나는 고립되었다.

섬유아세포는 분류 후 바로 배양할 수 있지만 회복하는 데 며칠이 걸릴 수 있습니다. 1차 섬유아세포가 증식 중에 노화를 겪기 때문에 낮은 마사지 세포로 모든 추가 실험을 수행하는 것이 필수적입니다. 문화에서는 일단 숙달되면 이 기술을 제대로 수행하면 4시간 안에 완료할 수 있습니다.

세 번째로 배양된 세포가 배양되도록 지정된 경우, 멸균 상태에서 모든 절차를 수행하는 것을 기억하기 위해 가져옵니다. 이번 촬영에서는 멸균 분류를 하지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신선한 조직에서 고도로 농축된 섬유아세포 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.