Name: 형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 배우세요 FACS를 이용해 신선한 조직에서 정상 및 암 관련 섬유아세포를 분리하는 방법입니다. PDGFRα 표면 마커를 활용하여 면역세포나 상피세포 오염을 최소화하고 높은 순도의 세포 집단을 확보할 수 있습니다.

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우리는 FACS 정렬과의 도움을 박사 Yitzchak Oschry 박사 Orit Sagi - Asif 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정 N 아래에있는 유럽 연합 (EU) 세븐 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 NE에 대한 교부금에 의해 지원되었다 ° [276890] 이스라엘 암 협회 (# 20110078)에서와 이스라엘 암 연구 기금 (연구에서 경력 개발 상).

1. 마우스에서 유방이나 피부 조직을 박리 <ol><li> 마우스에서 원하는 조직을 해부하기 전에 다음과 같은 용품 및 시약을 준비 : 공급 : <ul><li> 수술 도구 (세제로 세척 한 후 70 % 에탄올에 담근). </li><li> 스티로폼 표면은 절개 중에에 마우스를 말이다. </li><li> 핀이나 바늘은 절개 중에 쥐를 개최합니다. </li><li> 자기 저어 바 (autoclaved)를 포함하는 소화 뚜껑 유리 항아리. </li><li> 37 번 물을 욕조 ° C, 저어 판에 쉬고있는 동안, 잠수함 자기 교반기와 잠수함 소화 병을 할 수있을만큼 물을 포함. </li></ul> 시약 : <ul><li> FACS 버퍼 I : (4 ° C) : Dulbecco의 인산이 (칼슘 마그네슘 무료) 식염 CMF 버퍼 + 0.5 % BSA </li><li> Collagenase 솔루션 (바로 사용하기 전에 한) : 0.05 g Collagenase II 0.05 g Collagenase IV 0.01 g의 Deoxyribonuclease 20ML FACS 버퍼 I.는 사용까지 얼음에 collagenase 솔루션을하세요. </li><li> PharmLyse (염화 암모늄의 Lysing 시약). </li><li> FACS 버퍼 II : Dulbecco의 인산이 식염 CMF 버퍼 + 1% FCS합니다. </li></ul></li><li> 유방 땀샘의 해부 (또한 17 참조). <ul><li> 이산화탄소 (CO 2) 흡입을 사용하여 여성의 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 스티로폼 표면에서의 뒷면에 마우스를 놓고 단단히 25 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 사지를 핀. 70 %의 에탄올과 넉넉한 마우스를 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여 중간 선에서 복부 피부를 당겨와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다. </li><li> 복부 나 가슴 충치를 펑 쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라. </li><li> &quot;Y 모양&quot;의 ​​결과로, 다리에 대한 중간 선 절개의 후면 다리에 피부를 잘라. </li><li> 마우스 몸에서 떨어진 피부를 당겨 아래로 핀, 노출유방 땀샘은 피부의 아래쪽 (그림 1B)에 부착. </li><li> 마우스의 척추를 향해 유선을 분리하는 작은 날카로운 가위로 결합하는 조직을 절단하면서 부드럽게 피부의 유방 땀샘을 분리하는 Q-팁을 사용하십시오. </li><li> 복부 분비 (# 4, 5)이 프로토콜에 가장입니다. 당신은 또한 2 차 유선을 사용하지만, 이러한 분비는 해부학 적 혼합 조직 출신 세포의 결과로, 별도의하기 어려운 경우도 있습니다 pectoralis 근육 가까이에있는 것을 명심 수 있습니다. </li><li> 참고 : 종양 조직을 해부 할 때,이 괴사 영역을 제거하는 것이 좋습니다. </li></ul></li><li> 피부 조직의 해부 : 머리 제거 처리 할 필요없이, 피부 조직을 취득하는 가장 쉬운 방법은 마우스 귀를 사용하는 것입니다. 조직의 큰 금액이 필요한 경우, 당신은 마우스 몸에서 머리를 면도하고 피부를 해부 할 수 있습니다. <ul><li> CO 2 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시켜야. </li><li> 날카로운 가위를 사용하여 얼음에 PBS의 작은 볼륨 (~ 0.5 ML)를 포함하는 소화 병에 즉시 귀 및 장소를 모두 잘라. </li></ul></li></ol> 2. 유선 / 피부 단일 세포 현탁액의 준비 <ul><li> 유방 땀샘 / 얼음 PBS의 작은 볼륨을 포함하는 소화 병의 피부를 놓습니다. 조직 한 다음 PBS로 세척을 피 X2이며, 경우 초과 PBS를 폐기하십시오. </li><li> 곡선 가위로 철저하게 이기다. </li><li> 20 ML의 collagenase 솔루션 (참고 : collagenase 솔루션의 양이 효율적으로 15 쥐 최대의 유방이나 종양 조직과 귀를 약 5g을 떼어 놓다 것)을 추가합니다. </li><li> 37 판을 저어에 즉시 배치 ° 15 분에 C 물 욕조 및 품다 중간 속도로 교반하면서. </li></ul> 참고 : 다른 조직을 소화하는 경우 최적의 배양 시간이 다를 수 있습니다. <ul><li> 반응을 중지하려면, 30 ML 차가운 DMEM + 10% FCS를 추가합니다. </li><li> 조직 / 미디어 혼합을 통해서 스트레인헥타르 70 μm 전지 스트레이너는 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치. </li><li> 4에 450 XG에서 5 분의 원추형 튜브를 원심 분리기 ° C. </li></ul> 3. 적혈구의 용해 참고 :이 희생되기 전에 쥐가 PBS로 마음 perfused 있다면이 단계가 필요하지 않습니다. <ul><li> 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서, 진공에 부착 된 유리 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 대기음. </li><li> 상온에서 5 분 10 ML의 PharmLyse 솔루션과 배양에 RBC, resuspend 세포 펠렛을 lyse합니다. </li><li> FACS 버퍼 I.의 약 40 ML을 추가하여 PharmLyse 솔루션을 중화 </li><li> 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분을위한 세포와​​ 원뿔 튜브를 스핀 </li><li> 표면에 뜨는을 대기음. </li></ul> 4. 내생 FC의 차단 <ul><li> 선택 사항 : 다음 단계에 해당하는 양을 결정하는 셀 수. </li><li> 1-3 ML FACS 버퍼 I에 Resuspend 세포 (O를 따라사용하려는 N 셀 번호 및 항체의 양). </li><li> 1시 50분 희석 (10 μg / ML)에 도달하고, 10-20 &#39;을 얼음에 품다 할 FcBlock (안티 - 마우스 CD16/CD32)를 추가합니다. 아니오 FcBlock 씻어 필요가 없습니다. </li></ul> 5. 더럽히는 것 <ul><li> 해제 - 스테인드 제어 및 단일 색상 컨트롤 (사용 형광 항체의 수에 따라)으로 사용할 eppendorf 튜브에 100 μl aliquots을보십시오. </li><li> 라벨 섬유 아세포로 : 1시 50분의 희석 (10 μg / ML)에 (형광에 직접 복합) 방지 PDGFRα를 추가합니다. </li><li> 다른 세포 집단 (예를 들면 면역 세포, 대 식세포, 내피 세포 등) 라벨 : 1시 50분 희석에, 표면 마커에 적절한 휘황 복합 항체를 추가합니다. </li></ul> 참고 : PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 마커이지만, 그것은 어떤 이중 긍정적를 제외하기 위해 면역 세포와 상피 세포에 대한 항체를 포함하는 것이 좋습니다인구 및 따라서는 고립 된 섬유 아세포의 순도를 향상시킬 수 있습니다. <ul><li> 단일 색상 제어 eppendorf 튜브의 각 각 항체의 2 μl를 추가합니다. </li><li> 어둠 속에서 얼음에 1 시간에 대한 항체와 세포를 배양. </li><li> 세탁 방법은 다음과 같습니다 FACS 버퍼 I와 튜브를 작성하여 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분에 스핀 </li><li> 약 2 X 10 6 세포 / ML, 또는 중 사용 가능한 FACS의 정렬과 정렬을위한 가장 적합한 농도의 농도에 I를 버퍼링 FACS에 표면에 뜨는, resuspend 세포를 대기음. </li></ul> 선택 사항 : 셀이 분류의 기간 동안 FACS 버퍼 II에 resuspended 될 수 있습니다. 이 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 혈청의 요인에 노출, 테스트 및 고려해야 효과 유전자 발현을 할 수 있습니다. <ul><li> 셀 clumps을 방지하기 위해 튜브에 필터 셀 : 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 셀을 전송합니다. </li><li> 죽은 세포를 제외하려면 7AAD을 (0.5 μg / ML) 추가 또는 형샘플에 idium의 요오드화물 (PI) (을 취소 스테인드 제어 제외). </li></ul> 참고 : 셀을 낭비하지 않도록하려면 FACS에 기록 후 해제 - 스테인드 샘플에 7AAD/PI을 추가하고 7AAD 전용 컨트롤로 다시 사용할 수 있습니다. <ul><li> 분석하는 동안 얼음에 샘플을 보관. </li></ul> 6. FACS에 의한 세포의 분리 (참고 : 프로토콜의이 부분은 ​​FACS의 정렬, 예를 들어 BD FACS AriaII, 또는 숙련 된 기술자의 도움을 운영에 이전 지식을 필요). <ul><li> FACS 정렬 소프트웨어 (BD ​​FACSDiva)를 사용, 앞으로 분산 (FSC), 측면 분산 (SSC), 7AAD, FITC, PE 및 레이블 셀 (그림 2)에 사용되는 다른 형광을 분석하기 위해 적절한 분석 음모를 준비합니다. </li><li> 셀 정렬 각 샘플을로드하기 전에 소용돌이가 간단히 세포를 resuspend합니다. </li><li> cel에서 게이트로, 총 세포 인구의 게이팅을 설정하기 위해 흠없는 샘플을 분석하여 시작난 파편, 그리고 autofluorescence이나 배경 착색을 결정합니다. </li><li> 전체 세포 인구에서 라이브 세포의 인구를 결정하고 게이트 흠없는 샘플 + 7AAD를 분석합니다. </li><li> 이러한 보상 등의 매개 변수를 결정하고 보정 각 단일 색상 제어를 분석합니다. </li><li> 정렬 게이트의 위치를​​ 정의하기 위해 스테인드 샘플을 분석합니다. </li><li> 일단 원하는 세포 인구에 대한 매개 변수 및 문이 설정되었으며, eppendorf 튜브 나 문화 매체 또는 RNA의 용해 버퍼를 (예 : RLT 버퍼 또는 Trizol 등)가 포함 된 15 ML 원뿔 튜브에 표시된 셀 인구 정렬 시작합니다. </li></ul> 참고 : 셀의 많은 정렬하는 경우가 세포 용해 버퍼를 희석하고 수율을 줄일 수 있습니다 동반 피복 유체의 큰 볼륨으로, RNA의 용해 버퍼에 직접 정렬하는 것은 권장하지 않습니다. <ul><li> 신선한 중간이나 RNA의 용해 버퍼 드에 정렬이 완료 된 후 다운 즉시 세포를 회전 및 이동실험의 목적에 대기 중입니다. </li><li> 문화 절연 셀에 순서대로 정렬하면 멸균 정렬을 수행합니다. 세포의 더 나은 복구를 들어, 페놀 레드 무료 DMEM + 5퍼센트 FCS 대신 FACS 버퍼 II를 사용하여 20 % FCS와 문화 매체에 세포를 수집합니다. </li><li> 배양은 섬유 아세포를 정렬하면 자신의 유전자 표현의 변화로 이어지는 섬유 아세포의 활성화에이 결과로 플라스틱 콜라겐 코팅 접시에 alwaysplate 결코 직접적으로. </li></ul>

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</ol>

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조직 문화에 실험을 유익하게 생체에서 확인 할 수 있습니다 기능 원리를 제안 할 수 있지만, 그것은 문화 11,12의 세포의 유전자 발현에 큰 변화가 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 섬유 아세포의 유전자 발현 프로파일 링 할 때 조직 문화 단계를 피하기 위해, 우리는 할 수 있습니다 신선한 마우스 또는 인체 조직의 정상뿐만 아니라 암 관련 섬유 아세포의 분리.에게 프로토콜을 개발 이 프로토콜이 성공적으로 마우스와 인간 9 일부터 피부, 췌장 및 유방 조직에 적용되었습니다. FACS 정렬에 의한 섬유 아세포의 절연은 표면 마커 라벨의 섬유 아세포가 필요합니다. 우리는 PDGFRα는 섬유 아세포 9 매우 풍부한 인구의 절연을 수있는 강력한 표면 마커입니다 설립했다. 또한, PDGFRα 따라서 편견 절연 및 프로파일 조직 섬유 아세포의보다 focusi을 허용, 일반 조직 섬유 아세포 모두와 CAFs에 표시됩니다특정 subpopulation에 NG. ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong시약의&gt; 이름</strong</td&gt;<td<strong&gt; 회사 소개</strong</td&gt;<td<strong&gt; 카탈로그 번호</strong</td&gt;<td<strong&gt; 코멘트 (선택 사항)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41,965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; 생물 산업</td&gt;<td&gt; 02-023 - 1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Col​​lagenase II</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Col​​lagenase IV</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Deoxyribonuclease</td&gt;<td&gt; 워싱턴</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 셀 스트레이너 70 μm</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93,070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 정화 안티 - 마우스 CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 비아 프로브 (7AAD)</td&gt;<td&gt; 전자 Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마우스 CD140a-PE (PDGFRa)</td&gt;<td&gt; 전자 Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 안티 - 마우스 F4/80- FITC</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / O 페놀 레드</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31,053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 콜라겐 유형 I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

형광 활성 세포 정렬 (facs)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

암 관련 섬유 아세포은 (CAFs) 특히 유방 암에, 많은 암의 종양 기질 내에서 가장 눈에 띄는 세포 유형으로, 그들의 눈에 잘 띄는 존재는 종종 가난한 예후 (豫后)의 1,2와 연결되어 있습니다. CAFs는 stromal 섬유 아세포의 활성화 subpopulation 있으며, 그 중 많은 myofibroblast 표시 α-SMA 3 표현한다. CAFs 지역 조직 섬유 아세포에서뿐만 아니라 골수 유래 세포 개발 종양으로 모집하고 종양 microenvironment (4)의 영향 아래 CAF의 표현형을 채택에서 유래. CAFs는 종양 세포 증식, 혈관 신생, 그리고 침략 5-8을 조장하는 신호를 통해 ​​종양 개시, 성장과 진행을 촉진하기 게재되었습니다. 우리는 CAFs는 초기 사전 neoplastic 단계 9시 시작, 종양 - 홍보 염증을 중재하여 종양 성장을 향상 것을 보여 주었다. 키 역할 CAFs의 증가에도 불구하고 증거가 종양 성장을 촉진에서 재생공부 CAFs은 종양 microenvironment 10 공동 기존의 여러 하위 유형이있는 CAF 특정 마커 및 이들 세포의 광대 한 이질성의 부족으로 인해 지속적 도전했다. 또한, 체외에서 섬유 아세포를 공부하는 것은 자신의 유전자 발현 프로파일은 종종 조직 배양 11,12에서 변경 있다는 사실에 의해 방해된다. 이 문제를 해결하기 위해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포의 편견 유전자 발현 프로파일을 허용하기 위해 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 13,14의 이전 프로토콜을 기반으로하는 방법을 개발했습니다. 우리 접근 방식은 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포를 분리 할 수​​있는 표면 마커로 PDGFRα을 사용에 의존하고 있습니다. PDGFRα이 넘치게 일반적인 섬유 아세포와 CAFs 9,15 모두에 의해 표시됩니다. 이 방법은 등의 일반적인 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구,의 고립하지만이 α-SMA으로 제한 할 수 있습니다 + myofibroblasts을 활성화. 절연 섬유 아세포는 할 수 있습니다특성화 및 tumorigenesis 동안 CAFs에서 발생하는 유전자 발현의 진화 비교에 사용됩니다. 사실, 우리와 다른 사람들은 16 정렬 세포에 의해 고립 된 섬유 아세포의 표현 프로파일을 발표했다. 이 프로토콜이 성공적으로 피부, 유방, 췌장과 폐 조직에서 섬유 아세포의 매우 풍부한 인구를 분리 및 프로필하기 위해 수행되었다. 또한, 우리의 방법은 작동 실험을 수행하는 문화 CAFs하려고 할 때 종종 큰 장애물입니다 종양 세포에 의한 오염을 방지하기 위해, 정렬 세포의 배양 할 수 있습니다.

조직 섬유 아세포의 높은 풍부한 인구의 고립 된 섬유 아세포 결과의 표시로 PDGFRα을 사용합니다. 정렬 후 순도의 수준은 후 정렬 분석 (그림 2A)에 의해 정량 99 %이다. 셀 - 특정 제어 유전자의 상대적 표현 (그림 2B)에 의해 비 섬유 아세포 세포를 오염 수의 비율을 추정하는 것은 일반적으로 0.1-0.6 %의 오염을 보여줍니다. 순도 수준은 절연 섬유 아세포 9 고품질의 transcriptome 프로파일 할 수 있습니다. 유방 땀샘에서 조직의 섬유 아세포의 비율은 정상 유방 조직에서 5-20%, 그리고 MMTV-PyMT 종양의 1-5% 사이에 다릅니다. 종양 조직에서 섬유 아세포의 상대적 비율은 상피 구획의 대규모 확장으로 인해 섬유 아세포의 총 수 증가에도 불구하고, 사전 neoplastic 조직에 비해 낮습니다. 종양 조직에서 분리 섬유 아세포의 감소 %도의 결과입니다기술적 어...

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

암 관련 섬유아세포(cancer-associated fibroblasts, CAFs)는 많은 암, 특히 유방암의 종양 기질 내에서 가장 두드러진 세포 유형이며, 이들의...

본 절차의 목적은 신선한 조직에서 정상 섬유아세포와 암 관련 섬유아세포를 분리하는 것입니다. 이를 위해 먼저 유선을 해부합니다. 두 번째 단계는 유선을 준비하여 단일 세포 현탁액을 만들고, 이어서 섬유아세포 특이적 항체 및 다른 세포군에 특이적인 항체를 사용하여 세포를 유지시키는 것입니다.마지막 단계는 형광 활성화 세포 분리법(fluorescence activated cell sourcing, FACS)을 수행하는 것입니다. 최종적으로, 분리된 세포군에서 발현되는 특정 마커의 qRT-PCR 발현 프로파일링을 통해 분리된 세포군의 순도를 평가합니다. 섬유아세포 분리를 위한 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 섬유아세포의 유전자 발현 프로파일을 변화시킬 수 있는 조직 배양 단계를 생략하면서도 면역 세포나 상피 세포의 오염을 최소화하여 대부분의 조직 섬유아세포를 분리할 수 있다는 점입니다.이 기술의 함의는 모든 유방암 치료로 확장됩니다. 분자 표적을 이해하고 식별하는 것은 유방암 진행을 억제하고 환자의 생존 기간을 연장하며, 궁극적으로 개인별 맞춤형 치료 옵션을 개선하고 조정하는 새로운 조합론적 접근법을 제공할 수 있기 때문입니다. 귀하의 시야에서 랩 매니저인 Dr. Lena가 단독으로 절차를 시연할 것입니다. 이 절차를 시작하려면, 안락사시킨 암컷 마우스를 스티로폼 표면 위에 등으로 눕히고 25 gauge 바늘을 사용하여 네 다리를 단단히 고정하십시오.포셉을 사용하여 마우스에 70% ethanol을 충분히 분사합니다. 중앙선에서 복부 피부를 들어 올리고 날카로운 가위로 절개창을 만들어 작게 절개합니다. 복강과 흉강을 찌르지 않도록 주의하며 동물의 목까지 피부를 절개합니다.중앙 절개선에서 다리 방향으로 뒷다리의 피부를 절개하여 Y자 모양이 되게 합니다. 다음으로, 피부를 생쥐의 몸체에서 잡아당겨 핀으로 고정함으로써 피부 아래쪽에 부착된 유선을 노출시킵니다. 이 과정에서 가장 주의해야 할 점 중 하나는 근육 조직이 함께 제거되지 않도록 하는 것입니다.이러한 문제를 방지하기 위해, 근육 조직과 인접한 두 번째 유선은 제외하고 네 번째와 다섯 번째 유선만 채취하겠습니다. 면봉을 사용하여 유선을 피부에서 부드럽게 분리하는 동시에, 작고 날카로운 가위로 결합 조직을 절개하여 유선을 마우스의 척추 방향으로 분리하고, 발견되는 괴사 부위는 모두 제거하십시오. 적출한 유선은 얼음 위에 놓인 PBS에 넣으십시오.제모 과정을 거치지 않고 피부 조직을 얻는 가장 쉬운 방법은 마우스의 귀를 사용하는 것입니다. 날카로운 가위로 안락사시킨 마우스의 양쪽 귀를 절단하십시오. 절단한 귀는 즉시 얼음 위에 놓인 소량의 PBS가 담긴 소화 용기에 넣으십시오.유선 단일 세포 현탁액을 준비하려면, 얼음 위에 놓인 소량의 PBS가 담긴 소화 용기에서 곡선 가위를 사용하여 유선을 완전히 잘게 다진 후, 다져진 조직에 20 mL의 콜라게나제 용액을 첨가합니다. 이 정도 양의 콜라게나제 용액은 최대 15마리 생쥐의 약 5 g에 해당하는 유선 또는 종양 조직 및 귀 조직을 효율적으로 분리할 수 있습니다. 즉시 37 °C 항온수조 내의 교반기에 놓고 중간 속도로 교반하며 15분 동안 배양한 다음, 30 mL의 차가운 10% FCS 함유 DMEM을 가하여 반응을 중단시킵니다.다음으로, 50 milliliter 원심분리관 위에 놓인 70 micron 셀 스트레이너를 통해 조직과 배지 혼합물을 걸러냅니다. 원심분리관을 4 °C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 희생 전 마우스의 심장에 PBS로 관류를 수행하지 않은 경우, 면역 염색 전에 샘플 내의 적혈구를 용해시켜야 합니다.섬유아세포 및 기타 세포군을 염색하기 전에 내인성 Fc를 차단해야 합니다. 세포를 1~3 mL의 FACS buffer 1에 재현탁한 다음, Fc block을 1:50로 희석하여 첨가하고 얼음 위에서 10~20분 동안 배양합니다. Fc block을 세척하여 제거할 필요는 없습니다. 100 µL의 세포 분주액을 미염색 대조군 및 단일 색상 대조군으로 사용할 Eppendorf 튜브로 옮깁니다.본 시연에서 사용되는 형광 항체의 수에 따라, anti PDGF receptor alpha에 대해 두 종류의 형광 항체를 사용하여 섬유아세포를 라벨링합니다. 이는 1:50 희석 배율로 형광체에 직접 접합되어 분류 샘플 및 다른 세포 집단을 라벨링하기 위한 단일 색상 대조군에 첨가됩니다. 표면 마커에 적절한 형광 접합 항체를 마찬가지로 1:50 희석 배율로 첨가하십시오.면역 세포 및 상피 세포 항체를 포함하여 적절한 단색 대조군 튜브에도 항체를 추가하는 것이 권장되며, 이를 통해 이중 양성 집단을 배제함으로써 분리된 섬유아세포의 순도를 높일 수 있습니다. 그다음, 세포를 항체와 함께 얼음 위 암소에서 1시간 동안 배양하십시오. 1시간 후, 튜브에 FACS buffer 1을 채우고 4°C에서 450 ×g로 5분간 원심 분리하여 세포를 세척하십시오. 상층액을 흡입하여 제거한 후, 사용할 FACS 소터로 분리하기에 가장 적절한 농도가 되도록 FACS buffer 1로 세포를 재현탁하십시오. 표지된 세포를 필터 캡이 있는 FACS 튜브로 옮기고, 세포 덩어리를 방지하고 사멸 세포를 배제하기 위해 튜브 내에서 세포를 필터링하십시오.염색하지 않은 대조군을 제외한 모든 샘플에 DPI를 처리합니다. FACS 분석 동안 샘플을 얼음에 보관하십시오. 이 절차를 시작하려면, FACS 소터 소프트웨어를 사용하여 형광 설정, 획득 설정 및 유체역학적 드롭 설정을 준비하십시오.세포 분리기로 로딩하기 전에 각 샘플을 짧게 볼텍싱하여 세포를 재부유시킵니다. 먼저 염색되지 않은 샘플을 분석하여 전체 세포 집단에 대한 게이팅을 설정함으로써 세포 부스러기를 제거하고, 자가형광 또는 배경 염색을 확인합니다. 다음으로, 염색되지 않은 샘플에 DPI를 추가하여 분석함으로써 전체 세포 집단에서 살아있는 세포 집단을 결정하고 게이팅합니다.각 단일 색상 대조군을 분석하여 보정(compensation)과 같은 파라미터를 결정하고 교정하십시오. 염색된 샘플을 분석하여 분리를 위한 게이트의 위치를 정의하십시오. 원하는 세포 집단에 대한 파라미터와 게이트 설정이 완료되면, 표지된 세포 집단을 배양액 또는 RNA 용해 버퍼가 담긴 eph 튜브나 15 milliliter 원추형 튜브로 분리하기 시작하십시오.분리가 완료된 직후, 세포를 원심 분리하여 신선한 배지 또는 RNA 용해 버퍼로 옮깁니다. 실험 목적에 따라 분리된 섬유아세포를 배양해야 하는 경우, 반드시 콜라겐 코팅 플레이트에 분주하고 플라스틱에 직접 분주하지 마십시오. 플라스틱에 직접 분주하면 섬유아세포가 활성화되어 유전자 발현의 변화가 일어날 수 있습니다. PDGF 수용체 알파를 섬유아세포 마커로 사용하면 조직 섬유아세포가 매우 농축된 집단을 분리할 수 있습니다.본 예시에서는 마우스 유선 조직의 단일 세포 현탁액을 PDGF receptor alpha 및 F four 80 항체로 염색하였습니다. 왼쪽 패널에는 FACS 소팅 플롯이 표시되어 있으며, P two는 섬유아세포 게이트, P four는 대식세포 게이트입니다. 소팅된 섬유아세포(오른쪽 패널)와 대식세포(가운데 패널)의 순도를 결정하기 위해 소팅 후 분석을 수행하였습니다.다음 그림은 섬유아세포, 면역세포 및 상피세포의 세포 특이적 대조 유전자에 대한 Q-R-T-P-C-R을 통한 소스 순도 분석 결과를 보여줍니다. 결과는 두 개의 하우스키핑 유전자인 ga, DH 및 mgus로 정규화되었으며, gap에 대한 상대적 발현량으로 표시되었습니다. 이러한 분석에서는 일반적으로 0.1~0.6%의 오염도가 나타납니다.이 정도의 순도는 분리된 섬유아세포의 고품질 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다. 분류되지 않은 유선 섬유아세포 집단에서 PDGF receptor alpha 발현량을 정량화한 결과, 유선 내 전체 조직 섬유아세포의 약 85%가 PDGF receptor alpha 양성인 것으로 나타났습니다. 저는 분리하였습니다.섬유아세포는 분리 후 즉시 배양할 수 있으나, 회복하는 데 며칠이 소요될 수 있습니다. 일차 섬유아세포는 증식 과정에서 노화가 진행되므로, 이후의 모든 실험은 계대 배양 횟수가 적은 세포를 사용하여 수행하는 것이 필수적입니다. 배양 시, 이 기술을 완전히 익히고 적절하게 수행한다면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다.분리된 세포를 배양하려는 경우에는 모든 과정을 멸균 조건 하에서 수행하는 것이 중요합니다. 본 영상에서는 멸균 분리 과정을 수행하지 않았습니다. 이 영상을 시청하고 나면 신선한 조직에서 고순도로 농축된 섬유아세포 집단을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여 인간의 림프 기형 낭종 같은 선박과 포피 선을 긋고있는 림프 내피 세포를 분리하는 것입니다. 이후 세포 배양하고이 세포의 확장, 유전 단백체, 기능 및 세포 분화 연구를위한 실험적인 새로운 수준의 정교한을 허용합니다.

다중 매개 변수 형광 활성화 된 셀 정렬하여 인간의 림프 내피 세포의 분리

섬유아세포 행동은 다양한 임상 개체의 기초가 되지만, 주로 내재된 이질성으로 인해 특성화가 제대로 이루어지지 않은 상태로 남아 있습니다. 전통적인 섬유아세포 연구는 체외 조작, 생체 내 섬유아세포 거동 마스킹에 의존합니다. 세포 배양이 필요하지 않은 마우스 피부 섬유아세포의 분리를 위한 FACS 기반 프로토콜에 대해 설명합니다.

FACS에 의해 쥐 피부 섬유 아세포 격리

여기에서는 MF 표현형을 가진 동결된 위, 소장 및 결장 조직 생성 세포에서 1차 섬유아세포/근섬유아세포(MF) 배양을 분리하고 확립하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 세포는 CD90, α-SMA 및 비멘틴을 발현합니다. MF는 효소 활성 및 사이토카인 생산을 포함한 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리

이 원고는 인간의 피부에서 유 두와 망상 섬유 아 세포를 분리 하기 위한 FACS 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이는 시험관 문화를 우회 하 고,이는 일반적으로 사용 되는 격리 프로토콜을 통해 명시적으로 불가피 한 것 이었습니다. 발산 된 섬유 아 세포 서브 세트는 기능적으로 구별 되 고 진 피 내에서 차별적 유전자 발현 및 국 소화를 표시 한다.

형광 활성 세포 선별에의 한 인간의 피부에서 유 두 및 망상 섬유 아 세포의 분리

우리는 초보자 (예를 들어, 학생)에 의해 수행 할 수있는 쉽고 빠르고 신뢰할 수있는 방법으로 기본 성인 섬유 아아세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 절차는 효소 조직 소화와 기계적 동요를 초음파와 결합하여 1 차 섬유 아아아를 얻습니다. 프로토콜은 특정 실험 요구 사항(예를 들어, 인간 조직)에 쉽게 적응될 수 있다.

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

이 논문은 삼중 음성 유방암의 합성 뮤린 모델과 종양 미세 환경을 대상으로 설계된 새로운 나노 입자의 전임상 연구를위한 응용 프로그램에서 1 차 암 관련 섬유 아세포의 격리 및 배양에 대한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다.

표적 나노 입자의 연구를 위한 유방암의 합성 Murine 모형에서 1 차적인 암 관련섬유세포의 격리

섬유-지방형성 전구세포(FAP)와 근육 줄기세포(MuSC)의 정확한 식별은 생리학적 및 병리학적 조건에서 생물학적 기능을 연구하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스 근육에서 FAP 및 MuSC의 분리, 정제 및 배양에 대한 지침을 제공합니다.

교란되지 않고 손상된 마우스 골격근에서 섬유 지방 형성 전구 세포 및 근육 줄기 세포의 FACS 분리 및 배양

다세포 3D 종양 스페로이드는 폐 선암 세포, 섬유아세포 및 단핵구로 준비한 후 이러한 스페로이드에서 암 관련 섬유아세포(CAF)를 분리했습니다. 분리된 CAF를 정상 섬유아세포와 비교하여 미토콘드리아 막횡단 전위, 활성 산소 종 및 효소 활성을 연구하여 미토콘드리아 건강을 평가했습니다.

3D 다세포 폐 종양 스페로이드에서 분리된 암 관련 섬유아세포의 미토콘드리아 건강 평가

이 프로토콜은 근치적 전립선 절제술에서 섬유아세포를 분리, 확장 및 불멸화하기 위한 포괄적인 절차를 제공합니다. 또한, 섬유아세포-종양 세포 누화의 기능적 효과를 평가하기 위해 개발된 분석법을 설명하며, 조건화된 배지를 사용한 치료와 공동 배양을 모두 활용합니다.

전립선암 관련 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화

배우세요 FACS를 이용해 신선한 조직에서 정상 및 암 관련 섬유아세포를 분리하는 방법입니다. PDGFRα 표면 마커를 활용하여 면역세포나 상피세포 오염을 최소화하고 높은 순도의 세포 집단을 확보할 수 있습니다.

형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

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