Name: 정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: 배우세요 SENP1 프로테아제 동역학을 정량 분석하는 단일 단계 FRET 분석법을 사용하여 pre-SUMO1 가수분해를 실시간으로 측정하는 방법을. 이 기법은 효소 활성 연구에 활용됩니다.

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우리는 귀중한 조언 빅터 GJ 로저스 매우 감사하고 있습니다. 우리는 아주 가까운 공동 작업에이 연구에 도움 리아 그룹의 구성원 모두들 감사합니다. 이 연구는 국립 보건원 (JL에 부여 AI076504)에 의해 지원되었다.

1. 플라스미드 구조 <ol><li> PCR에 의해 유전자의 오픈 읽기 프레임을 증폭하고, PCRII-TOPO 벡터로 PCR 제품을 복제. </li><li> 시퀀싱하여 제품을 확인하고, 복제 cDNA 인코딩 CyPet - (사전 SUMO1) YPet, CyPet - SUMO1, YPet 및 N-터미널 hexahistidine 태그와 pET28 (b)는 벡터에 SENP1의 촉매 도메인입니다. </li></ol> 2. 단백질 표현과 정화 <ol><li> pET28로 변형 BL21 (DE3)의 대장균 세포를 변환 (B) CyPet - (사전 SUMO1) YPet, CyPet - SUMO1, YPet 및 SENP1의 촉매 도메인을 인코딩 벡터. </li><li> 600 나노 미터에서 0.5의 광학 밀도에 도달 할 37 ° C (250 rpm으로 흔들어)에서 3 시간에 2xYT 매체에 변형 박테리아를 성장. </li><li> 이소 프로필-β-D-thiogalactoside (IPTG) (최종 농도)은 단백질 식을 유도 25 16 시간에 흔들 ° C를 200 rpm으로하여 100 μM을 추가합니다. </li><li> centrifug하여 박테리아를 수확4에 10,000 RPM에서 ation ° 5 분, 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 5 MM 이미 다졸의 버퍼에서 그들을 resuspend을위한 C. </li><li> MiSonics 4000 sonicator를 사용하여 25 W의 전력 설정에서 5 초 간격으로 10 분의 세포를 Sonicate와 4에서 35,000 XG에서 원심 분리하여 수집 ° C를 30 분에. </li><li> 1 L의 문화 500 ML 니켈 NTA 비즈과 열을 설정하고 열에 표면에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 500 MM NaCl, 그리고 두 번 10 MM 이미 다졸의 버퍼로 수지를 씻으십시오. </li><li> 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 500 MM NaCl, 500 MM 이미 다졸, 20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 1 MM dithiothreitol (DTT)에서의 버퍼로 투석의 버퍼와 Elute 단백질 4 ° C 하룻밤. </li><li> 브래드 포드 분석하여 정화 단백질의 농도를 결정합니다. 단백질 농도 측정을위한 대체 방법은 SDS-PAGE 젤 전기 영동이 될 한 후 Coomassie 파란색으로 물들 예정 영상과 함께 다음양적. </li></ol> 3. 양적는 스펙트럼 분석 안달 <ol><li> 분석을위한 일반적인 전략은 (그림 1) 신호 걱정을 기반으로했다. 초조 한 쌍​​은 CyPet 및 YPet은 사전 SUMO1 때문에, 각각 N-및 C-말단에 태그되었습니다. SENP1 cleaves는 퓨전 SUMO1의 C-말단에있는 Gly-Gly 사이트에서 단백질 CyPet - (사전 SUMO1) YPet하고, 따라서 YPet와 스모 꼬리를 출시. 이 신호가 CyPet에서 방출의 증가와 CyPet 여기 파장에서 YPet의 방출의 극적인 감소의 결과로, 중단되어 걱정. </li><li> 절대 걱정 유도 YPet의 방출, CyPet 직접 방출하고 YPet 직접 배출 (그림 : 530 nm의에서 파장의 빛에 의해 414 nm 정도의 총 형광 방출 CyPet - (사전 SUMO1) YPet을 흥분 시절 세 번의 소스에서 파생 될 수 2). </li></ol><img alt="수식 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> 곳 FL 414분의 530 &lt;/ 서브&gt; 414 nm의에서 흥분 530 나노 미터의 총 형광 방출는, FL는 걱정은 절대이 신호를 안달이고, FL CyPet (cont)은 414 nm의에서 흥분 CyPet 직접 방출하며, FL YPet (cont)는 YPet입니다 414 nm의에서 흥분 할 때 방출을 지시. 의 첨자 (cont)는 기부금을 의미합니다. <ol start="3"><li> α의 일정한 비율로 414 nm의에서 흥분 할 때 530 nm의에서 CyPet의 직접 방출 475 nm의에서의 방출에 비례했다. CyPet - SUMO1은 50의 농도, 100, 200, 500, 750 nm의에서 준비 1 ㎜되었습니다 , 그리고 475와 530 nm의에서 배출은 α (그림 3-1) 결정하기 위해 414 나노 미터의 여기 이후에 측정 하였다. </li><li> β의 일정한 비율로 475 nm의에서 흥분 할 때 414 nm의에서 여기에 따라 530 nm의에서 YPet의 직접 배출량은 530 nm의에서의 방출에 비례했다. YPet 50의 농도, 100, 200, 500, 750에 준비되었다샘플 β (그림 3-2)을 결정하기 위해 414의 파장과 475 nm의에 의해 흥분했을 때 차 1,000 NM 및 530 nm의에서 방출이 측정되었다. </li><li> CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 SENP1에 의해 소화되었을 때, 절단은 CyPet - SUMO1과 YPet과 SUMO1 꼬리를 발표했다. 화합물은 414 nm의에서 흥분했을 때, 530 nm의 (FL &#39;414분의 530)에서 형광 방출이 감소되었지만 여전히 같은 세 부분으로 나눌 수 있습니다 : </li></ol><img alt="수식이" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> FL &#39;414 nm의에서 흥분하면 414분의 530이 소화 후 530 nm의에서 총 형광 방출이며, FL&#39;어디 남은 절대 걱정 신호 걱정, FL &#39;CyPet (414분의 475)이 때 소화 후 475 nm의에서 CyPet 방출입니다 414 나노 미터 (여기서 CyPet 방출이 두 부분에서입니다 CyPet - (사전 SUMO1) YPet 소화되지 않은 및 CyPet-SUMO1을 소화)에 흥분하고, FL YPet(475분의 530)는 CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 소화 여부를 일정 475 나노 미터에 흥분 YPet 방출입니다. <ol start="6"><li> SENP1로 소화 한 후, 나머지는 방출 (FL의 &#39;안달가)입니다 초조해 : </li></ol><img alt="수식 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> C는 CyPet - (사전 SUMO1) YPet하고, x의 총 농도입니다 것은 소화의 농도 CyPet - (사전 SUMO1) YPet입니다. <ol start="7"><li> 모든 항목을 결합하여, 414 nm의 (FL &#39;414분의 530)의 흥분에 따라 530 나노 미터에서 감지 형광 방출은 다음과 같습니다 : </li></ol><img alt="수식 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. 효소 키네틱 연구에 대한 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석 <ol><li> CyPet - (사전 SUMO1) YPet은 (20 MM 트리스 - HCL (산도 7.4), 50 MM NaCl, 0.1 %의 버퍼에 37 ° C에서 SENP1의 촉매 도메인 incubated되었습니다 V /V) 십대 초반-20 80 ML의 총 양이 1 ㎜의 DTT와 384도 판으로 이동. </li><li> 실행은 15 초 간격으로 5 분을위한 형광 multiwell 판 리더의 414 nm의에서 여기 이후 475과 530 nm의에서 형광 방출을 측정하여 실시되었다. </li><li> 반응 속도 (V)가 같은 기판 (S)의 양의 변화와 상관되었습니다 </li></ol><img alt="수식 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> 제품의 농도가로 0에서 기하 급수적으로 증가 [S] 0 (원래 기판 농도) 때 t = 0 : </li></ol><img alt="수식 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> t = 0은 원래 속도 (V 0) 경우 : </li></ol><img alt="수식 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> concSENP1의 entration가 해결되었습니다, 그리고 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 농도는 Michaelis-Menten 방정식에 필요한 효소의 농도보다 100 배 이상에서 증가되었다. </li><li> 형광 판독의 모든 정량 안달 분석 방법으로 분석하고 Michaelis-Menten 방정식에 맞게 GraphPad 프리즘 V 소프트웨어에 역모를했다. 비선형 회귀은 스프레드 시트 프로그램 (Microsoft Excel과 같은)과 같은 일반적인 소프트웨어 패키지의 도움으로 수행 할 수 있습니다. </li></ol> 5. 대표 결과 SENP1의 사전 SUMO1의 성숙이 과정에서 475과 530 nm의에서 형광 신호의 변화를 모니터링하여 결정 할 수 있습니다. 결과는 보여 그 기판 - 복용에 의존 방식으로 SENP1의 사전 SUMO1 소화의 속도 (그림 4). 이 제안 사전 SUMO1의 성숙을위한 SENP1의 촉매 도메인 전시 우수한 활동을 그. 초기 reac기의 속도는 다른 기판 농도 (표 1) 위의 분석에 의해 계산되었다. K 고양이 / K M 비율은 일반적으로 하나의 기판 또는 다른 기판과 특정 효소와 다른 효소의 효율성을 비교하는 데 사용됩니다. K M과 V 맥스 해당하는 다양한 초기 속도를, 음모에 의해 Michaelis-Menten 방정식에서 구할 수 있습니다 . CyPet - (사전 SUMO1) YPet는 (그림 5) K 고양이가로 얻은의 다른 농도로 : <img alt="수식 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> 위의 분석에 따르면, 계산 된 K M은 0.21이었다 ± 0.04 μM, K의 고양이는 ± 0.28 초 -1 6.90이었고, K 고양이 / K M 비율은 (± 0.55 3.2)였습니다 X10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> 그림 1. SENP의 사전 SUMOs 성숙을위한 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석 그래프. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> 그림 2. 기증자, 수용체와 걱정의 공헌 등의 형광 신호의 정량 분석. CyPet-414 나노 미터에서 여기에 따라 (예정 SUMO1) YPet. FL CyPet (414분의 530)에서 방출 스펙트럼의 해부 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 CyPet의 방출, FL가 걱정하는 걱정 유발 YPet의 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 방출, 그리고 FL YPet이 (414분의 530) 414 nm의 여기에 따라 530 nm의에서 YPet의 방출이다입니다. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3. 방향으로 방출 계수 α와 β의 계산. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> 그림 4. SENP1의 촉매 도메인의 다른 비율에 의해 소화 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 정량 분석. 반응은 처음 5 분 안에 모니터했다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> 그림 5. SENP1로 CyPet - (사전 SUMO1) YPet의 소화 Michaelis-Menten 그래픽 분석. 데이터는 역모와 GraphPad 프리즘 V 및 비선형 회귀하여 분석 하였다. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (μM) </td><td> V 0 (μM / s)의 </td></tr><tr><td> 0.115 </td><td> 0.0023 ± 0.00005 </td></tR&gt; <tr><td> 0.214 </td><td> 0.0028 ± 0.00004 </td></tr><tr><td> 0.407 </td><td> 0.0033 ± 0.00007 </td></tr><tr><td> 0.594 </td><td> 0.0037 ± 0.00013 </td></tr><tr><td> 0.725 </td><td> 0.0043 ± 0.00012 </td></tr><tr><td> 1.471 </td><td> 0.0051 ± 0.00036 </td></tr><tr><td> 1.899 </td><td> 0.0050 ± 0.00031 </td></tr><tr><td> 2.300 </td><td> 0.0050 ± 0.00062 </td></tr></tbody></table> 표 1. SENP1에서 미리 SUMO1의 성숙의 초기 속도 결정. 각 기판 농도에는, 4 샘플은 소화를 측정하기 위해 사용되었다. 표준 편차는이 네 샘플 변형에서 왔어. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (μM) </td><td> K 고양이 (S-1) </td><td> K 고양이 / K M (M -1 • S-1) </td></tr><tr><td> 0.21 ± 0.04 </td><td> 6.90 ± 0.28 </td><td> 3.2 ± 0.55 × 10 7 </td></tr></tbody></table> 표 2. 양적으로 SENP1에서 미리 SUMO1의 성숙의 키네틱 매개 변수 분석을 초조해. 표준 편차는 각 기판 농도에 포함 된 네 개의 샘플에서 왔어.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-RING+for+SUMO%3A+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li>
<li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeSUMOylating+enzymes-SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li>
<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
<li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

걱정 기술은 SENP1 9 미리 SUMO1의 성숙을 연구하는 데 사용되었습니다. CFP-YFP는 기증자의 배출량에 대한 수용체의 비율입니다 걱정 쌍과 ratiometric 분석으로 사용 된 운동 속성을 특징하는 데 사용되었다. 그러나, 기존의 ratiometric의 자체 형광는 분석을 걱정 기증자와 수용체 전혀 고려가 없습니다. 비율은 직접 소화 기판의 양이 서로 관련이되지 않습니다. 여기 SENP1에 의해 사전 SUMO1의 성숙의 운동을 연구하는 개발 고감도 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을보고합니다. 이전 ratiometric 접근 대조적으로, 우리는 근본적으로 기증자와 수용체에서 자기 형광의 정량적 기여를 결정하여 운동 매개 변수를 도출하기 위해 운동 분석 및 실험 절차에 대한 신호를 걱정의 새로운 이론과 방법을 개선하고, 실제는 초조해 - 유도 수용체의 방출. Ratiometric 분석이 작업을 수행 할 수 없습니다.기증자와 수용체의 자체 형광 방...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> PCR II TOPO 키트 </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> 연구 제품 Internationa.l 주식회사 </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> 니켈 NTA Agrose </td><td> 열 과학 </td><td> 88,222 </td></tr><tr><td> Coomassie 플러스 (브래드 포드) 검정 리젠트 </td><td> 열 과학 </td><td> 23,238 </td></tr><tr><td> 384 잘 플레이트 (유리 아래) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 판 리더 </td><td> 분자 장치 </td><td></td></tr></tbody></table>

정량은 senp1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

ubiquitin 또는 ubiquitin 같은 단백질 (Ubls)과 단백질의 치료 posttranslational 수정은 널리 동적으로 단백질의 활동을 조절하고 다양한 생물학적 과정에서 다양한 역할을 수행하는 데 사용됩니다. 예를 들어, 스모는 covalently 세포주기 조절, 세포 생존과 죽음, DNA 손상 반응 및 스트레스 반응 1-5 등 많은 세포 과정에 중요한 역할을 갖춘 대형 번호 또는 단백질을 수정합니다. SENP는 스모 특정 단백 분해 효소로, 스모 전구체의 성숙에 endopeptidase 또는 isopeptidase의 기능은 대상 단백질에서 스모를 제거하고 SUMOylation주기에게 1,3,6,7를 새로 고칠 수 있습니다. 효소의 촉매 효율이나 특이성은 가장 운동 상수, K 고양이 / K M의 비율이 특징입니다. 여러 연구에서, 스모 - SENP 쌍의 운동 매개 변수가 힘이에요, polyacrylamide 젤 기반 서양 얼룩 등의 다양한 방법에 의해 결정되었습니다ioactive - 라벨 기판, 형광 화합물 또는 단백질이 기판 8-13를 표시. 그러나, &quot;네이티브&quot;단백질을 사용하지만 polyacrylamide - 젤 기반 기술은 힘든 및 기술적 요구이며, 그 즉시 자세한 정량 분석​​에 자신을 빌려하지 않습니다. ACC (7 - 아미노-4-carbamoylmetylcoumarin) 또는 AMC (7 - 아미노-4-methylcoumarin) 형광과 tetrapeptides 또는 단백질을 사용하여 연구에서 K 고양이 / K M을 획득 자연 기판보다 크기 낮은 최대 두 명령 중 하나였다 또는 명확하게 SENPs의 ISO와 endopeptidase 활동을 차별화 할 수 없습니다. 최근, 아가야 기반의 단백 분해 효소 assays는 시안 형광 단백질의 걱정 쌍 (CFP)와 황색 형광 단백질 (YFP) 9,10,14,15과 deubiquitinating 효소 (DUBs) 또는 SENPs을 연구하는 데 사용되었습니다. 단백 분해 효소 교류를위한 신호 모니터를 안달을 위해 기증 방출에 대한 수용체 방출의 비율은 양적 매개 변수로 사용되었다tivity 결정. 그러나,이 방법은 수용체 및 공여체 자기 형광하여 수용체와 기증자 방출 파장에서 신호 교차 contaminations을 무시하기 때문에 정확한 아니 었습니다. 우리는 SENP1에 의해 사전 SUMO1 성숙의 운동 매개 변수를 결정하는 매우 중요한 소설 및 정량 걱정 기반의 단백 분해 효소 분석을 개발했습니다. 엔지니어링은 크게 향상 걱정 효율성과 형광 양자 수율과 쌍 CyPet 및 YPet을 걱정 CyPet - (사전 SUMO1) YPet 기판 16을 생성하는 데 사용되었습니다. 우리는 차별화와 기증자와 수용체에 의해 공헌 각각의 수용체와 방출 파장에서 걱정 절대 형광 신호를 정량화. K 고양이 / K M의 값은 SENP1의 X10 7 M -1의 -1은 일반적으로 효소 운동 매개 변수 계약에 사전 SUMO1 방면 (3.2 ± 0.55)로 얻은 것입니다. 따라서이 방법은 유효하고 사용할 수 있습니다SA 일반적으로는 다른 프로테아제를 특징 접근한다.

걱정의 정량 분석​​ (포스터 공명 에너지 전송) 신호를 포함하는 새로운 방법을 효소 반응 속도론을 연구에 설명되어 있습니다.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt;와<em&gt; K<sub&gt; 고양이</sub</em&gt;은 (작은 Ubiquitin과 같은 수정) 사전 SUMO1에 SENP1 (스모 / Sentrin 특정 단백 분해 효소 1) 촉매 도메인의 가수 분해에 대한 획득했다. 이 양적 - 안달 기반 프로테아제 운동 연구의 일반적인 원리는 다른 프로테아제에 적용 할 수 있습니다.

정량은 SENP1 단백 분해 효소 반응 속도론 결정에 대해 (포스터 공명 에너지 전송) 분석 안달

유비퀴틴 또는 유비퀴틴 유사 단백질(Ubl)을 이용한 단백질의 가역적 번역 후 조절은 단백질을 동적으로 조절하는 데 널리 사용됩니다...

본 영상에서는 프로테아제 역학의 정량적 분석을 위한 새로운 단일 단계 FRET 분석법을 선보입니다. 다음 분석법의 일반적인 전략은 FRET 신호 분석에 기반합니다. 여기서는 FRET 쌍인 CyPe와 YPe가 온전한 기질 내 pre SUMO-1의 N-말단과 C-말단에 각각 부착되어 CyPe와 YPe가 근접한 상태로 배치되어 있습니다.이 분자를 414 nanometers에서 들뜨게 하면, 방출 신호의 대부분은 530 nanometers에서 나타납니다. 그러나 SENP 1 프로테아제가 첨가되면, 기질이 Sumo 1 C-말단의 Gly glyc 부위에서 절단되어 CIPA와 wpa가 분리됩니다. 이제 414 nanometers에서 들뜨게 하면, 관찰되는 방출 신호의 대부분은 475 nanometers에서 나타납니다.이 반응의 역학을 평가하기 위해, 5분 동안 15초 간격으로 형광 방출을 측정합니다. 결과로 얻은 형광 데이터를 분석하면 SENP1 프로테아제에 의해 cype pre sumo 1 ype 기질이 소화되는 속도를 알 수 있습니다. 형광 펩타이드 기질을 이용한 기존의 질량 분석, 방사성 측정 분석 또는 웨스턴 블롯 분석과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 단일 단계의 실시간 분석으로 실시간 역학 파라미터를 결정할 수 있다는 점입니다.이 기술의 영향은 암 및 대사 질환과 같이 단백질이 관여하는 질병의 치료 및 진단으로 확대됩니다. 이 기술은 다양한 단백질 및 그 억제제 발견을 위한 정밀하고 고효율의 분석을 제공할 수 있으며, 질환 과정을 입증하는 특성 분석을 수행할 수 있습니다. 본 절차는 이 방법과 절차를 처음으로 개발한 저희 연구실의 ENUA 대학원생이 진행하겠습니다. Cype ype pre sumo one, mature sumo one 및 SENP one 촉매 도메인의 오픈 리딩 프레임을 PCR로 증폭하여 이 절차를 시작하십시오.결과물을 PCR two topo vector에 클로닝합니다. 다음으로, 시퀀싱을 통해 유전자의 서열이 정확한지 확인합니다. 그 후, CYPE pre sumo one ype cype sumo, one ype 및 SENP one의 촉매 도메인을 인코딩하는 CD NA를 N-말단 Polyhis tag이 포함된 PET 28 B vector에 클로닝합니다.유전자가 벡터로 클로닝된 후, 전기천공법을 이용하여 이를 Escherichia coli BL21(DE3)에 형질전환합니다. 형질전환된 박테리아를 고체 배지에 도말한 후, 단일 콜로니를 선택하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음으로, 형질전환된 박테리아를 1:100의 비율로 2 L 플라스크에 담긴 2X YT 배지에 접종합니다.배양액을 37°C에서 250 RPM으로 흔들어 3시간 동안 배양하여 600nm에서 흡광도(OD) 0.5에 도달하게 합니다. 단백질 발현을 유도하기 위해 IPTG를 최종 농도 100µM이 되도록 첨가하고, 25°C에서 200 RPM으로 16시간 동안 흔들어 배양합니다. 그다음, 박테리아를 250mL 원심분리 병으로 옮깁니다.그런 다음 4 °C에서 8,000 G로 5분간 원심분리하여 박테리아를 수확합니다. 원심분리 후 상층액을 제거하고 tris HCL, sodium chloride 및 ole가 포함된 용해 버퍼(lysis buffer)에 박테리아 세포를 재현탁한 후, 배양물을 50 milliliters 원심분리관으로 옮깁니다. 그다음 박테리아 세포를 파쇄하기 위해 진폭 70으로 5초 간격으로 10분 동안 세포를 초음파 처리합니다.그런 다음, 세포 잔해로부터 융합 단백질을 분리하기 위해 튜브를 4°C에서 35,000 RCF로 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 하는 동안, 배양된 세포 1L당 500 µL의 니켈 NTI 비드를 사용하여 10 mL BioRad 컬럼을 준비합니다. 원심분리가 끝난 후 용액이 컬럼에서 떨어지도록 둡니다.상청액을 새로운 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 상청액 용액을 컬럼에 붓습니다. 모든 상청액이 레진에 들어가면, tris hydrochloride sodium chloride 및 emit aole 버퍼 10 milliliters로 컬럼을 두 번 세척합니다.단백질을 용출시키기 위해, 이번에는 500 millimolar ole가 포함된 동일한 버퍼 500 µL를 첨가합니다. 통과액을 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.다음으로, 해당 용액을 분자량 컷오프 10 kilodaltons의 투석 튜브로 옮기고, 20 millimolar tris, HCL 50 millimolar sodium chloride 및 1 millimolar DTT가 포함된 1리터의 완충액에서 4°C로 하룻밤 동안 투석합니다. 투석 후, 정제된 단백질을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 Bradford Assay를 통해 정제된 단백질의 농도를 결정합니다. 이어서, 정량적 fret assay를 사용하여 SENP 1에 의해 pre sumo 1이 절단되는 속도를 평가하는 데 정제된 단백질을 사용합니다.마이크로 원심분리 튜브에 5100, 200, 500, 750 및 1000 nM 농도의 Spet Sumo one과 YA를 각각 60 mL씩 준비합니다. 이 대조군 시료들은 동일한 버퍼 내에서 cype와 YA의 직접 방출 상수 비율을 특성화하는 데 사용됩니다. 0.03 µM에서 0.9 µM 범위의 12가지 농도로 cype pre sumo one y PET를 준비하고, SENP one 촉매 도메인을 0.3 nM로 희석하여 준비합니다.형광 멀티웰 플레이트 리더를 설정하여 414 nm에서 들뜬 후 475 nm와 530 nm에서 형광 방출을 측정하고, 475 nm에서 들뜬 후 530 nm에서 방출을 측정하도록 설정합니다. 측정은 37 °C에서 2분 동안 32초 간격으로 수행합니다. 플레이트의 자체 형광을 얻으려면 빈 384웰 플레이트를 형광 분석기에 넣고 측정합니다. 플레이트의 자체 형광이 결정되면 형광 분석기의 설정을 조정하여 Cype Sumo의 경우 들뜸 파장을 414 nm로 설정하고 475 nm와 530 nm에서 측정하며, ype의 경우 들뜸 파장을 414 nm와 475 nm로 설정하고 530 nm에서 측정하도록 합니다.다음으로, 이 도식에 표시된 대로 384 웰 플레이트의 해당 웰에 cype Sumo one ype 또는 cype sumo one ype 75 µL를 3중으로 첨가합니다. 그런 다음 준비된 SENP one 5 µL를 각 웰에 첨가하여 최종 부피를 80 µL로 맞춘 후, 즉시 플레이트를 형광 광도계에 넣고 형광 측정을 시작합니다. 다음 섹션에서 설명하는 정량적 FRET 분석법을 사용하여 형광 측정값을 분석합니다.이 기술의 핵심 개념은 절대적 위협 신호를 소광과 상관관계화하는 것입니다. 절대적 위협 신호를 얻으려면, 수용체 방출 파장에서의 총 형광 방출로부터 공여체와 수용체의 직접적인 기여분을 제외해야 합니다.공여체(donor)와 수용체(acceptor)의 직접적인 기여도는 각각 공여체와 수용체의 상관계수 인자인 α와 β로부터 계산됩니다. 비디오의 이 섹션에서는 계산 방법이 어떻게 이루어지는지 상세히 설명하겠습니다. SENP1에 의한 기질 소화의 역학을 분석하려면 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하십시오. 먼저 플레이트의 배경 형광을 뺀 후, 엑셀에서 내보낸 txt 파일을 여는 것으로 시작하십시오.서로 다른 시간대에서의 소화된 기질 농도는 PrepU 공식에 의해 계산됩니다. 414 nm 파장의 빛으로 들뜨게 했을 때, 530 nm에서의 총 형광 방출은 세 가지 소스, 즉 절대적인 FRET 유도 Y pets 방출, cype 직접 방출, 그리고 wpe 직접 방출로부터 유도될 수 있습니다. 이 식에서 FL 530/414는 414 nm에서 들뜨게 했을 때 530 nm에서의 총 형광 방출을 나타내며, FL fret은 절대적인 FRET 신호를 나타냅니다.FL Spet Con은 Spet의 직접 방출이며, 414 nanometers에서 여기되었을 때 나타납니다. FL Ype Con은 Ype의 직접 방출이며, 414 nanometers에서 여기되었을 때 나타납니다. 530 nanometers에서 spet의 직접 방출은 475 nanometers에서의 방출에 비례합니다.alpha의 비율이 일정할 때 414 nanometers에서 여기시키면, 414 nanometers 여기 하에서 YA의 530 nanometers 직접 방출은 530 nanometers에서의 방출에 비례합니다. beta의 비율이 일정할 때 475 nanometers에서 여기시키며, spet pre sumo one ype가 SENP one에 의해 분해되고 414 nanometers에서 여기되었을 때, 530 nanometers에서의 형광 방출은 감소하지만, 여기에서와 같이 여전히 세 부분으로 나눌 수 있습니다.FL Prime 530/414은 소화 후 530 nm에서 측정된 총 형광 방출 값입니다. 414 nm에서 여기시켰을 때 FL Prime FRET은 남아있는 절대 FRET 신호를 의미하며, FL Prime SPET 475/414는 414 nm에서 여기시킨 후 소화 후 475 nm에서 측정된 SPET 방출 값입니다. 이 방출 신호는 소화되지 않은 CyPE-SUMO1 및 소화된 CyPE-SUMO1의 두 부분에서 발생합니다.FL Y PET 530/475은 475 nanometers에서 여기되었을 때의 방출형이며, cype pre sumo one ype의 소화 여부와 관계없이 일정합니다. SENP one에 의해 소화된 후, 남은 fret 방출은 이 식과 같이 나타나며, 여기서 C는 cype pre sumo one ype의 총 농도이고, X는 소화된 cype pre sumo one YA의 농도입니다. 모든 항목을 결합하면, 414 nanometers의 여기 조건에서 530 nanometers에서 검출된 형광 방출은 이 식으로 나타납니다. 효소 역학 연구를 위한 fret 기반 프로테아제 분석법에서, 반응 속도는 생성물의 농도가 0부터 기하급수적으로 증가함에 따라 기질 양의 변화와 상관관계를 갖습니다.여기서 보시는 바와 같이 T가 0일 때, S₀는 T가 0일 때의 초기 기질 농도를 나타냅니다. 초기 속도는 SENP1에 의한 pre-sumo의 성숙 과정입니다.공정 중 475 및 530 나노미터에서의 형광 신호 변화를 모니터링하여 결정할 수 있습니다. 여기서 알 수 있듯이, pre sumo one 성숙 속도는 기질 농도에 의존적이었으며, 이는 SENP one의 촉매 도메인이 presum O one 성숙에 대해 우수한 활성을 보임을 시사합니다. 초기 반응 속도는 서로 다른 기질 농도로 동일한 분석을 수행하여 계산되었습니다.KCAT/KM 비율은 일반적으로 하나의 기질에 대한 서로 다른 효소들의 효율성을 비교하거나, 서로 다른 기질에 대한 특정 효소의 효율성을 비교하는 데 사용됩니다. cype의 다양한 농도에 따른 초기 속도를 도식화하여 McKayla Cementin 방정식으로부터 KM과 Vmax를 구할 수 있습니다. 이 방정식을 사용하여 Pre sumo one YA kcat을 구하였습니다.위의 분석에 따르면, 계산된 KM 값은 0.21 ± 0.4 µM이었습니다. kcat 값은 6.90 ± 0.28 s⁻¹이었으며, kcat/KM 비율은 3.2 ± 0.55 × 10⁷ M⁻¹이었습니다. 둘째로, 이 영상을 시청한 후에는 본 절차에 따라 실시간 단일 단계 측정법을 이용한 새로운 정량적 지방 분석법으로 프로테아제 역학 파라미터를 결정하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.실제 겉보기 KM 또는 억제제 K와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 생성물 저해 또는 억제제 특성 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 단백질 분야의 연구자들이 정밀 유전학을 탐구하고, 광학 센서를 이용한 생리적 및 병리적 과정에 관여하는 단백질을 이해하며, 즉각적인 진단 및 신약 개발을 수행할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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생명공학

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