Zebrafish 애벌레의 Microgavage

본 절차의 전체적인 목적은 제브라피시 유충의 장관 내로 물질을 경구 투여하는 것입니다. 먼저, 유충을 마취시킨 후 메틸 셀룰로스가 도포된 주입용 몰드 위에 배치합니다. 그 다음, 유충을 몰드에 조심스럽게 담그고 가바지 바늘(gavage needle) 및 마이크로 매니퓰레이터의 각도에 맞춰 정렬합니다.

그 다음 바늘을 유충의 입에 삽입하여 장구(intestinal bulb)까지 이동시킵니다. 적절한 위치에 도달하면 물질을 강내(lumen)로 주입합니다. 마지막 단계로 메틸 셀룰로오스에서 유충을 꺼내어 마취에서 회복할 수 있도록 신선한 배지에 옮깁니다.

궁극적으로, 이 방법은 제브라피시 치어의 장관 내로 물질을 특이적으로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이를 통해 장 내 또는 장외 조직에서의 이동을 연구할 수 있습니다. 관심 물질이 포함된 물에 침지시키는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동물에게 전달되는 물질의 양뿐만 아니라 투여 시점과 용량을 엄격하게 제어할 수 있다는 점입니다. 이는 실험적 변동성을 줄여주며, 일부 경우에는 특정 물질과 관련된 독성을 감소시킵니다.

우리는 현미경으로 장 상피에서 검출 가능한 수준으로 형광 프로브를 충분히 적용하는 데 어려움을 겪었을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 고농도의 프로브는 때때로 물고사를 유발하며, 그럼에도 불구하고 이미징에 필요한 충분한 형광 신호를 생성하지 못하는 경우가 있습니다. 우선, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 가바지 바늘(gavage needles) 여러 개를 뽑아내고 실리카 유리 모세관을 준비하십시오.

실체 현미경으로 이동하여 바늘을 절단합니다. 먼저, 투명 자 또는 그래픽지의 끝단에 바늘 끝을 맞춥니다. 정렬이 되면, 미세 팁 시계 수리용 핀셋을 사용하여 바늘 끝에서 약 1mm 떨어진 지점을 절단합니다.

100배 배율로 바늘 끝을 검사하십시오. 바늘의 직경은 약 27에서 30 µm여야 하며 끝이 뭉툭해야 합니다. 일관된 결과를 얻기 위해 끝이 날카롭거나 들쭉날쭉한 바늘은 피해야 합니다.

마이크로 포지를 사용하여 바늘의 팁 끝부분을 더 정밀하게 제어하고 바늘을 화염 연마할 수 있습니다. 날카로운 모서리를 제거하기 위한 팁입니다. 다음으로, 가바지 용액을 준비합니다.

대부분의 응용 분야에서는 마이크로 인젝터의 가시성을 높이고 가바지(gavage) 용액의 배치 상태를 확인하기 위해 페놀 레드(phenol red)를 첨가합니다. 미네랄 오일을 채운 후, 가바지 바늘을 nano jet two Microinjection 장치에 장착합니다. 플라스틱 10 centimeter 페트리 접시를 바이오필름으로 감싸 평평한 방수 표면을 만들고, 파라필름 위에 가바지 용액 약 2 µL를 분주합니다.

다음 단계는 가바지 바늘(gavage needle)을 수동으로 역충전하는 것입니다. 미네랄 오일에 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오. 배출량을 보정하려면, 미네랄 오일이 채워진 작은 페트리 접시에 작은 방울들을 주입하여 크기가 일정해질 때까지 반복한 후, 그래픽 도구를 사용하여 방울의 직경을 측정하고 방울의 부피를 계산하십시오.

바늘 간의 일관성이 여기에 도식화되어 있습니다. 경구 투여를 위해 바늘을 사용하기 전, 깨끗한 제브라피시 배지로 헹구어 잔류 미네랄 오일을 제거하십시오. 아로스 몰드를 가온한 후, 3% methyl cellulose로 세 개의 홈을 덮습니다. 홈은 물고기를 고정할 수 있을 정도로만 적당히 덮어야 하며, methyl cellulose가 빠르게 마를 정도로 너무 적게 덮어서는 안 됩니다.

다음으로, 6-웰 플레이트의 각 웰에 제브라피시 배지 약 4mL를씩 분주하고, 각 실험군에 해당하는 제브라피시 치어를 서로 다른 웰로 옮깁니다. 물고기를 마취시키기 위해, 적절한 제브라피시 배지에 3배 농도의 tricaine 용액을 준비합니다. 웰 하나당 한 번씩 수행합니다.

배지에 동일한 부피의 trica 용액을 혼합하고 부드럽게 회전시켜 물고기를 마취시킵니다. 물고기가 움직임을 멈추는 즉시, 넓은 보어 글라스 팁 피펫을 사용하여 물고기를 하나씩 메틸 셀룰로오스 위에 옮깁니다. 이때 머리는 홈의 45도 각도 방향으로, 꼬리는 홈의 90도 각도 방향으로 놓이게 합니다. 둔탁한 해부용 프로브를 사용하여 각 유어를 메틸 셀룰로오스에 부드럽게 눌러 위치를 고정합니다.

다음으로, 바늘이 얕은 각도로 기울어지도록 nano jet two 미세주입 장치를 조정합니다. 확장 범위가 웰 바닥 너머까지 도달하기에 충분한지 확인하십시오. 향후 조정 필요성을 최소화하기 위해, 미세주입 장치를 slow inject 설정으로 4.6 nanoliters가 배출되도록 설정하며, 한 손으로는 고정된 유충이 담긴 플레이트를 미세하게 조정하고 다른 손으로는 미세주입 장치의 마이크로 매니퓰레이터를 조절합니다.

일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 제브라피시의 크기가 매우 작고 쉽게 손상되기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 실체 현미경 아래에서 식도 구조를 식별하고, 장관 내강에 도달하기 위해 가바지 바늘에 가해야 할 적절한 압력을 결정하려면 숙련이 필요합니다. 먼저, 마취된 물고기의 입 안으로 가바지 바늘을 조심스럽게 삽입하십시오.

식도를 통해 통과하여 식도 괄약근을 약간 누른 다음, 팁을 전장벽 바로 안쪽에 삽입합니다. 전구(anterior bulb) 내부로 진입하면, 설정된 값에 따라 물질을 천천히 주입합니다. 주입된 부피는 장의 전구를 간신히 채울 정도여야 하며, 식도나 총배설강(cloaca)으로 새어 나오지 않아야 합니다.

바늘을 빠르고 부드럽게 뽑아냅니다. 다량의 물질이 식도로 유입되지 않도록 주의하십시오. 가바지 바늘을 제거한 후, 물고기를 신선한 배지가 담긴 접시로 옮깁니다.

마취 상태의 유충을 깨우고, 신선한 배지로 여러 번 헹구어 메틸 셀룰로오스를 제거합니다. 필요한 시점까지 유충을 페트리 접시나 6웰 플레이트에 옮겨 둡니다. 이후 분석을 위해 마이크로 가바지(micro gavage)를 사용하여 제브라피쉬 실험 대상에 다양한 물질을 투여할 수 있습니다.

먼저, 이 방법의 시연을 위해 필요한 가바지(gavage) 용액을 준비하십시오. 장 상피의 장벽 무결성을 분석하기 위해 Texas Red가 결합된 10 KD dextran이 사용됩니다.

앞서 설명한 단계에 따라 각 실험 조건별로 10~20마리의 제브라피쉬 유생 그룹에 강제 투여(gavage)를 실시합니다. 가능하다면 이를 2중 또는 3중 그룹으로 반복하십시오. 투여 후 유생의 마취를 깨우고 신선한 배지에서 자유롭게 헤엄칠 수 있도록 합니다.

약 20분 후, 앞서 설명한 대로 유충을 다시 마취합니다. 마취가 되면 3% methyl cellulose를 이용하여 유충을 3% agarose 블록 위에 배치합니다. 형광 실체 현미경과 Texas red 필터를 사용하여 유충의 주둥이부터 총배설강(cloaca) 끝 바로 뒤쪽까지 보이는 배율을 선택하여 촬영합니다. 형광은 장관 내강에서 강하게 나타나야 합니다.

그러나 장벽 기능은 장외 조직에 나타나는 덱스트란의 수준으로 평가하며, 몸통의 형광을 시각화할 수 있도록 노출도를 조절합니다. 덱스트란을 단독으로 투여했을 때 루멘 형광이 과다 노출되더라도, 덱스트란은 장의 루멘 내에 유지됩니다. 반면, 상피 밀착 연접을 파괴하는 EDTA와 함께 처리한 유충에서는 덱스트란이 혈류 및 반투과성 혈관과 공간에서 관찰됩니다.

이 예시들에서는 Image J를 사용하여 제브라피시 몸통의 관심 영역(ROI) 내 상대적 평균 형광 강도를 정량화했으며, 내부 대조군으로서 물고기 외부의 ROI를 기준으로 정규화했습니다. 여기서는 일반 바늘과 마이크로 포지(micro forge) 바늘의 결과를 비교하였습니다. 덱스트린 단독 투여군에서 장외 형광을 나타내는 치어의 수가 더 적었으며, 이는 마이크로 포지 바늘이 치어에게 손상을 줄 가능성이 더 낮음을 시사합니다.

한 영역을 더 자세히 살펴보면, 덱스트란은 혈관이나 장외 공간으로 누출되지 않고 다시 장강 내로 국한되어 있는 것을 확인할 수 있습니다. EDTA가 없는 경우에는 그렇지 않으나, EDTA와 함께 투여했을 때 덱스트란이 장외 공간과 등쪽 대동맥 및 후주정맥의 강 내에서 관찰되며, 여기서 나타나는 혈액 신호는 혈류로 인한 것입니다. 이 절차를 수행할 때 바늘 끝에 거친 부분이 없는지 확인하고, 물고기가 메틸셀룰로오스 내에 안정적으로 잘 고정되었는지 확인하십시오. 또한, 유어의 식도를 통해 바늘을 조작하는 방법을 익힐 때까지 주의 깊고 인내심 있게 진행하시기 바랍니다.

이 기술은 장 내로 물질을 정밀하게 도입하거나 시각화해야 하는 제브라피시의 광범위한 응용 분야에 활용될 수 있습니다. 이를 통해 동물로의 전달 시점, 경로 및 용량을 엄격하게 제어할 수 있으며, 실험 내 및 실험 간 변동성을 크게 줄일 수 있습니다.