Name: Zebrafish 애벌레의 Microgavage (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 제브라피시 애벌레의 마이크로게이비지 기법을 통해 장관 내 물질 정밀 투여 방법을. 메틸셀룰로오스 고정과 미세조작을 활용한 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

콘텐츠에 대한 유용한 제안을 해주신 Rawls 연구실 구성원분들과, 밀착 연접의 크기 투과성 및 파괴 방법에 대해 가치 있는 논의를 나누어 주신 Alan Fanning 박사님께 감사드립니다. 또한, 공초점 현미경 지원을 해주신 Michael Hooker Microscopy Facility의 Michael Chua 박사님과 Neal Kramarcy 박사님께 감사드립니다. 본 연구는 국립보건원(NIH) 보조금 T32 DK007737-15(J.L.C. 연수생), F32 DK094592(J.L.C. 수혜), R01 DK081426(J.F.R. 수혜)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

선언된 이해상충 없음.

본 연구에서는 마이크로가바지(microgavage)를 통해 제브라피시 치어의 장으로 물질을 직접 전달하는 새로운 프로토콜을 설명합니다. 전체 과정에서 유의해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 처치와 무관한 사망을 방지하기 위해 가바지 실험 전 제브라피시 치어의 건강 상태가 양호해야 합니다. 또 다른 중요한 요소는 가바지 바늘의 품질입니다. 프로토콜에서 가장 어려운 부분 중 하나는 날카롭고 거친 가장자리를 만들지 않고 적절한 위치에서 바늘을 절단하는 것입니다. 마이크로피펫 마이크로포지(micropipette microforge)를 사용하면 더 일관되게 바늘을 절단할 수 있으며, 바늘 끝을 화염 연마(fire-polish)하여 날카로운 가장자리를 없앨 수 있습니다. 필수적인 것은 아니지만, 마이크로포지로 제작된 바늘은 시술 중 치어가 손상되는 빈도를 줄여줍니다. 또한, 아가로스 몰드 없이 3% 메틸셀룰로스(methylcellulose)에 고정하여 마이크로가바지를 수행할 수 있습니다. 하지만 몰드를 사용하면 물고기를 적절...

<table><tbody><tr><td>Finquel (Tricaine methanesulfonate)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>유충 마취</td></tr><tr><td>페놀 레드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>DPBS 내 0.5%, 세포 배양 테스트 완료</td></tr><tr><td>미네랄 오일, 라이트, 화이트 (고순도)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>바늘 역충전 및 부피 테스트용</td></tr><tr><td>TxRed-Dextran, 10,000 MW, 라이신 고정 가능</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>1x PBS/페놀 레드 내 1% 현탁액</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>물에 용해된 5 mM 스탁 용액</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>외경 1.14 mm, 내경 0.53 mm, 길이 3.5 in</td></tr><tr><td>몰드 제작용 플라스틱 틀</td><td>적응형 과학 도구</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 미세주입 장치</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>화염식 Brown 마이크로피펫 풀러, 3.0 mm 넓이 홈 필라멘트</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>바늘 제작</td></tr><tr><td>Student Dumont #5 핀셋</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0.1 x 0.06 mm, 니들 클리핑</td></tr><tr><td>접안마이크로미터, 5 mm - 100등분</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>바늘 절단</td></tr><tr><td>마이크로포지(Microforge)</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>바늘 절단 및 화염 연마</td></tr><tr><td>투베르쿨린 SlipTip 시린지 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, 25G 5/8-바늘</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG 미세구체 (2.0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>장 운동성 분석</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>강제 투여법 (Gavage procedure)</td></tr><tr><td>형광 실체 현미경</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>덱스트란 장벽 분석법</td></tr><tr><td>공초점 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>혈중 덱스트란의 영상화</td></tr></tbody></table>

zebrafish 애벌레의 microgavage

Microgavage of Zebrafish Larvae

제브라피시는 장 발달1-5, 생리학6-11, 질병12-16 및 호스트-미생물 상호작용17-25을 연구하기 위한 강력한 모델 생물로 부상했습니다. 장 생물학 연구를 위한 실험적 접근 방식은 종종 선택된 물질을 장 내강으로 in vivo 도입하는 것을 필요로 합니다. 제브라피시 치어 모델의 경우, 이는 일반적으로 물고기를 선택된 물질의 용액에 침지시키거나 복벽을 통해 주입함으로써 수행됩니다. 침지법을 사용하면 장으로 전달되는 물질의 경로 또는 타이밍을 정확하게 모니터링하거나 제어하기 어렵습니다. 이러한 이유로 침지 노출은 장 이외의 조직에 의도하지 않은 독성 및 기타 영향을 미칠 수 있으며, 이는 장으로 전달될 수 있는 물질 양의 잠재적 범위를 제한합니다. 또한, 침지 노출 동안 섭취되는 물질의 양은 개별 치어마다 크게 다를 수 있습니다26. 복벽을 통한 직접 주입 시에는 이러한 문제가 발생하지 않지만, 적절한 주입이 어렵고 조직 손상을 유발하여 실험 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피시 치어를 위한 마이크로 가바지(microgavage, 미세 강제 급이) 방법을 소개합니다. 이 방법의 목적은 제브라피시 치어의 전장 내강에 조절된 타이밍으로 물질을 직접 전달할 수 있는 안전하고 효과적이며 일관된 방법을 제공하는 것입니다. 마이크로 가바지는 제브라피시 연구를 수행하는 대부분의 실험실에서 흔히 사용하는 표준 배아 미세 주입 및 실체 현미경 장비를 활용합니다. 물고기를 메틸셀룰로오스에 적절히 배치하면, 가바지는 분당 약 7-10마리의 속도로 빠르게 수행될 수 있으며, 가바지 후 생존율은 투여 물질에 따라 100%에 육박합니다. 또한 우리는 마이크로 가바지를 통해 침지 노출 시 물고기에게 치명적인 고농도의 물질을 장 내강에 적재할 수 있음을 보여줍니다. 이 방법의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 장 내강에서 장 외 공간으로의 이동을 정량화하는 데 사용할 수 있는 형광 덱스트란 마이크로 가바지 분석법을 제시합니다. 이 테스트는 마이크로 가바지 절차의 적절한 수행 여부를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 다양한 실험 조건(예: 유전자 조작, 약물 처리 또는 환경 요인 노출) 하에서 장 상피 장벽의 무결성을 조사하는 새로운 제브라피시 분석법을 제공합니다. 나아가, 형광 미세구체를 가바지하고 이후의 이동을 모니터링함으로써 장 운동성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 마이크로 가바지는 살아있는 미생물, 분비된 미생물 인자/독소, 약물 및 생리학적 프로브와 같은 다양한 물질을 전달하는 데 적용될 수 있습니다. 이러한 기능을 통해 제브라피시 치어 마이크로 가바지 방법은 제브라피시 모델 시스템을 사용하는 광범위한 연구 분야를 발전시킬 잠재력을 가지고 있습니다.

강제 경구 투여(gavage)가 적절하게 수행되면, 투여된 물질은 식도에 잔류물이 거의 또는 전혀 없이 전장(anterior intestine) 내에 완전히 포함되어야 합니다(그림 3). 투여량은 전구(anterior bulb) 내에 수용 가능하며 배설강이나 식도로 누출되지 않는 부피로 선택해야 합니다. 투여 물질의 부피나 투여 압력이 너무 높으면, 강제 경구 투여의 물리적인 힘으로 인해 상피 세포가 손상되거나 누출이 발생할 수 있습니다. 또한, 이는 루멘 환경의 다른 성분(예: 담즙 또는 점액)을 밀어내거나 변화시켜 국소 생화학적 환경을 바꾸고 잠재적으로 결과에 혼선을 줄 수 있습니다. 일반적으로 물질 투여 후 바늘을 빠르게 회수하면 식도 괄약근이 닫혀 식도로의 상당한 누출을 방지할 수 있습니다.
이 존대법(gavage) 방법은 침지법(immersion method)에 비해 제브라피쉬 치어 조직으로의 물질 노출 시점과 경로를 더 정...

본 연구에서는 표준 배아 미세주입 및 실체현미경 장비를 활용한 제브라피쉬 치어의 새로운 미세강제투여(microgavage) 방법을 제시합니다. 우리는 미세강제투여가 다양한 물질을 제브라피쉬 치어의 장관 내로 정밀하게 정량 투여하는 데 유용한 안전하고 효율적인 기술임을 입증합니다.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

제브라피시는 장 발달1-5, 생리학6-11, 질병12-16 및 숙주-미생물...을 연구하기 위한 강력한 모델 생물로 부상했습니다.

본 절차의 전체적인 목적은 제브라피시 유충의 장관 내로 물질을 경구 투여하는 것입니다. 먼저, 유충을 마취시킨 후 메틸 셀룰로스가 도포된 주입용 몰드 위에 배치합니다. 그 다음, 유충을 몰드에 조심스럽게 담그고 가바지 바늘(gavage needle) 및 마이크로 매니퓰레이터의 각도에 맞춰 정렬합니다.그 다음 바늘을 유충의 입에 삽입하여 장구(intestinal bulb)까지 이동시킵니다. 적절한 위치에 도달하면 물질을 강내(lumen)로 주입합니다. 마지막 단계로 메틸 셀룰로오스에서 유충을 꺼내어 마취에서 회복할 수 있도록 신선한 배지에 옮깁니다.궁극적으로, 이 방법은 제브라피시 치어의 장관 내로 물질을 특이적으로 전달하는 데 사용될 수 있으며, 이를 통해 장 내 또는 장외 조직에서의 이동을 연구할 수 있습니다. 관심 물질이 포함된 물에 침지시키는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 동물에게 전달되는 물질의 양뿐만 아니라 투여 시점과 용량을 엄격하게 제어할 수 있다는 점입니다. 이는 실험적 변동성을 줄여주며, 일부 경우에는 특정 물질과 관련된 독성을 감소시킵니다.우리는 현미경으로 장 상피에서 검출 가능한 수준으로 형광 프로브를 충분히 적용하는 데 어려움을 겪었을 때 처음으로 이 방법의 아이디어를 얻었습니다. 고농도의 프로브는 때때로 물고사를 유발하며, 그럼에도 불구하고 이미징에 필요한 충분한 형광 신호를 생성하지 못하는 경우가 있습니다. 우선, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 가바지 바늘(gavage needles) 여러 개를 뽑아내고 실리카 유리 모세관을 준비하십시오.실체 현미경으로 이동하여 바늘을 절단합니다. 먼저, 투명 자 또는 그래픽지의 끝단에 바늘 끝을 맞춥니다. 정렬이 되면, 미세 팁 시계 수리용 핀셋을 사용하여 바늘 끝에서 약 1mm 떨어진 지점을 절단합니다.100배 배율로 바늘 끝을 검사하십시오. 바늘의 직경은 약 27에서 30 µm여야 하며 끝이 뭉툭해야 합니다. 일관된 결과를 얻기 위해 끝이 날카롭거나 들쭉날쭉한 바늘은 피해야 합니다.마이크로 포지를 사용하여 바늘의 팁 끝부분을 더 정밀하게 제어하고 바늘을 화염 연마할 수 있습니다. 날카로운 모서리를 제거하기 위한 팁입니다. 다음으로, 가바지 용액을 준비합니다.대부분의 응용 분야에서는 마이크로 인젝터의 가시성을 높이고 가바지(gavage) 용액의 배치 상태를 확인하기 위해 페놀 레드(phenol red)를 첨가합니다. 미네랄 오일을

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 morpholino 또는 mRNA가 감소 또는 후속 개발 중에 특정 유전자 제품의 수준을 높일 수있는 한 세포 단계에서 zebrafish 배아에 주입 수있는 방법을 보여줍니다.

유전자 기능을 분석 Zebrafish 배아들 중 Microinjection

출처: Li, J. 외.  클로스트리디오이데스 디피실에 대한 유충 얼룩말고기 감염 모델 개발. J. Vis. Exp. (2020).이 영상은 마취된 제브라피시 유충을 아가로스에 고정시키고 추적자 유도 바늘을 이용해 병원성 박테리아를 경구 주입하는 마이크로가비지 시술을 시연합니다. 비침습적 전달은 자연 감염을 모방하여 박테리아 복제, 독소 방출, 장 상피 손상 분석을 가능하게 합니다.

마이크로가비지를 이용한 제브라피시 유충 감염 모델 개발

동물 모델로 제브라 피쉬의 사용 증가 화합물 및 솔루션의 알려진 양의 전달을위한 효과적인 방법의 개발이 필요합니다. 아래에 설명 된 위관 절차는 성인 zebrafish의를 안전하고 효율적으로, 안정적으로 솔루션 정확한 양의 경구 제공 할 수 있습니다.

성인 Zebrafish의를 Gavaging

제브라피쉬는 유전 및 발달 연구를 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 비드 이식은 국소 세포 환경에 변화를 일으켜 발달 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 귀중한 조직 조작 기술입니다. 이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 마이크로비드 이식을 수행하는 방법을 설명합니다.

Zebrafish의 배아에 주입 마이크로 비드

개별 세포에 지시된 스트레스나 사멸을 일으키는 표적 조작은 상대적으로 수행하기가 어려웠습니다. 여기에서는 세포 배양 및 살아있는 동물에서 개별 세포에 선택적으로 스트레스를 가하고 죽이는 단일 세포 해상도 절제 접근법을 표준 컨포칼 UV 레이저를 기반으로 설명합니다.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

여기서 우리는 제브라 피쉬 섹스의 분화 및 유지 보수의 조사를 용이하게 애벌레 제브라 피쉬의 성선 조직을 분리하기위한 프로토콜을 제시한다.

애벌레 Zebrafish의 생식소 조직의 해부

레이저 절제는 생물학적 시스템의 재생을 연구하는 데 널리 적용되는 기술입니다. 제시된 프로토콜은 제브라피시 측면에서 신경마비 세포를 재생시키는 레이저 절제 및 후속 시간 경과 화상 진찰을 위한 표준 레이저 스캐닝 공초점 현미경의 사용을 설명합니다.

제브라피시 간 신경종 세포의 공초점 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석

광학 선명도는 제브라 피쉬의 세포 생물학적 및 생리 학적 작업에 대한 주요 이점입니다. 골격근 및 이웃 조직의 성장이 전신 성장과 어떻게 통합되는지에 대한 새로운 통찰력을 허용하는 개별 동물의 세포 성장 측정을위한 강력한 방법이 설명됩니다.

변경된 전기적 활동을 받은 개별 살아있는 제브라피쉬의 골격근 성장에 대한 실시간 및 반복 측정

이 프로토콜은 결과적인 신경 염증 반응과 신경 독성을 연구하기 위해 제브라 피쉬 애벌레 모델에서 뇌실 영역에 지질 다당류를 미세 주입하는 것을 보여줍니다.

신경 염증 및 신경 독성을 평가하기 위해 유충 제브라피쉬에 지질 다당류의 뇌실 미세 주입

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

이 프로토콜은 수정 후 3-7일 후에 제브라피시 유충에 대한 약물 스크리닝 절차와 형태학적 평가를 설명합니다.

초기 단계 제브라피시 유충의 소분자 스크리닝 및 독성 테스트

학습하세요 제브라피시 애벌레의 마이크로게이비지 기법을 통해 장관 내 물질 정밀 투여 방법을. 메틸셀룰로오스 고정과 미세조작을 활용한 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

Zebrafish 애벌레의 Microgavage

더 많은 동영상 탐색